喬 君， 宮登科， 劉格爾， 陳玲嫣， 伍圓明，詹 依， 郭 勇， 孟祥宇， 王小元*,2,

（1.食品科學(xué)與資源挖掘全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 國(guó)際食品安全聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 江蘇 無(wú)錫 214122）

大腸桿菌生物膜由多糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、胞外DNA、蛋白質(zhì)等組成[1-4]。 生物膜在維持結(jié)構(gòu)完整性和剛性[5-7]、保護(hù)菌株免受不利環(huán)境影響[8-11]以及促進(jìn)細(xì)菌和宿主細(xì)胞[12-13]之間的相互作用等方面至關(guān)重要。 但是，一些生物生物膜組分可對(duì)工業(yè)生產(chǎn)造成潛在的不利影響。 例如在食品工業(yè)中，生物膜會(huì)增加產(chǎn)品變質(zhì)或被病原微生物群污染的風(fēng)險(xiǎn)[14]；在醫(yī)療領(lǐng)域，植入物或針管上的生物膜會(huì)引起患者嚴(yán)重感染[15]。此外，含有生物膜的病原菌會(huì)導(dǎo)致抗生素耐藥，形成休眠細(xì)胞，增加治愈難度和感染風(fēng)險(xiǎn)[16]。 對(duì)于工業(yè)發(fā)酵行業(yè)而言，生物膜的形成會(huì)消耗一定的底物和能源，而這些底物和能源本可以更好地促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。 其次，生物膜會(huì)阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，導(dǎo)致菌體營(yíng)養(yǎng)受限或生長(zhǎng)緩慢。 最后，生物膜可介導(dǎo)生物污垢的形成，從而減少設(shè)備傳熱，增加腐蝕，縮短發(fā)酵設(shè)備的使用壽命[17-19]。

菌毛、鞭毛和卷曲纖維是存在于細(xì)胞表面的大分子蛋白質(zhì)附屬物，菌毛在生物膜的形成、附著、侵襲和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等方面發(fā)揮著重要的作用[20-21]。 卷曲纖維也介導(dǎo)細(xì)胞間黏附和侵襲，促使菌落在宿主體內(nèi)定植，增加致病風(fēng)險(xiǎn)[7]。 卷曲纖維由csGBAgDEFG操縱子編碼合成[13，22-23]。鞭毛是另外一種存在于大腸桿菌生物膜上的大分子蛋白質(zhì)附屬物，在生物膜的合成、運(yùn)動(dòng)性和趨化性中發(fā)揮作用[24]。鞭毛的合成和組裝由4 個(gè)基因簇，共50 個(gè)基因的參與[25-27]，分別為flhEABcheZYBRtaptarcheWAmotBCflhCD、 fliYZACD ST、fliEFGHIJKLMNOPQR、flgNMQBCDEFGHIJKL。

大腸桿菌的非必需生物膜組分中，除含有上述蛋白質(zhì)類附屬物外，還包含大量不同種類的胞外多糖。 纖維素是自然界中發(fā)現(xiàn)的最豐富的有機(jī)聚合物，細(xì)菌通常產(chǎn)生纖維素作為細(xì)胞外成分，用于機(jī)械和化學(xué)保護(hù)， 細(xì)菌纖維素由9 個(gè)基因編碼合成bcsGFEyhjRQbcsABZC 。 唾液酸是單體以獨(dú)特的α-（2，8）和（或）α-（2，9）鍵連接的直鏈聚合物，具有促進(jìn)嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的作用。 唾液酸由6 個(gè)基因簇編碼合成nanRATEKyhcH。 克拉酸又稱M-抗原，是由腸道細(xì)菌產(chǎn)生的具有高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的L-巖藻糖（約30%）的胞外多糖。 據(jù)報(bào)道，由腸道微生物產(chǎn)生的克拉酸可以延長(zhǎng)宿主的壽命，具有延緩衰老的作用[28-31]，克拉酸在食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。 脂多糖是微生物產(chǎn)生的強(qiáng)力毒素，由類脂A、核心多糖和O-抗原組成[32-34]。 在大腸桿菌中，類脂A 是必需組分，核心多糖和O-抗原是非必需生物膜組分， 去除核心多糖和O-抗原能夠起到減毒效果。 核心多糖由14 個(gè)基因參與合成waaDFCQGPSBORYZUL[34]。 O-抗原由11 個(gè)基因參與合成操縱子rfbBDACXglfwbbHIJKL[35]。 腸桿菌共同抗原（ECA）位于許多腸致病菌外膜，是一種由3個(gè)氨基糖重復(fù)單元組成的碳水化合物抗原[33]。 4 型莢膜是大腸桿菌的表面保護(hù)組分，可偶聯(lián)于膜蛋白質(zhì)表面，為菌體提供物理、化學(xué)壓力保護(hù)，在菌體與環(huán)境間的相互作用中發(fā)揮重要作用。 4 型莢膜主要由7 個(gè)基因簇合成ymcDCBAyccZetpyccC[36-37]。 聚-β-1，6-N-乙酰葡萄糖胺是一種新發(fā)現(xiàn)的胞外多糖，是主要的生物膜黏附素，對(duì)生物膜的產(chǎn)生及維持其完整性起著重要作用。 聚-β-1，6-N-乙酰葡萄糖胺由4 個(gè)基因編碼合成pgaABCD[38]。

聚羥基丁酸酯（PHB）是微生物為儲(chǔ)存過(guò)量碳合成的生物大分子，其在細(xì)胞內(nèi)形成不溶的球形內(nèi)含物或顆粒[39-41]。 PHB 具有生物降解性、生物相容性、壓電性等性質(zhì)，在生物降解塑料、組織工程支架等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[42-43]。

為考察去除大腸桿菌非必需生物膜組分對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成效率造成的影響，作者首先篩選出大腸桿菌MG1655 中非必需生物膜組分，再采用Crispr-Cas9 基因編輯技術(shù)敲除MG1655 基因組中各生物膜組分的合成基因簇，構(gòu)建了缺失不同生物膜組分的突變菌株，并考察其生長(zhǎng)和表型變化。 鑒于微生物具有儲(chǔ)存過(guò)量碳合成PHB 的特性，作者以含有PHB 合成關(guān)鍵基因的質(zhì)粒pBHR68 為探針，考察去除大腸桿菌的非必需生物膜組分能否節(jié)約底物和能源。 作者所在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)去除大腸桿菌菌毛和ECA 可以有效減少碳源消耗，提高細(xì)菌生長(zhǎng)速度， 并顯著提高PHA 和L-蘇氨酸產(chǎn)量。 因此，作者進(jìn)一步對(duì)大腸桿菌MG1655 中其他非必需生物膜組分進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑卡那霉素、氨芐西林、壯觀霉素、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）：西格瑪-奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；DNA 聚合酶：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和基因組提取試劑盒： 上海生工生物工程有限公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和凝膠純化試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；其他均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備PCR 儀（ETC-811）：廣州東盛生物科技有限公司；核酸蛋白質(zhì)定量?jī)x（Nanodrop 2000）：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；紫外分光光度計(jì)（UV-1800PC）：上海美譜達(dá)股份有限公司；水平核酸電泳儀（DYCP-31DN）：北京六一股份有限公司；電轉(zhuǎn)儀（Micro Pulser）：美國(guó)伯樂(lè)股份有限公司；酶標(biāo)儀（Cytation 5）：美國(guó)伯騰股份有限公司；熒光分光光度計(jì)（Hitachi）：日本日立公司。

1.2 菌株、質(zhì)粒和引物

本研究所用菌株、質(zhì)粒及其遺傳特性見(jiàn)表1。所用引物序列見(jiàn)表2， 引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 本實(shí)驗(yàn)中所用菌株、質(zhì)粒及特性Table 1 Strains and plasmids used in this study and their characteristics

表2 本實(shí)驗(yàn)中用到的引物Table 2 All primers used in this study

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.3.1 培養(yǎng)基 在LB 培養(yǎng)基、M9 培養(yǎng)基和PHB發(fā)酵培養(yǎng)基中加入卡那霉素（50 mg/L）、 壯觀霉素（50 mg/L）或氨芐青霉素（100 mg/L），維持篩選壓力。

1.3.2 培養(yǎng)條件PHB 發(fā)酵條件參見(jiàn)文獻(xiàn)[44]。

1.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

活化的大腸桿菌菌株分別接入LB 和M9 培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)，每隔2 h 取樣測(cè)定OD600，直至OD600基本穩(wěn)定。

1.5 質(zhì)粒、突變株和PHB 生產(chǎn)菌株的構(gòu)建

1.5.1 質(zhì)粒的構(gòu)建基因敲除中以pTargetF 為模板構(gòu)建pTargetF013-025 系列質(zhì)粒。 以pTargetF013 為例， 使用引物TF-013-F/TF-013-R 反向PCR 擴(kuò)增獲得質(zhì)粒片段，再用凝膠純化試劑盒純化。 純化后的質(zhì)粒片段用T4 DNA 連接酶連接，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌Turbo 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃復(fù)蘇1 h 后涂布?jí)延^霉素抗性平板，用T-013-F/T-R 引物篩選菌落并測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒正確性。 其他敲除質(zhì)粒采用相同的方法和對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒構(gòu)建。

1.5.2 突變菌株的構(gòu)建采用Crispr-Cas9 雙質(zhì)粒無(wú)痕基因編輯技術(shù)敲除大腸桿菌MG1655 基因組中的相關(guān)基因簇，該方法需要包含pTargetF 系列質(zhì)粒和供體DNA。 pTargetF 系列質(zhì)粒構(gòu)建如1.5.1 所述， 供體DNA 的獲得以WQM013 的構(gòu)建為例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。 以大腸桿菌MG1655 基因組為模板，分別用引物對(duì)F1-013/R1-013 和F2-013/R2-013 擴(kuò)增獲得上下游同源臂片段。獲得的產(chǎn)物經(jīng)DNA 純化回收試劑盒純化后， 以該上下游同源臂片段為模板，用引物F1-013/R2-013 重疊PCR，再利用DNA純化回收試劑盒純化后，即得到供體DNA。 將供體DNA（400 ng）和pTargetF013（100 ng）混合后電轉(zhuǎn)入MG1655/pCas 感受態(tài)細(xì)胞中。 復(fù)蘇后涂布于含有卡那霉素和壯觀霉素的平板，在30 ℃下培養(yǎng)48 h，用引物F1-013/R2-013 挑選突變株，并測(cè)序驗(yàn)證其正確性。 其他突變株使用相同的方法構(gòu)建。

1.5.3 PHB 生產(chǎn)菌株的構(gòu)建將攜帶基因PHB 合成關(guān)鍵基因phaCAB 的pBHR68 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到野生型MG1655 和 突 變 株 WQM013 -020、WQM022G、WQM023-025 中，用引物T-PHB-F 和T-PHB-R 驗(yàn)證正確性。

1.6 鏡檢及膜通透性

1.6.1 結(jié)晶紫染色大腸桿菌細(xì)胞固定后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%結(jié)晶紫靜置30 s，無(wú)菌水沖洗后晾干，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.6.2 胞外多糖染色采用單寧媒染染色法進(jìn)行胞外多糖染色[29]。大腸桿菌細(xì)胞在LB 和M9 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h， 挑取單菌落并固定在載玻片上，加入品紅溶液（0.3 mL 品紅堿、90 mL 體積分?jǐn)?shù)5%苯酚、10 mL 體積分?jǐn)?shù)95%乙醇）染色3 min，無(wú)菌水沖洗后加媒染液（2 g/L 硫酸鋁鉀飽和溶液、0.3 g/L FeCl3、1.5 g/L 單寧體積比為5∶2∶3）染色3 h，無(wú)菌水沖洗后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%亞甲藍(lán)處理30 s， 無(wú)菌水沖洗晾干后在油鏡下觀察樣品。

1.6.3 膜通透性檢測(cè)膜通透性評(píng)價(jià)采用N-苯基-α-萘胺（NPN）法[29，32]。 細(xì)胞培養(yǎng)12 h 后，收集菌體并洗滌2 次， 菌體重懸于1.92 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）中。 細(xì)胞懸液中加入1 mmol/L NPN，使菌體濃度OD600為0.5，然后用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度（激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為350 nm 和420 nm）。

1.7 PHB 定量分析

使用尼羅紅染色法對(duì)產(chǎn)PHB 菌株進(jìn)行高通量篩選，PHB 發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體，加入TSE 蔗糖緩沖液 （10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.5，20 g/dL 蔗糖溶液，2.5 mmol/L Na-EDTA 溶液）， 使其OD600為0.4，冰上孵育10 min，離心收集菌體，用1 mmol/L氯化鎂溶液重懸至相同菌體濃度。 將3 μL 尼羅紅溶液（1 mg/mL DMSO 溶解）添加到1 mL 細(xì)胞懸液中，混勻后在37 ℃避光孵育30 min，立即用酶標(biāo)儀在37 ℃下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為565 nm。

1.8 基因轉(zhuǎn)錄分析

全轉(zhuǎn)錄組分析按已報(bào)道的方法執(zhí)行[29]。 大腸桿菌MG1655 和WQM018 分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，4℃、12 000 r/min 收集菌體， 磷酸緩沖液洗滌2 次后用液氮速凍。 大腸桿菌MG1655 基因組用于序列讀取、比對(duì)和分析。RNA 文庫(kù)的提取、構(gòu)建和測(cè)序委托蘇州金唯智生物技術(shù)公司操作。 原始轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)已上傳到NCBI Sequence Read Archive 數(shù)據(jù)庫(kù)（SRA），項(xiàng)目序號(hào)為PRJNA603230。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌非必需生物膜組分篩選及突變株的構(gòu)建

為了考察去除非必需生物膜組分對(duì)菌株生長(zhǎng)和表型產(chǎn)生的影響，作者選擇大腸桿菌MG1655 模式菌株為研究對(duì)象。 首先查閱比對(duì)大腸桿菌MG1655 基因組， 篩選出非必需生物膜組分11 個(gè)，分別是：菌毛、鞭毛、卷曲纖維、核心多糖、O-抗原、克拉酸、腸桿菌共同抗原、4 型莢膜、纖維素、唾液酸和聚-β-1，6-N-乙酰葡萄糖胺。 其中，菌毛、鞭毛和卷曲纖維屬于大分子蛋白質(zhì)聚合物類，其他8 種屬于胞外多糖類。 前期研究發(fā)現(xiàn)，去除大腸桿菌菌毛和ECA 可以促進(jìn)菌株生長(zhǎng)并提高生產(chǎn)效率[44]。 因此，作者分別敲除鞭毛、卷曲纖維、核心多糖、O-抗原、克拉酸、4 型莢膜、纖維素、唾液酸和聚-β-1，6-N-乙酰葡萄糖胺的11 個(gè)操縱子， 構(gòu)建出突變株WQM013、WQM014、WQM015、WQM016、WQM017、WQM018、WQM019、WQM020、WQM022G、WQM023、WQM024 和WQM025，見(jiàn)圖1。

圖1 大腸桿菌MG1655 的非必需生物膜組分Fig.1 Non-essential biofilm components in E.coli MG1655

2.2 非必須生物膜組分缺失突變株的生長(zhǎng)改變

11 個(gè)突變菌株分別在富營(yíng)養(yǎng)的LB 培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)缺乏的M9 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。 在LB 培 養(yǎng) 基 中，WQM018、WQM019、WQM020 和WQM023 的生長(zhǎng)速度和生物量不及對(duì)照菌株MG1655，涉及的組分為核心多糖、O-抗原、克拉酸和纖維素， 說(shuō)明這4 種組分對(duì)菌株的生長(zhǎng)至關(guān)重要，去除它們可能會(huì)造成生物膜變薄或破損，對(duì)菌株產(chǎn)生不利影響。 其他突變株的生長(zhǎng)與對(duì)照菌株相當(dāng)，這可能是由于LB 培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)比較豐富，不能明顯體現(xiàn)出去除生物膜組分可節(jié)約能源和底物及對(duì)菌株的促進(jìn)效果。 在M9 培養(yǎng)基中，WQM013、WQM014、WQM016 和WQM024 生長(zhǎng)速度和生物量明顯優(yōu)于對(duì)照菌株，涉及組分鞭毛和唾液酸，這可能是由于M9 培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）營(yíng)養(yǎng)匱乏，細(xì)菌需要通過(guò)自身先合成必需氨基酸或其他關(guān)鍵物質(zhì)用于鞭毛或唾液酸合成， 而去除鞭毛或唾液酸后，細(xì)胞可以節(jié)約底物和能源用于生長(zhǎng)。

圖2 突變株在LB 和M9 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of mutants cultured in LB and M9 medium

2.3 缺失大腸桿菌非必需生物膜組分對(duì)膜通透性的影響

大腸桿菌非必需生物膜組分位于細(xì)胞外膜和周質(zhì)空間， 它們的缺失會(huì)導(dǎo)致生物膜厚度的改變，進(jìn)而改變膜通透性。 有研究表明，敲除ECA 相關(guān)基因后，大腸桿菌膜通透性顯著提高[44]。 如圖3 所示，突 變 株 WQM013、WQM014、WQM015、WQM016、WQM018、WQM020 和WQM024 通透性增加， 尤其突變株WQM018 膜通透性比對(duì)照株提高了近40%。而WQM013、WQM014、WQM015 和WQM016 均 屬于鞭毛缺失突變株，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以考察4 個(gè)鞭毛基因簇全部敲除后膜通透性的變化。 此外，敲除克拉酸和唾液酸基因簇也能顯著增加膜通透性，這會(huì)更有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及發(fā)酵產(chǎn)物的外排，減少致病菌的耐藥性和致病風(fēng)險(xiǎn)。

圖3 大腸桿菌非必需生物膜組分缺失突變株的膜通透性Fig.3 Membrane permeability of E.coli mutants lacking non-essential biofilm components

2.4 大腸桿菌非必需生物膜組分缺失對(duì)PHB 合成的影響

將含有PHB 合成關(guān)鍵基因phaCAB 的pBHR68質(zhì)粒分別導(dǎo)入對(duì)照菌株MG1655 和各突變株，構(gòu)建了重組菌株MG1655/pBHR68、WQM013-020/pBHR68、WQM022G/pBHR68、WQM023-025/pBHR68。如圖4 所示， 所有含有pBSK 空載質(zhì)粒的菌株不能合成PHB，當(dāng)轉(zhuǎn)入PHB 合成質(zhì)粒后，PHB 產(chǎn)量明顯增加。 所有突變株在LBG 培養(yǎng)基中PHB 的產(chǎn)量與對(duì)照菌株相當(dāng)，產(chǎn)量較低。在M9G 培養(yǎng)基中，WQM015/pBHR68、WQM018/pBHR68、WQM019/pBHR68、WQM020/pBHR68、WQM022G/pBHR68、WQM023/pBHR68、WQM024/pBHR6-8、WQM025/pBHR68 的PHB 產(chǎn)量較野生型有所提高， 其中WQM018/pBHR68 的PHB 產(chǎn)量最高， 比對(duì)照菌株提高了35.32%。通過(guò)顯微鏡觀察，可以看到突變株WQM015/pBHR68、WQM018/pBHR68、WQM019/pBHR68、WQM020/pBHR68、WQM022G/pBHR68、WQM023/pBHR68、WQM024/pBHR68、WQM025/pBHR68 菌體變長(zhǎng)變粗， 胞內(nèi)產(chǎn)生白色PHB 顆粒， 而對(duì)照菌株MG1655/pBHR68 為肉眼不可見(jiàn)白色PHB 顆粒，見(jiàn)圖5。 此外，8 個(gè)產(chǎn)PHB 突變株中， 除W-QM015/pBHR68 為鞭毛突變株外， 其他均為胞外多糖突變株。 初步判定去除核心多糖、O-抗原、克拉酸、4 型莢膜、纖維素、唾液酸和聚-β-1，6-葡萄萄糖胺后，可以節(jié)約能源和底物，用于PHB 合成。

圖4 含有PHB 生產(chǎn)質(zhì)粒的突變株產(chǎn)PHB 能力分析Fig.4 Analysis of PHB production ability of mutants containing PHB-producing plasmid

圖5 鏡檢觀察M9G 培養(yǎng)基中的PHB 合成菌株Fig.5 Microscopic observation of PHB-producing strains in M9G medium

2.5 核心多糖缺失對(duì)克拉酸合成的影響

作者在構(gòu)建非必需生物膜組分缺失的突變株時(shí)，發(fā)現(xiàn)敲除核心多糖的WQM018 突變株在平板上能長(zhǎng)出黏液狀菌落。 進(jìn)一步對(duì)其產(chǎn)生條件和種類進(jìn)行初步分析發(fā)現(xiàn)， 對(duì)照株MG1655 在37 ℃培養(yǎng)時(shí)，無(wú)論是在LB 還是M9 培養(yǎng)基培養(yǎng)都不產(chǎn)生黏液狀菌落，胞外多糖染色視野中看不到媒染的藍(lán)色胞外多糖；而WQM018 在M9 培養(yǎng)基中，菌落略顯黏稠，鏡檢視野有少量藍(lán)色媒染的胞外多糖。 在30 ℃培養(yǎng)時(shí)，MG1655 在M9 平板上的菌落略顯黏稠，染色后視野微藍(lán)， 而WQM018 在LB 和M9 培養(yǎng)基中均能長(zhǎng)出明顯的黏液狀菌落，鏡檢視野中含有大量的媒染的藍(lán)色胞外多糖，見(jiàn)圖6。

圖6 MG1655 和WQM018 產(chǎn)胞外多糖觀察Fig.6 Observation of exopolysaccharides produced by MG1655 and WQM018

從鏡檢圖片可以看出，WQM018 產(chǎn)生了大量的胞外多糖。為推斷所產(chǎn)胞外多糖的種類，以MG1655為對(duì)照，對(duì)WQM018 的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行考察。 從圖7可以看出，所有與克拉酸合成和組裝相關(guān)的基因大幅上調(diào)， 推斷WQM018 產(chǎn)生的胞外多糖為克拉酸，這與文獻(xiàn)報(bào)道的截短核心多糖促進(jìn)克拉酸合成相符[29]。此外，卷曲纖維及菌毛合成的相關(guān)基因顯著下調(diào)，見(jiàn)圖8。 結(jié)合WQM018 的膜通透性明顯增強(qiáng)的結(jié)果， 推測(cè)促進(jìn)克拉酸合成的原因?yàn)椋?大腸桿菌MG1655 去除核心多糖后，突變株WQM018 膜通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致WQM018 合成大量的克拉酸以維持適當(dāng)?shù)陌麅?nèi)滲透壓。 胞外大量克拉酸的積累和分泌又導(dǎo)致了菌毛及卷曲纖維合成的減少。 至于為何產(chǎn)生克拉酸維持滲透壓， 不是其他種類的胞外多糖，還需深入研究。

圖7 WQM018 中克拉酸合成基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.7 Transcriptional levels of genes related to colanicacid biosynthesis in WQM018

圖8 WQM018 中卷曲纖維和菌毛合成基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.8 Transcriptional levels of genes related to curl and fimbriae biosynthesis in WQM018

3 結(jié) 語(yǔ)

大腸桿菌因其具有清晰的遺傳背景和寬松的培養(yǎng)條件常被作為模式菌株，廣泛應(yīng)用于生物工程和工業(yè)微生物的研究中。 與此同時(shí)，大腸桿菌具有復(fù)雜且種類繁多的生物膜組分，這些組分在菌體趨化性、 抵御外界壓力和侵染等方面發(fā)揮著重要作用。 但是在發(fā)酵工業(yè)中，這些生物膜組分的合成和組裝需要耗費(fèi)大量的能源和底物，而且某些生物膜組分還存在巨大的安全隱患。

作者以提高菌株優(yōu)良性能并減少致病風(fēng)險(xiǎn)為出發(fā)點(diǎn)， 匯總了大腸桿菌生物膜的11 種非必需生物膜組分， 從基因水平分別去除這些生物膜組分，考察其生長(zhǎng)、膜通透性、節(jié)約碳源和重塑代謝等方面的變化。 整體而言，突變株在LB 培養(yǎng)基中表現(xiàn)出抑制生長(zhǎng)或變化不明顯。敲除鞭毛fliE-R、fliY-T 和flhE-D 基 因 簇， 構(gòu) 建 的WQM013、WQM014 和WQM016 在M9 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)優(yōu)于對(duì)照菌株。 敲除鞭毛基因簇flgN-L，構(gòu)建的突變株WQM015 生長(zhǎng)變差，但有利于PHB 合成。 分別敲除鞭毛的4 個(gè)基因簇后，通透性都得到增強(qiáng)，因此應(yīng)深入研究組合敲除鞭毛4 個(gè)基因簇的突變株。 去除胞外多糖類組分基本都能積累PHB 和增強(qiáng)菌株通透性，下一步應(yīng)構(gòu)建組合敲除菌株，進(jìn)一步增強(qiáng)膜通透性和提高PHB產(chǎn)量。 但是，在所用胞外多糖組分中，僅敲除4 型莢膜、唾液酸和聚-β-1，6-葡萄糖胺能促進(jìn)其在M9 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。 因此，應(yīng)重點(diǎn)考察這3 種組分缺失的突變株及鞭毛突變株，進(jìn)一步提高生長(zhǎng)性能。 其次，去除大腸桿菌核心多糖能重塑代謝調(diào)控，促進(jìn)克拉酸的生產(chǎn)。 這些結(jié)果為大腸桿菌非必需生物膜組分存在必要性的研究提供了理論依據(jù)，也為其他菌株的改造和發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量提高提供了新思路。