陳志華，鄭艷，林素勇,3，陳紹勤

0 引言

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，發(fā)病率仍然高居全球第三，死亡率居全球第二[1-3]。轉(zhuǎn)移是CRC患者療效不佳和高死亡率發(fā)生的重要因素[4-5]。CRC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中需要多種不同的表觀(guān)遺傳學(xué)機(jī)制驅(qū)動(dòng)[6]。類(lèi)泛素樣含PHD和環(huán)指域蛋白（ubiquitin-like PHD and ring finger domains,UHRF）1是一個(gè)多功能結(jié)構(gòu)域蛋白，能夠識(shí)別和修飾不同的染色質(zhì)，從而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，特別在表觀(guān)遺傳學(xué)修飾方面[7]。UHRF1通過(guò)運(yùn)用其特殊的結(jié)構(gòu)域來(lái)參與表觀(guān)遺傳標(biāo)記的傳遞[8-9]。UHRF1是一種已知的、負(fù)責(zé)維持細(xì)胞表觀(guān)遺傳的蛋白[10-11]，被認(rèn)為與細(xì)胞的快速增長(zhǎng)和DNA修復(fù)密切相關(guān)[12-13]。CRC中存在UHRF1過(guò)表達(dá)現(xiàn)象[14]，并與轉(zhuǎn)移和臨床分期緊密相關(guān)。UHRF1將可能成為一種獨(dú)立的生物標(biāo)志物運(yùn)用于腫瘤檢測(cè)、進(jìn)展和防治監(jiān)測(cè)[15]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)U H R F 1 能夠被多個(gè)miRNA結(jié)合而沉默[16-17]，有望成為潛在的干預(yù)靶點(diǎn)，但具體的下游作用信號(hào)傳遞機(jī)制目前暫不明確。本研究旨在探究UHRF1對(duì)CRC生物學(xué)特性的影響及其可能的相關(guān)通路，進(jìn)一步探討其與CRC的關(guān)系及相關(guān)作用機(jī)制，為CRC診斷和防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 組織和細(xì)胞來(lái)源

從癌癥基因組圖譜（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載并獲得結(jié)腸腺癌（COAD）、直腸腺癌（READ）和正常結(jié)直腸組織的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)（HTSeq-Counts 和 HTSeq-FPKM)。在排除總生存期（OS）值缺失或OS時(shí)間短（<30天）的患者后，最終納入了502例具有完整相關(guān)臨床信息的患者。同時(shí)利用該機(jī)構(gòu)收集的（2018年5月—2019年5月）新鮮保存于-80℃的術(shù)前未進(jìn)行放化療的CRC組織及匹配的超過(guò)5 cm范圍的正常腸黏膜組織，共112例。該研究通過(guò)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：閩醫(yī)大附一倫理醫(yī)研[2019]021號(hào)）。

CRC細(xì)胞株SW480、HT29、HCT116、LOVO由福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑與儀器

UHRF1抗體（美國(guó)Sigma公司），WNT3a、GSK3β、p-β-catenin和MMP9抗體（美國(guó)Abcam公司）；慢病毒包裝載體、UHRF1過(guò)表達(dá)載體和UHRF1shRNA（上海吉?jiǎng)P生物公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），SYBR Green Realtime PCR（日本Takara公司），GAPDH抗體（美國(guó)CST公司），PVDF膜（中國(guó)Biosharp公司），Transwell小室（美國(guó)Thermo Fisher公司）。PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。

倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯），Stratagene Mx3000P PCR儀（美國(guó)Agilent公司），凝膠成像及分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué) 冷凍保存的組織取小塊石蠟包埋固定， 4 μm厚切片，抗UHRF1抗體以1:200的工作濃度檢測(cè)組織中UHRF1蛋白的表達(dá)。磷酸鹽緩沖液沖洗后，加入適量稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體（工作濃度1:1 000），37℃孵育10～30 min，用磷酸鹽緩沖液沖洗。用蘇木精對(duì)比染色5 min，中性樹(shù)膠風(fēng)干。熒光顯微鏡下觀(guān)察。

1.3.2 慢病毒轉(zhuǎn)染 構(gòu)建UHRF1過(guò)表達(dá)慢病毒和UHRF1敲低（sh-UHRF1）慢病毒載體。SW480細(xì)胞用UHRF1過(guò)表達(dá)慢病毒感染，HCT116細(xì)胞用sh-UHRF1慢病毒感染。選擇合適的MOI值加入病毒，同時(shí)加入共感染劑Polybrene。12 h后更換正常培養(yǎng)基。感染72 h后，在熒光顯微鏡下觀(guān)察熒光表達(dá)。最后用嘌呤霉素進(jìn)行細(xì)胞抗性篩選，只留下慢病毒感染的細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。

1.3.3 Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明，使用TRIzol試劑從新鮮臨床標(biāo)本組織或者培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒用于RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用7500 real-time PCR系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR分析。相對(duì)表達(dá)式F（倍數(shù)變化）= 2-ΔΔCt進(jìn)行分析和比較。引物設(shè)計(jì)如下：UHRF1（上游引物：5’-ATGACTCTACCCACGGCAAG-3’；下游引物：5’-CTGGAAGATGGTGATGGGTT-3’）；GAPDH（上游引物：5’-CCCTTCATTGACCTCAACTACA TG-3’；下游引物：5’-TGGGATTTCCATTGATGA CAAGC-3 ’。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用細(xì)胞裂解液充分裂解并收集總蛋白。制備10%SDS-PAGE凝膠并將60微克/孔蛋白質(zhì)加入梳狀孔中。電泳轉(zhuǎn)染后，將PVDF膜封閉2 h。然后將PVDF膜與抗UHRF1、抗GAPDH、抗WNT3a、抗GSK3β、抗p-β-連環(huán)蛋白和抗MMP9在4℃下孵育過(guò)夜。用TBST洗滌膜后，將其與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG（1:5 000）孵育2 h。再次洗膜并浸入適量的ECL試劑以測(cè)試凝膠成像系統(tǒng)中的結(jié)果。

1.3.5 腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性檢測(cè) EdU增殖實(shí)驗(yàn)：將各組細(xì)胞按1.5×105個(gè)/孔接種于24孔板中。加入制備好的試劑EdU并繼續(xù)孵育細(xì)胞2 h。用聚甲醇固定并滲透液體后，加入Click反應(yīng)溶液。使用Hoechst 33342進(jìn)行核染色。在熒光顯微鏡下觀(guān)察到所有細(xì)胞核都被染成藍(lán)色。

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前12 h，將細(xì)胞更換為無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)處理。取300 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室上層，即每孔6×104個(gè)細(xì)胞，加入700 μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基井板。在5%CO2和37℃下孵育48 h。用棉簽輕輕擦拭室上部的細(xì)胞，用PBS清洗，用4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色液染色30 min。然后在顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：提前將Matrigel膠添加到Transwell小室底部，使其凝膠化。與遷移實(shí)驗(yàn)一樣，Transwell小室上層加入300 μl細(xì)胞懸液，每孔接種9×104個(gè)細(xì)胞，下孔板加入700 μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，處理方法同遷移實(shí)驗(yàn)。熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料用（±s）表示，各計(jì)量資料之間組間兩兩比較時(shí)先進(jìn)行多樣本方差齊性檢驗(yàn)；若方差齊，則采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UHRF1在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)及作用

在包括結(jié)腸癌和直腸癌在內(nèi)的絕大部分癌組織的UHRF1 mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)應(yīng)正常組織，UHRF1在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要的作用（P<0.001），見(jiàn)圖1A。UHRF1低表達(dá)組總生存期（OS）和疾病相關(guān)存活時(shí)間（DSS）均明顯優(yōu)于高表達(dá)組（P<0.05），UHRF1高表達(dá)量是CRC患者不良預(yù)后因素，見(jiàn)圖1B～C。利用ROC曲線(xiàn)評(píng)價(jià)UHRF1表達(dá)量預(yù)測(cè)CRC患者生存時(shí)間，1、3和5年OS的AUC分別為0.634、0.652和0.771，見(jiàn)圖1D，具有良好的生存預(yù)后預(yù)測(cè)作用。

圖1 在TCGA數(shù)據(jù)中UHRF1的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系Figure 1 Expression of UHRF1 and its relationship with prognosis in TCGA data

2.2 UHRF1在CRC臨床樣本中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：UHRF1在CRC癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為72.32%（81/112），在癌旁正常組織中陽(yáng)性表達(dá)率為25.0%（28/112,P<0.05），見(jiàn)圖2A～B，表1。RT-PCR結(jié)果示UHRF1 mRNA在癌組織中明顯高于癌旁組織（P<0.001），見(jiàn)圖2C。

表1 UHRF1表達(dá)與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationships between UHRF1 expression and clinicopathological characteristics in CRC patients

圖2 UHRF1在臨床樣本組織中的表達(dá)及其作用Figure 2 Expression of UHRF1 in tissues and its role in the clinical CRC cohort

UHRF1 mRNA表達(dá)量男性高于女性（圖2E）；T3+4組高于T1+2組（圖2F）；N+組高于N0組（圖2G）；M1組高于M0組（圖2H）；且隨著T N M 分期升高，表達(dá)量也隨著升高（圖2I），但與年齡無(wú)關(guān)（P>0.05）見(jiàn)圖2D。UHRF1蛋白表達(dá)量與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM 分期有關(guān)（P<0.05），與患者性別、年齡、腫瘤位置和腫瘤直徑無(wú)關(guān)（P>0.05），見(jiàn)表1；均提示UHRF1高表達(dá)與不良的臨床病理特征密切相關(guān)。

UHRF1低表達(dá)患者的3年OS明顯優(yōu)于高表達(dá)患者（P<0.05），見(jiàn)圖2J。1、2和3年OS的AUC分別為0.777、0.722和0.665，見(jiàn)圖2K，再次驗(yàn)證UHRF1具有良好的預(yù)后預(yù)測(cè)作用。

2.3 CRC細(xì)胞株篩選和慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果

檢測(cè)4株細(xì)胞株UHRF1 mRNA和蛋白的表達(dá)，UHRF1 mRNA和蛋白表達(dá)從高到低分別是HCT116、LOVO、HT29、SW480細(xì)胞，見(jiàn)圖3A～B。因此選用SW480細(xì)胞作為過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染載體，HCT116細(xì)胞作為敲減轉(zhuǎn)染載體。

圖3 UHRF1 mRNA和蛋白在不同細(xì)胞中的表達(dá)Figure 3 UHRF1 mRNA and protein expression in different cells

轉(zhuǎn)染后，SW480細(xì)胞中UHRF1 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯高于NC組和Control組（P<0.01），證實(shí)過(guò)表達(dá)組細(xì)胞株構(gòu)建成功，見(jiàn)圖3C～D。

敲減后，HCT116細(xì)胞sh-UHRF1敲減組的UHRF1 mRNA和蛋白的表達(dá)量較NC組和Control組明顯降低（P<0.01），表明敲減組細(xì)胞株構(gòu)建成功，見(jiàn)圖3E～F。

2.4 CRC細(xì)胞中UHRF1的表達(dá)與WNT/MMP9信號(hào)通路的關(guān)系

轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)后，Western blot結(jié)果顯示，隨著UHRF1表達(dá)量的增加，WNT信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白WNT3a和GSK3β的表達(dá)量增加，而p-β-catenin的表達(dá)量顯著降低，MMP9表達(dá)量增加。在此基礎(chǔ)上，加入了IWP-2（WNT拮抗劑），發(fā)現(xiàn)原來(lái)WNT信號(hào)通路中表達(dá)增加的相關(guān)蛋白均降低，見(jiàn)圖4。

圖4 CRC細(xì)胞中UHRF1調(diào)控WNT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 4 UHRF1 regulated the expression of WNT signaling pathway-related proteins in CRC cells

sh-UHRF1敲低后，UHRF1表達(dá)明顯降低，WNT3a和GSK3β的表達(dá)降低，MMP9表達(dá)量下降；使用HLY78（WNT激活劑）后，相關(guān)蛋白的表達(dá)趨于恢復(fù)，見(jiàn)圖4。因此，在結(jié)直腸癌中UHRF1可能通過(guò)調(diào)節(jié)WNT信號(hào)通路影響基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9的表達(dá)。

2.5 UHRF1對(duì)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

E d U 結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)組增殖細(xì)胞數(shù)較N C 組和C o n t r o l 組明顯增多，使用抑制劑后U H R F 1+I W P-2 組較過(guò)表達(dá)組顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖5A；而在sh-UHRF1組中，隨著UHRF1表達(dá)的降低，細(xì)胞增殖數(shù)目也隨之減少（P<0.05），加入WNT活化劑后細(xì)胞增殖率明顯上升（P<0.05），見(jiàn)圖5B。

圖5 UHRF1通過(guò)WNT信號(hào)通路影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖Figure 5 UHRF1 affected the proliferation of colorectal cancer cells through WNT signaling pathway

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)組細(xì)胞數(shù)明顯較NC組和Control組多（P<0.05），并且過(guò)表達(dá)組通過(guò)IWP-2處理后細(xì)胞數(shù)明顯低于未經(jīng)拮抗劑處理組（P<0.05），見(jiàn)圖6A。敲減組遷移數(shù)明顯低于NC組和Control組（P<0.01），而sh-UHRF1+HLY78組明顯高于敲減組（P<0.05），見(jiàn)圖6B。

圖6 UHRF1通過(guò)WNT信號(hào)通路影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲Figure 6 UHRF1 affected migration and invasion of colorectal cancer cells through WNT signaling pathway

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：過(guò)表達(dá)組細(xì)胞數(shù)明顯多于NC組和Control組（P<0.01），且明顯高于UHRF1+IWP-2組（P<0.01），見(jiàn)圖6C。敲減組細(xì)胞數(shù)明顯低于NC組和Control組，sh-UHRF1+HLY78組細(xì)胞數(shù)高于敲減組（P<0.05），見(jiàn)圖6D。

3 討論

UHRF1基因編碼蛋白是一個(gè)多功能結(jié)構(gòu)域蛋白，包含UBL、PHD和TTD結(jié)構(gòu)域、RING finger功能域和SET-環(huán)指狀結(jié)構(gòu)域，能夠識(shí)別和修飾不同的染色質(zhì)，在細(xì)胞增殖、DNA損傷與修復(fù)、周期調(diào)控和細(xì)胞損傷放射敏感性等方面發(fā)揮重要作用[18]。UHRF1是一個(gè)重要的表觀(guān)遺傳調(diào)控因子，是整合表觀(guān)遺傳信息的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，通過(guò)其特殊域參與表觀(guān)遺傳過(guò)程，進(jìn)一步調(diào)節(jié)腫瘤的生物學(xué)特性[19]。

研究表明，UHRF1在包括CRC在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20-22]，雖然具體的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。UHRF1在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，并與結(jié)直腸癌的進(jìn)展有關(guān)[23]，CRC細(xì)胞中DNA甲基化的維持高度依賴(lài)于UHRF1，因此UHRF1耗竭迅速誘導(dǎo)DNA去甲基化作用[24]。本研究揭示了UHRF1在具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和高TNM分期不良預(yù)后因素的CRC患者中明顯高表達(dá)，可能是影響CRC患者預(yù)后的一個(gè)因素，3年隨訪(fǎng)結(jié)果顯示UHRF1高表達(dá)提示不良的預(yù)后，且具有較為穩(wěn)定可靠的預(yù)后預(yù)測(cè)能力，更加可靠的證據(jù)需要等待5年隨訪(fǎng)結(jié)果進(jìn)一步評(píng)估預(yù)后情況。UHRF1蛋白還與細(xì)胞增殖和分化能力密切相關(guān)，增殖能力越強(qiáng)和分化程度越低的細(xì)胞中UHRF1表達(dá)越高。本研究還發(fā)現(xiàn)UHRF1的過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)CRC的增殖、遷移和侵襲能力。UHRF1基因沉默后，CRC細(xì)胞的這些生物學(xué)特性受到抑制，這與UHRF1的促進(jìn)增殖作用密切相關(guān)，這與課題組前期研究結(jié)果相一致[16-17]，同時(shí)在體內(nèi)外也驗(yàn)證了UHRF1在CRC中的重要作用。亦有研究發(fā)現(xiàn)SHMT2敲低可通過(guò)降低UHRF1的表達(dá)進(jìn)而抑制CRC的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，表明UHRF1可能與CRC細(xì)胞周期有關(guān)[25]，但UHRF1影響侵襲、遷移能力的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

WNT信號(hào)通路是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中傳遞生物信息的重要通路，是一個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。WNT信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的形成。通過(guò)級(jí)聯(lián)信號(hào)傳遞，可導(dǎo)致EMT、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和腫瘤干細(xì)胞特性增強(qiáng)[26]。同時(shí)，無(wú)論是乳腺癌、肺癌、肝癌，甚至CRC[27]，這些腫瘤的發(fā)生均被認(rèn)為與WNT信號(hào)通路有關(guān)[28-30]。因此，UHRF1作為整合遺傳信息的重要分子，也可引起異常細(xì)胞增殖和腫瘤形成，UHRF1和WNT信號(hào)通路之間是否存在相關(guān)性目前尚不清楚。本研究驗(yàn)證了UHRF1可以通過(guò)WNT信號(hào)通路調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9的表達(dá)，從而影響CRC遷移和侵襲的生物學(xué)特性，進(jìn)一步揭示了UHRF1發(fā)揮作用的內(nèi)在機(jī)制。UHRF1也可能通過(guò)其他作用機(jī)制發(fā)揮作用，有研究發(fā)現(xiàn)UHRF1可能介導(dǎo)的泛素化和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）的降解，導(dǎo)致啟動(dòng)子CpG島的去甲基化和STAT1的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CRC的生長(zhǎng)[31]。

綜上所述，本研究探索了UHRF1如何介導(dǎo)其在CRC中的促癌作用。但目前的研究?jī)H基于細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)研究，即體外水平。同時(shí)，我們也在思考這個(gè)系統(tǒng)中是否有其他分子參與，UHRF1是否是這個(gè)調(diào)控的起點(diǎn)，是否還有其他的信號(hào)通路，這有待未來(lái)進(jìn)一步的研究和發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)UHRF1基因可通過(guò)調(diào)控WNT信號(hào)通路影響CRC增殖、遷移和侵襲，希望為結(jié)直腸癌的分子靶向治療提供新的可能。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。