龍鳳，趙玉，黃勇，劉曉燕，周旋，李雪，葉海琳

0 引言

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤，也是女性癌癥死亡的主要原因[1]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）約占乳腺癌新發(fā)病例的24%[2]，惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、且缺乏特異性靶向藥物，導(dǎo)致其易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差，目前臨床尚無(wú)良好的治療方法[3]。因此，深入解析驅(qū)動(dòng)TNBC發(fā)展的分子機(jī)制，篩選安全高效的靶向藥物及藥物組合是臨床治療TNBC以及改善患者生活質(zhì)量的有效策略。中草藥一直是抗腫瘤藥物的重要來(lái)源，而長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non coding RNA, lncRNA）是腫瘤發(fā)生發(fā)展中重要調(diào)控因子及抗腫瘤藥物的潛在作用靶標(biāo)[4]。鴉膽子素D（Bruceine D,BD）是一種來(lái)源于中草藥鴉膽子的四環(huán)三萜類化合物[5]，在多種癌癥中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤藥理學(xué)活性[6-8]。在乳腺癌中，BD可抑制TNBC細(xì)胞的遷移及侵襲[9]，但其具體分子作用機(jī)制尚不明確。鉀電壓門控通道亞家族Q成員1重疊轉(zhuǎn)錄物1（potassium voltage-gated channel subfamily Q member 1 overlapping transcript 1,KCNQ1OT1）在多種人類癌癥中異常表達(dá)，與癌癥的進(jìn)展、分期和預(yù)后不良密切相關(guān)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1可通過miR-34a/Notch3軸影響乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[11]。因此，KCNQ1OT1很可能是抗乳腺癌藥物的潛在分子作用靶點(diǎn)，但BD是否可通過調(diào)控KCNQ1OT1影響TNBC的進(jìn)展尚未可知。

小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）技術(shù)以序列特異性的方式高效沉默靶基因的表達(dá)。目前，已開發(fā)出專門靶向腫瘤基因的siRNA藥物并獲批上市[12]。然而，BD聯(lián)合siRNA靶向KCNQ1OT1是否能獲得更佳的抗乳腺癌療效尚不清楚。因此，本研究通過觀察BD聯(lián)合siKCNQ1OT1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，分析KCNQ1OT1參與調(diào)控的分子通路，探尋BD聯(lián)合siKCNQ1OT1治療人乳腺癌的可能分子機(jī)制，旨在為研發(fā)治療乳腺癌的靶向藥物及藥物組合提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A細(xì)胞株（武漢普諾賽生命科技有限公司，編號(hào)：CL-0525）；人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，編號(hào)：TCHu227）；人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，編號(hào)：CL-0149）。

1.2 藥品及試劑

鴉膽子素D（Bruceine, BD）購(gòu)自北京Solarbio公司，批號(hào)SB8280，純度≥98%；CCK8試劑盒（日本Dojindo，批號(hào)：CK04）；Transwell小室、Matrigel基底膠購(gòu)自美國(guó)Corning公司，批號(hào)分別為3422、356234；RiboFECTTMCP Buffer（10×）、RiboFECTTMCP Reagent、人屬KCNQ1OT1引物、RiboTMh-KCNQ1OT1 Smart Silencer-3、lncRNA Smart Silencer NC #1購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為C10502-05、C10511-05、LQP0003767/8、Lnc3211122065528和Lnc3N0000001-1-5；彩虹245廣譜蛋白Marker（11～245 kDa)（北京Solarbio公司，批號(hào)：PR1920）；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（蘇州NCM Biotech，批號(hào)：P10100）；兔抗人GAPDH多克隆抗體、兔抗人Vimentin多克隆抗體、兔抗人p-MKK7多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自ImmunoWay Biotechnology Company，批號(hào)分別為YM3215、YT4879、YP1404、RS002；重組Anti-E cadherin抗體、Anti-N cadherin抗體、Anti-CDC42抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab212059、ab76011、ab187643）；兔多克隆抗體MKK7（上海Beyotime公司，批號(hào)：AF7419）。

1.3 儀器

恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：HERAcell VIOS 160i CO2型）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司，Varioskan LUX型）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（加拿大楓嶺國(guó)際有限公司，型號(hào)：FTC-8000）；電泳槽/電轉(zhuǎn)移裝置（美國(guó)伯樂公司，PowerPacTMBasic BIO-RAD型）。

1.4 方法

1.4.1 生物信息學(xué)分析 利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)lnCAR（https://lncar.renlab.org/）分析lncRNA KCNQ1OT1在乳腺癌組織及正常乳腺組織中的差異表達(dá)，并通過Kaplan-Meier Plotter（http://kmplot.com/analysis/）數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)lncRNA KCNQ1OT1高/低表達(dá)與乳腺癌患者總生存期之間的關(guān)系。通過ENCORI（http://starbase.sysu.edu.cn）、LncBase v.3（https://diana.e-ce.uth.gr/lncbasev3）和RNAinter（http://www.rnainter.org/）在線數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與lncRNA KCNQ1OT1相互作用的miRNA。ENCORI、RNAinter、TargetScan8.0（https://www.targetsc an.org/vert_80/）和miRDB（https://mirdb.org/）在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-9-5p、miR-423-5p和miR-454-3p的下游靶基因并進(jìn)行交集。用DAVID、Bioinformatics在線軟件將交集出來(lái)的靶基因進(jìn)行GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞系置于含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，MCF-10A細(xì)胞系置于MCF-10A細(xì)胞專用培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.3 細(xì)胞活力測(cè)定 將細(xì)胞接種在96孔板中（3 000個(gè)細(xì)胞/孔），并讓其生長(zhǎng)過夜。然后用不同濃度的BD處理細(xì)胞，分別培養(yǎng)24、48和72 h后將CCK8溶液加入各孔中，并于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。于450 nm條件下用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度值（OD），并計(jì)算細(xì)胞存活率。計(jì)算公式：細(xì)胞存活率=[（OD實(shí)驗(yàn)孔-OD空白孔）/（OD對(duì)照孔-OD空白孔）]×100%，0 μg/ml處理組的細(xì)胞活力被認(rèn)為是100%。

1.4.4 菌落形成能力 將MDA-MB-231細(xì)胞（1 000個(gè)細(xì)胞/孔）接種到六孔板中并培養(yǎng)過夜。用不同濃度的BD處理各孔細(xì)胞24 h，常規(guī)培養(yǎng)12天。用PBS緩沖液清洗2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞集落，然后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min。最后對(duì)菌落拍照，人工統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

1.4.5 RNA提取及實(shí)時(shí)定量PCR分析 收集處理后的細(xì)胞，用RNAiso Plus試劑提取MDAMB-231細(xì)胞總RNA，使用riboSCRIPTTMmRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒通過qRT-PCR法測(cè)定各組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA KCNQ1OT1的表達(dá)水平。KCNQ1OT1上游引物序列：5’-GGCTGCCTATCTCTTCCACC-3’，下游引物序列：5’-GTGCGGACCCTATACGGAAG-3’，GAPDH由廣州銳博生物技術(shù)有限公司提供作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法。

1.4.6 劃痕實(shí)驗(yàn) 將MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)密度達(dá)90%時(shí)，使用100 μl槍頭刮擦細(xì)胞層以產(chǎn)生劃痕，然后用PBS洗滌兩次以除去漂浮的細(xì)胞。隨后加入無(wú)血清含藥或不含藥培養(yǎng)基，并于顯微鏡下分別拍下0、24和48 h的劃痕愈合照片。遷移率的計(jì)算公式如下：遷移率（%）=（0 h劃痕面積-24 h/48 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將用DMEM稀釋后的基質(zhì)膠50 μl均勻鋪于Transwell小室底部，干燥后將不同藥物處理的100 μl、濃度為5×105/ml的MDA-MB-231細(xì)胞接種于Transwell小室內(nèi)，下室每孔加入600 μl含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棉簽拭子擦除小室上層未侵襲的細(xì)胞，4%福爾馬林固定膜下的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色。于倒置顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。侵襲率（%）=實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.8 蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn) 根據(jù)說明書，將經(jīng)過不同藥物處理的細(xì)胞用高效組織細(xì)胞RIPA裂解液處理10 min以提取總蛋白。通過離心收集上清液部分，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定各組蛋白質(zhì)濃度，然后將蛋白樣品進(jìn)行變性處理。等量的蛋白質(zhì)通過10%SDS-PAGE電泳；然后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；膜用5%脫脂乳封閉2 h；分別與一抗4℃孵育過夜，一抗稀釋比例為：GAPDH（1:3 000）；Vimentin（1:1 000）；N-cadherin（1:7 000）；E-cadherin（1:1 000）；CDC42（1:1 0000）；MKK7（1:1 000）；p-MKK7（1:1 000）。隨后將該膜與二抗孵育2 h，并通過ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和Western blot成像系統(tǒng)檢測(cè)目標(biāo)條帶。GAPDH用作蛋白的內(nèi)部對(duì)照。

1.4.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成了KCNQ1OT1 siRNA的靶序列（見表1）和包括在人轉(zhuǎn)錄組中沒有靶標(biāo)的siRNA作為非靶標(biāo)對(duì)照（si-NC）。使用riboFECTTMCP試劑盒和RiboTMlncRNA Smart Silencer試劑在MDA-MB-231細(xì)胞中沉默KCNQ1OT1的表達(dá)。用riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑在6孔板中以50%～70%的細(xì)胞密度進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，并將細(xì)胞孵育24 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，進(jìn)行加藥處理并分組。用0.4 μg/ml濃度的BD處理記為BD（0.4 μg/ml）組；將si-NC、si-KCNQ1OT1分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中記為siNC、siKCNQ1OT1組；將si-NC、si-KCNQ1OT1分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中再用0.4 μg/ml BD處理記為siNC+BD（0.4 μg/ml）、siKCNQ1OT1+BD（0.4 μg/ml）組。對(duì)照組使用含或者不含有血清且DMSO終體積分?jǐn)?shù)為0.1%的DMEM培養(yǎng)液記為BD（0 μg/ml）組。

表1 siKCNQ1OT1序列Table 1 siKCNQ1OT1 sequences

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）。組間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本比較采用單因素方差分析。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPad Prism V8.0軟件。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA KCNQ1OT1在人乳腺癌組織細(xì)胞中的表達(dá)及其與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性

在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，與正常乳腺組織相比，KCNQ1OT1在乳腺癌組織中高表達(dá)，見圖1A，并且KCNQ1OT1高表達(dá)的乳腺癌患者的總生存期顯著降低，見圖1B。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A相比， KCNQ1OT1在人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞中均高表達(dá)，且KCNQ1OT1在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)更為顯著（P<0.01），見圖1C。

圖1 LncRNA KCNQ1OT1在乳腺癌組織及細(xì)胞系中上調(diào)并與患者生存期顯著相關(guān)Figure 1 LncRNA KCNQ1OT1 was up-regulated in breast cancer tissues and cell lines and is significantly related to patient survival

2.2 BD聯(lián)合siKCNQ1OT1對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響

CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BD以時(shí)間和劑量依賴的方式抑制MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞活力（P<0.01），見圖2A、B。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BD降低了MDA-MB-231細(xì)胞的克隆形成能力（P<0.01），見圖2C、D。qRTPCR結(jié)果表明BD可呈濃度依賴性地抑制MDAMB-231和MCF-7細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)，且MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)BD更敏感（P<0.01），見圖2E。采用siRNA技術(shù)敲低并驗(yàn)證KCNQ1OT1在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)siKCNQ1OT1組細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01），見圖2F。按照不同分組處理后，采用qRT-PCR檢測(cè)KCNQ1OT1的表達(dá)，結(jié)果顯示，與siNC組相比，siKCNQ1OT1組中KCNQ1OT1的表達(dá)水平降低，BD（0.4 μg/ml）聯(lián)合siKCNQ1OT1對(duì)KCNQ1OT1表達(dá)水平的抑制作用更為顯著，見圖2G。CCK8結(jié)果顯示，與siNC組相比，siKCNQ1OT1處理組的MDA-MB-231細(xì)胞活力（（66.99±2.87）%）顯著降低（P<0.01），且siKCNQ1OT1聯(lián)合BD（0.4 μg/ml）對(duì)MDAMB-231細(xì)胞活力（（42.63±1.55）%）的抑制作用比單獨(dú)應(yīng)用siKCNQ1OT1或BD（0.4 μg/ml）更為顯著（P<0.01），見圖2H。

圖2 BD聯(lián)合siKCNQ1OT1對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響Figure 2 Effect of BD combined with siKCNQ1OT1 on viability of breast cancer MDA-MB-231 cells

2.3 BD聯(lián)合siKCNQ1OT1對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siKCNQ1OT1和BD（0.4 μg/ml）聯(lián)用對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移的抑制作用比單獨(dú)應(yīng)用siKCNQ1OT1或BD（0.4 μg/ml）更顯著（P<0.05），見圖3A、B。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與各自對(duì)照組相比，BD（0.4 μg/ml）組與siKCNQ1OT1組穿透Transwell小室的細(xì)胞比率明顯減少，分別是（58.11±2.49）%和（60.00±4.18）%；而siKCNQ1OT1聯(lián)合BD（0.4 μg/ml）組穿透Transwell小室的細(xì)胞比率為（27.70±0.31）%，更大程度地抑制細(xì)胞侵襲能力，見圖3C、D。

圖3 BD聯(lián)合siKCNQ1OT1對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響Figure 3 Effects of BD combined with siKCNQ1OT1 on migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells

2.4 BD聯(lián)合siKCNQ1OT1對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，單獨(dú)應(yīng)用siKCNQ1OT1或BD（0.4 μg/ml）均可下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)；siKCNQ1OT1和BD（0.4 μg/ml）聯(lián)用時(shí)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin和E-cadherin的表達(dá)調(diào)控作用更為顯著（P<0.01），見圖4。

圖4 BD聯(lián)合siKCNQ1OT1對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響Figure 4 Effect of BD combined with siKCNQ1OT1 on expression of EMT related proteins in breast cancer MDA-MB-231 cells

2.5 基于生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)lncRNA KC-NQ1OT1靶基因及其參與調(diào)控的相關(guān)信號(hào)通路

在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析與KCNQ1OT1相互作用的miRNA，取交集篩選出20個(gè)miRNA，見圖5A，其中已有研究表明miR-9-5p[13]、miR-423-5p[14]和miR-454-3p[15]與KCNQ1OT1之間存在互補(bǔ)位點(diǎn)。再通過數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-9-5p、miR-423-5p和miR-454-3p的靶基因并取交集，共獲取包括CDC42、MKK7在內(nèi)的939個(gè)靶基因，見圖5B。對(duì)這939個(gè)靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)其靶點(diǎn)主要富集于RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA模板和細(xì)胞遷移等關(guān)鍵生物過程，見圖5C，其信號(hào)通路主要富集在癌癥、Hippo和MAPK信號(hào)通路，見圖5D。

圖5 生物信息學(xué)技術(shù)分析lncRNA KCNQ1OT1靶基因Figure 5 Analysis of target gene of lncRNA KCNQ1OT1 by bioinformatics

2.6 BD聯(lián)合siKCNQ1OT1對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中CDC42、MKK7和p-MKK7蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，BD（0.4 μg/ml）和siKCNQ1OT1均分別能下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中CDC42和p-MKK7的表達(dá)（P<0.01）；當(dāng)BD（0.4 μg/ml）和siKCNQ1OT1聯(lián)用時(shí)，MDA-MB-231細(xì)胞中CDC42和p-MKK7的表達(dá)量較單獨(dú)應(yīng)用BD（0.4 μg/ml）或siKCNQ1OT1下調(diào)更顯著（P<0.05或P<0.01），而各處理組的MDA-MB-231細(xì)胞中MKK7的表達(dá)未見明顯變化，見圖6。

圖6 BD聯(lián)合siKCNQ1OT1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中CDC42、MKK7和p-MKK7蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effect of BD combined with siKCNQ1OT1 on expression of CDC42, MKK7, and p-MKK7 proteins in MDAMB-231 cells

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNAs是一類新型的功能調(diào)控分子，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的基因調(diào)控中發(fā)揮作用。在乳腺癌中，多種lncRNAs通過微調(diào)組蛋白修飾或調(diào)節(jié)其靶miRNAs的生物利用度，在基因轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮重要作用[16]。這使lncRNA未來(lái)可能被作為治療癌癥的新分子靶標(biāo)及癌癥早期診斷、評(píng)估預(yù)后的有效生物標(biāo)志物，具有極其重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。KCNQ1OT1是近年發(fā)現(xiàn)的一種致癌性lncRNA，在多種人類癌癥中均高表達(dá)，并與癌癥臨床特征密切相關(guān)[10]。在乳腺癌中，KCNQ1OT1表達(dá)上調(diào)并可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，且KCNQ1OT1的高表達(dá)與患者預(yù)后生存率低相關(guān)[13,17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與非TNBC細(xì)胞和人正常乳腺上皮細(xì)胞相比，KCNQ1OT1在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中異常高表達(dá)，因此，靶向KCNQ1OT1的治療可能是治療三陰性乳腺癌的有效方法，我們假設(shè)通過siRNA技術(shù)沉默乳腺癌細(xì)胞中的KCNQ1OT1基因可能是一種有用的治療策略。

目前，從中藥中提取的天然活性成分已被公認(rèn)為是新型抗癌藥物的重要來(lái)源[18]。鴉膽子素D是從中藥鴉膽子中提取出來(lái)的一種化合物。研究表明，BD在多種癌癥中具有顯著的抗腫瘤藥理活性，既可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、EMT進(jìn)程和自噬來(lái)抑制腫瘤進(jìn)展[19]，也可作為一種輔助藥物來(lái)提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[14,20]。既往研究表明BD可通過激活靶向p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase, p38 MAPK）和Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase, JNK）信號(hào)通路來(lái)抑制乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)并誘導(dǎo)其凋亡[21]；BD還可通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B, Akt）信號(hào)通路和逆轉(zhuǎn)EMT過程來(lái)降低MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力[9]。聯(lián)合治療方案是臨床上治療惡性腫瘤的常用治療手段。通過聯(lián)合用藥，可以同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路分子，從而提高療效、降低不良反應(yīng)、減少多藥耐藥的發(fā)生。因此本研究分析了BD與siKCNQ1OT1聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。研究結(jié)果表明，與單獨(dú)應(yīng)用BD（0.4 μg/ml）或siKCNQ1OT1相比，BD（0.4 μg/ml）與siKCNQ1OT1聯(lián)合使用對(duì)MDAMB-231細(xì)胞的活力、遷移和侵襲能力的抑制作用更明顯。

生物信息學(xué)分析表明KCNQ1OT1參與調(diào)控的信號(hào)通路主要富集在癌癥、Hippo和MAPK通路。Hippo信號(hào)通路主要與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程相關(guān)[22]，而GO功能分析表明靶點(diǎn)主要集中在細(xì)胞遷移方面，因此我們預(yù)測(cè)并篩選出與乳腺癌轉(zhuǎn)移更為密切的MAPK信號(hào)通路[23]。MAPK信號(hào)通路的異常激活在腫瘤發(fā)生中起著核心作用[24]，細(xì)胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42, CDC42）、MKK7作為MAPK信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白，可參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程[25-26]。CDC42是Rho家族蛋白的一種小GTP酶，它的失調(diào)可以改變細(xì)胞的正常功能，導(dǎo)致信號(hào)通路的啟動(dòng)，并且與多種致病過程（例如癌癥）相關(guān)。使用小分子和lncRNA抑制CDC42和CDC42相關(guān)信號(hào)通路是改善癌癥治療和開發(fā)抗腫瘤藥物的新策略[27]。據(jù)報(bào)道，lncRNA可作為上游信號(hào)分子參與激活多種癌癥相關(guān)信號(hào)通路，是介導(dǎo)癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的重要參與者[28]。因此，本研究推測(cè)CDC42/MKK7作為MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵分子以及KCNQ1OT1靶分子參與BD抑制MDA-MB-231細(xì)胞惡性生物學(xué)行為機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)應(yīng)用BD或siKCNQ1OT1相比，BD與siKCNQ1OT1聯(lián)合對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中CDC42、p-MKK7蛋白表達(dá)的抑制作用更明顯。這表明BD與siKCNQ1OT1對(duì)CDC42/MKK7信號(hào)通路存在一定的抑制作用。EMT是促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移表型的轉(zhuǎn)錄程序的一部分。發(fā)生EMT時(shí)，腫瘤細(xì)胞失去細(xì)胞極性，運(yùn)動(dòng)和遷移能力增強(qiáng)，最終導(dǎo)致腫瘤廣泛侵襲和轉(zhuǎn)移[29]。EMT發(fā)生的標(biāo)志是上皮表面標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的丟失以及間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的獲得[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，BD與siKCNQ1OT1均能夠有效抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移及侵襲，這種抑制作用可能與N-cadherin、Vimentin的表達(dá)下調(diào)，E-cadherin的表達(dá)上調(diào)有關(guān)，且二者聯(lián)用對(duì)MDAMB-231細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin和E-cadherin的表達(dá)調(diào)控作用更顯著。這些研究結(jié)果都表明了BD聯(lián)合siKCNQ1OT1對(duì)三陰性乳腺癌具有更佳的抑制效果，這為臨床治療中新的藥物組合的開發(fā)，特別是靶向治療三陰性乳腺癌的藥物開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

總之，BD可以劑量和時(shí)間依賴的方式下調(diào)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中l(wèi)ncRNA KCNQ1OT1的表達(dá)，且BD聯(lián)合siKCNQ1OT1能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT進(jìn)程，其分子機(jī)制可能與CDC42/MKK7信號(hào)通路的阻斷有關(guān)。因此，BD和siKCNQ1OT1聯(lián)合應(yīng)用是治療乳腺癌的一種新策略。本研究結(jié)果可為中藥與靶向基因聯(lián)合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為提高乳腺癌臨床治療效果提供新的思路與途徑。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。