李 翔， 曹 宇， 唐湘華， 汪 旭,3， 倪 娟*

（1.云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 云南 昆明 650500；2.云南師范大學(xué) 生物能源持續(xù)開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500；3.臺州耶大基因與細(xì)胞治療研究中心，浙江 臺州 318000）

魔芋（konjac）是多年生天南星科草本植物的地下塊莖。 魔芋葡甘聚糖（konjac gluconnan，KGM）是魔芋塊莖中的水溶性膳食纖維，為一種高相對分子質(zhì)量非離子型雜多糖，具有水溶性、成膜性、持水性、膠黏性、增稠性、衍生性、配伍性等多重優(yōu)良特性和特殊的生物活性[1-3]。 KGM 具有降低膽固醇、預(yù)防高血壓、高血脂、糖尿病等多種生理功效[4-5]。

腸道是人體最大的消化和排泄器官[6]，腸黏膜上皮細(xì)胞通過相互連接，形成了一個完整的生物屏障（腸上皮細(xì)胞屏障），在維護腸道健康中發(fā)揮重要作用[7]。 基因組穩(wěn)定性是維護細(xì)胞生理穩(wěn)態(tài)的重要基礎(chǔ)，基因組穩(wěn)定性下降是眾多癌細(xì)胞的特征之一[8]。少量的基因組不穩(wěn)定性（genome instability，GIN）可誘發(fā)細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞將啟動相應(yīng)機制修復(fù)受損基因組；若細(xì)胞出現(xiàn)過高且不可逆的GIN 時，細(xì)胞的生存將受到威脅，通過各種死亡途徑被清除[9]。 在消化道中，若腸道細(xì)胞GIN 增加，腸道細(xì)胞將出現(xiàn)生存劣勢，進(jìn)而使腸道屏障功能發(fā)生異常，引發(fā)生化級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腸內(nèi)慢性炎癥及多種腸道疾病如炎癥性腸病、腸易激綜合征，以及一部分腸外慢性炎癥的發(fā)生。 若機體長期處于炎癥微環(huán)境中，DNA將會受到持續(xù)的氧化脅迫及炎癥因子的干擾，再次增加其損傷概率， 導(dǎo)致GIN 的發(fā)生頻率顯著增加，細(xì)胞程序性死亡過程終止，增大細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及形成腫瘤細(xì)胞的可能[10]。

許多研究表明，植物多糖能夠有效地抑制癌癥的發(fā)生發(fā)展[11]，植物多糖可通過調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡、干擾能量代謝、調(diào)控信號通路等生物學(xué)過程抑制或延緩癌細(xì)胞的增殖過程。 例如，蒲公英多糖在體內(nèi)可促進(jìn)P53 和Bax 的表達(dá)，并抑制Bcl-2 的表達(dá)，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抗乳腺癌作用[12]；綠茶中的茶多糖可以降低結(jié)腸癌細(xì)胞周期蛋白cyclin D1 的表達(dá)[13]，阻止腫瘤細(xì)胞由G1 期進(jìn)入S 期，使癌細(xì)胞的分裂及增殖受到干擾；Wu 等人用裙帶菜多糖處理乳腺癌MCF-7 細(xì)胞， 觀察到裙帶菜多糖可以阻滯細(xì)胞S 期[14]。已有研究表明，KGM對維護腸道屏障具有積極的生理效應(yīng)，能有效保護胃黏膜，清潔胃壁，還具有良好的腸道益生性[15-16]。流行病學(xué)實驗表明，KGM 對預(yù)防結(jié)腸癌具有一定的積極效應(yīng)[17-19]，其可能通過影響細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α 和IFN-γ 等的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用。作者研究了KGM 對不同類型腸道細(xì)胞的GIN 的影響，以及對不同類型細(xì)胞的生長狀況產(chǎn)生差異的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460、 人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620、HCT116 細(xì)胞：中國科學(xué)院細(xì)胞庫；二甲基亞砜：Biosharp 公司；細(xì)胞松弛素B（cytochalasin b，CB）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、青/鏈霉素溶液、L-谷氨酰胺、 新生牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基：Gibco 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）：美國Sigma 公司；臺盼蘭染液：Solarbio 公司；吉姆薩粉末：上海三思爾公司；KGM： 由作者所在生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

超凈工作臺SW-CJ-2FD 型： 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱MCO-15AC 型：日本三洋；細(xì)胞涂布離心機TXD3 型：湖南湘儀離心機儀器有限公司； 光學(xué)顯微鏡VANOX-S 型： 日本Olympus；酶標(biāo)儀SpectraMax iD3 型：美谷儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-50KBS 型：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

NCM460、SW620 及HCT116 細(xì) 胞 株 分 別 培 養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)10%新生牛血清、 體積分?jǐn)?shù)1%谷氨酰胺（L-glutamine，L-Glu）、體積分?jǐn)?shù)0.1%青霉素/鏈霉素溶液的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中， 并置于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，溫度為37 ℃，每2～3 d 更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿75%～90%瓶底面積時進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并傳代。

1.4 細(xì)胞活力檢測

1.4.1 KGM 儲備液配制稱取2.4 g KGM 溶于10 mL 蒸餾水中，配置成240 mg/mL 的儲備液。

1.4.2 加藥處理將NCM460、SW620 及HCT116細(xì)胞以每孔4×105個/mL 接種至細(xì)胞培養(yǎng)96 孔板中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后， 每孔加入預(yù)設(shè)質(zhì)量濃度（0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 mg/mL） 的KGM 分別處理24、48、72 h。

1.4.3 MTT 法檢測細(xì)胞活力經(jīng)加藥處理后，每孔加入四甲基噻唑藍(lán)（tetramethylthiazole blue，MTT）20 μL 繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后終止培養(yǎng)。 吸棄每孔液體，加入150 μL DMSO 后置搖床上緩慢搖勻10 min。待結(jié)晶物充分溶解后， 用酶標(biāo)儀在490 nm 波長處測定吸光度，繪制生長曲線[20]。

式中：I 為細(xì)胞存活率，%；OD實驗組為實驗組在490 nm 處吸光度；OD對照組為對照組在490 nm 處的吸光度。

1.5 胞質(zhì)阻斷分裂微核分析細(xì)胞組實驗 （CBMNCyt）

將NCM460、SW620 及HCT116 分 別 以3×105個/mL 接種到細(xì)胞培養(yǎng)6 孔板中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下培養(yǎng)， 待細(xì)胞貼壁后， 加入KGM（0、5、20、30 mg/mL），72 h 后棄含KGM 的培養(yǎng)基，用含有CB（終質(zhì)量濃度為3 μg/mL）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24～28 h 后收集細(xì)胞。 經(jīng)涂片、固定、染色、封片后，分別按計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計單核、雙核細(xì)胞中的微核、多核、核質(zhì)橋、核芽、凋亡等指標(biāo)，計算不同質(zhì)量濃度KGM 處理后3 種受試細(xì)胞的GIN、 核分裂指數(shù)（nuclear division index，NDI）和凋亡率，見圖1。

圖1 CBMN-Cyt 實驗中各種指標(biāo)的示意圖Fig.1 Representative images of various indicators in the CBMN-Cyt experiment

1.6 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 25.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，用one-way ANOVA 進(jìn)行組件比較， 所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；用GraphPad Prism 8.0.2 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 KGM 對結(jié)腸上皮細(xì)胞活力的影響

經(jīng)不同質(zhì)量濃度KGM 處理NCM460、SW620、HCT116 細(xì) 胞24、48、72 h 后，MTT 法 檢 測 細(xì) 胞 活力， 結(jié)果見圖2～4。 5～40 mg/mL 的KGM 處理24、48、72 h， 顯著提高了NCM460 細(xì)胞的活力 （P＜0.05）， 見圖2。 經(jīng)5～40 mg/mL KGM 處理24 h 后，SW620 和HCT116 細(xì)胞活力顯著提高（P＜0.05）；處理48 h 后，SW620 細(xì)胞活力無顯著變化（P＞0.05），HCT116 細(xì)胞在10～40 mg/mL 處理后細(xì)胞的活力顯著提高（P＜0.05）。 隨著處理時間和KGM 質(zhì)量濃度的增加，2 株癌細(xì)胞SW116 和SW620 的細(xì)胞活力顯著被抑制。 當(dāng)處理72 h 后，在KGM 質(zhì)量濃度達(dá)40 mg/mL 時，極顯著降低了2 株癌細(xì)胞的細(xì)胞活力并且致死率達(dá)54.5%和41.5%，表明KGM 可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，見圖3～4。 根據(jù)細(xì)胞活力數(shù)據(jù)顯示，將后續(xù)實驗的最高質(zhì)量濃度設(shè)置為HCT116 半致死質(zhì)量濃度的80%，即30 mg/mL，處理時間為72 h。

圖2 不同質(zhì)量濃度KGM 處理24、48、72 h 對NCM460 細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of KGM on the viability of NCM460 cells treated for 24，48 and 72 h

圖3 不同質(zhì)量濃度KGM 處理24、48、72 h 對SW620細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of different concentrations of KGM on the viability of SW620 cells treated for 24，48 and 72 h

圖4 不同質(zhì)量濃度KCM 處理24、48、72 h 對HCT116 細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effects of different concentrations of KGM on the viability of HCT116 cells treated for 24，48 and 72 h

2.2 KGM 對結(jié)腸上皮細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性及凋亡的影響

2.2.1 不同質(zhì)量濃度KGM 對NCM460 GIN、NDI 以及細(xì)胞凋亡發(fā)生頻率的影響CBMN-Cyt 實驗結(jié)果顯示，KGM 處理NCM460 細(xì)胞72 h 后，5～20 mg/mL的KGM 可極顯著降低其微核發(fā)生頻率 （P＜0.01），KGM 為20～30 mg/mL 時核質(zhì)橋發(fā)生頻率顯著上升（P＜0.05），核芽發(fā)生頻率無顯著變化，見圖5（a）；中低質(zhì)量濃度（5～20 mg/mL）的KGM 則降低了GIN 水平和細(xì)胞凋亡率，對正常腸道細(xì)胞的健康表現(xiàn)出維護效應(yīng)； 但高質(zhì)量濃度 （30 mg/mL） 的KGM 處理NCM460 細(xì)胞72 h 后其GIN 顯著升高，提示高質(zhì)量濃度KGM 會誘發(fā)正常結(jié)腸細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性，見圖5（b）。 這與郭偉等[21]的動物模型研究結(jié)果一致，即高質(zhì)量濃度KGM 不利于腸道健康；不同質(zhì)量濃度KGM 對細(xì)胞的NDI 發(fā)生頻率無顯著影響，見圖5（c）；隨著KGM 質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸降低，見圖5（d）。 30 mg/mL 的KGM 極顯著降低NCM460 的凋亡率（P＜0.001）。

圖5 不同質(zhì)量濃度KGM 處理72 h 對NCM460 細(xì)胞凋亡、NDI 和GIN 的影響Fig.5 Effects of different concentrations of KGM on apoptosis，NDI，and GIN of NCM460 cell treated for 72 h

2.2.2 不同質(zhì)量濃度KGM 對SW620 GIN、NDI 以及細(xì)胞凋亡發(fā)生頻率的影響KGM 處理72 h 后，質(zhì)量濃度為5～30 mg/mL 時極顯著增加了SW620 細(xì)胞微核、核芽的發(fā)生頻率（P＜0.001），核質(zhì)橋發(fā)生頻率無顯著變化，見圖6（a）；KGM 質(zhì)量濃度為5～30 mg/mL 時，GIN 發(fā)生頻率顯著增加 （P＜0.05）。KGM 在20～30 mg/mL 時，GIN 發(fā)生頻率增加極顯著（P＜0.001），見圖6（b）；NDI 發(fā)生頻率隨KGM 質(zhì)量濃度的增加呈極顯著降低趨勢，P＜0.001；KGM 在20～30 mg/mL 時細(xì)胞凋亡發(fā)生率極顯著增加 （圖6（d），P＜0.001）。

圖6 不同質(zhì)量濃度KGM 處理72 h 對SW620 細(xì)胞凋亡、NDI 和GIN 的影響Fig.6 Effects of different concentrations of KGM on apoptosis，NDI，and GIN of SW620 cell treated for 72 h

2.2.3 不同質(zhì)量濃度KGM 對HCT116 GIN、NDI 以及細(xì)胞凋亡發(fā)生頻率的影響處理72 h 后，質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的KGM 極顯著增加了HCT116 細(xì)胞微核發(fā)生頻率（P＜0.01），質(zhì)量濃度20 mg/mL 的KGM顯著增加其微核發(fā)生頻率（P＜0.05），見圖7（a）；KGM 質(zhì)量濃度在20 mg/mL 時核質(zhì)橋發(fā)生頻率極顯著增加（P＜0.05），KGM 質(zhì)量濃度在5、30 mg/mL 時核芽發(fā)生頻率極顯著增加（P＜0.05）；KGM 質(zhì)量濃度在5～30 mg/mL 時GIN 發(fā)生頻率極顯著增加（P＜0.001），見圖7（b）；KGM 質(zhì)量濃度在5 mg/mL 和30 mg/mL 時NDI 發(fā)生頻率顯著降低（P＜0.05），見圖7（c）； 在KGM 質(zhì)量濃度為5～30 mg/mL 時細(xì)胞凋亡發(fā)生率極顯著增加（P＜0.001），見圖7（d）。

圖7 不同質(zhì)量濃度KGM 處理72 h 對HCT116 細(xì)胞凋亡、NDI 和GIN 的影響Fig.7 Effects of different concentrations of KGM on apoptosis，NDI and GIN of HCT116 cell treated for 72 h

3 結(jié) 語

目前，已有研究證明KGM 對腸道健康有益，其作為一種優(yōu)質(zhì)的益生元， 可促進(jìn)腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌的生長[22-23]，可使受損的黏膜屏障功能恢復(fù)，起到調(diào)節(jié)腸道微生物群穩(wěn)態(tài)、抑制病原菌大量繁殖、增強腸道免疫的作用，對腸道疾病的緩解起到積極作用[24-25]。 本研究顯示，在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460 中，中低質(zhì)量濃度（5～20 mg/mL）的KGM 降低了GIN 水平和細(xì)胞凋亡率， 對正常腸道細(xì)胞的健康表現(xiàn)出維護效應(yīng)。 但高質(zhì)量濃度（30 mg/mL） 的KGM 處理NCM460 細(xì)胞72 h 后使其GIN 顯著升高，這與黃夏伶等研究結(jié)果一致[26]。在高劑量葡甘聚糖處理后的老年小鼠中，易見結(jié)腸炎性細(xì)胞聚集以及小腸完整結(jié)構(gòu)破壞，即高劑量的KGM造成腸道細(xì)胞生成劣勢，這可能是大多數(shù)腸道動力不足的老年人過量食用葡甘聚糖后排便困難的重要原因之一。質(zhì)量濃度為5～30 mg/mL 的KGM 能夠顯著誘發(fā)SW620 和HCT116 細(xì)胞高水平GIN，并降低2 株結(jié)腸癌細(xì)胞的NDI，使細(xì)胞凋亡率顯著升高。KGM 在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中表現(xiàn)出不同的效應(yīng)，即在正常細(xì)胞中可維護基因組穩(wěn)定性，而在癌細(xì)胞中則誘發(fā)基因組不穩(wěn)定性， 這可能是其維護腸道健康的分子基礎(chǔ)。 結(jié)果顯示， 高質(zhì)量濃度（30 mg/mL）的KGM 處理NCM460 細(xì)胞72 h 后可使其GIN 顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，這與目前對GIN 與細(xì)胞凋亡相互關(guān)系的研究結(jié)論存在差距。 其原因可能是細(xì)胞凋亡率與KGM 質(zhì)量濃度之間存在時間上的滯后，后期將適量增加KGM 的質(zhì)量濃度再次驗證。 本研究僅在離體條件下從基因組穩(wěn)定性水平考查了KGM 對不同病理狀態(tài)的腸上皮細(xì)胞的影響，對于其作用機理還有待從活體及分子水平更進(jìn)一步深入研究。