周海東,周俊秀,羅昌泰,韋積華,謝康麒,羅富強(qiáng),李載永,王瑋,羅東,陳祿昌,余電柏,麻華德,李山郎

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科,廣西百色 533000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西百色 533000;3.廣西百色市婦幼保健院內(nèi)外綜合科,廣西百色 533000)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種由肥胖、衰老、損傷、遺傳等因素引起的退行性疾病,多見于老年人。據(jù)研究報(bào)告[1],OA是全球范圍內(nèi)最常見的骨關(guān)節(jié)疾病,超過7%的人患有OA相關(guān)疾病;我國每年治療OA的費(fèi)用已超國內(nèi)生產(chǎn)總值的1%[2]。OA是最常見的與年齡相關(guān)的退行性疾病之一,其特征是骨贅形成、軟骨退化和滑膜炎癥。軟骨細(xì)胞被認(rèn)為是OA發(fā)病機(jī)制的重要細(xì)胞介質(zhì),它可以響應(yīng)由機(jī)械損傷、過載或炎癥引起的環(huán)境變化而進(jìn)行的表型調(diào)節(jié)[3]。在機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)下,軟骨細(xì)胞的凋亡和再生處于動(dòng)態(tài)平衡,當(dāng)軟骨細(xì)胞過度凋亡,穩(wěn)態(tài)被破壞,軟骨損傷加劇,這將加速骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展;此過程與Caspase、Bcl-2蛋白家族、MAPK、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin、Fas/FasL、NF-κB及JAK/STAT等信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)[4],但相關(guān)分子機(jī)制及生物過程至今未明。因此,本研究基于GEO公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索,選擇GSE57218數(shù)據(jù)集作為分析對(duì)象,通過篩選差異表達(dá)基因→GO和KEGG富集分析→構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)→篩選出Hub基因,深入了解關(guān)鍵差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能,以期篩選出OA軟骨退行性變的關(guān)鍵分子。

1 材料與方法

1.1 一般資料本研究基于GEO公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索,該數(shù)據(jù)庫于2012年由BENISCH等[5]首次提出,選擇GSE57218數(shù)據(jù)集作為分析對(duì)象,數(shù)據(jù)集平臺(tái)號(hào)為GPL570。該數(shù)據(jù)包含40例樣本,其中7例為健康成人關(guān)節(jié)軟骨組織,33例為晚期OA所致的關(guān)節(jié)軟骨。

1.2 差異基因的表達(dá)分析本研究使用R語言limma包對(duì)晚期OA關(guān)節(jié)軟骨mRNA芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析,設(shè)置檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)P<0.05、差異倍數(shù)(fold change,FC)的對(duì)數(shù)絕對(duì)值|log FC|>1為篩選條件,篩選OA晚期關(guān)節(jié)軟骨與正常組織的差異表達(dá)mRNA(differentially expressed mRNAs,DEmRNAs)。

1.3 GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析本研究基于R語言clusterProfiler包對(duì)DEmRNAs進(jìn)行GO功能富集和KEGG信號(hào)通路富集分析。

1.4 PPI與核心模塊分析通過STRING(search tool for the retrieval of interacting genes /proteins)在線工具對(duì)差異基因進(jìn)行分析,獲得PPI圖,將圖片導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,利用插件Cytohubba和MCODE尋找與晚期OA軟骨退行性變相關(guān)的Hub基因和Hub模塊。

1.5 OA相關(guān)的核心基因篩選基于OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫搜索關(guān)鍵詞“Osteoarthritis”,尋找文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道的和OA相關(guān)的基因,與Hub模塊和Hub基因用Venn圖取交集。

1.6 Hub基因定位通過在線數(shù)據(jù)庫BioGPS(http://biogps.org/#goto=welcome)對(duì)上述基因進(jìn)行組織定位,組織間最高表達(dá)量大于兩倍第二表達(dá)量有意義,表明該基因可作為OA表達(dá)標(biāo)志基因。

1.7 KEGG與GSEA通路富集分析用基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)方法對(duì)芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行核心差異基因篩選,以KEGG基因集為預(yù)設(shè)基因集進(jìn)行富集分析,將交集基因與OMIM數(shù)據(jù)庫中的已知基因基于用Venn圖再次取交集,并定位于GSEA。

2 結(jié) 果

2.1 DEmRNAs的獲取本研究采用R語言limma包對(duì)GSE57218進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)庫樣本基因表達(dá)量基本保持一致,說明該數(shù)據(jù)適合進(jìn)行下一步分析,見圖1。使用R語言limma包篩選差異基因,共得到305個(gè)DEmRNAs,下調(diào)基因154個(gè),上調(diào)基因151個(gè),見圖2。

圖1 GSE57218數(shù)據(jù)集箱線圖

2.2 GO和KEGG富集分析為了解上調(diào)、下調(diào)DEmRNAs的功能,本研究分別對(duì)151個(gè)上調(diào)DEmRNAs、154個(gè)下調(diào)DEmRNAs進(jìn)行了GO和KEGG富集分析,分別對(duì)生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)和KEGG中的信號(hào)通路進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,①DEGs在BP、MF、CC的富集情況:對(duì)BP而言,DEmiRNAs主要富集在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)、細(xì)胞蛋白定位的正向調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)在膜上定位的調(diào)節(jié)、肌動(dòng)蛋白絲-基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng)及蛋白質(zhì)在細(xì)胞外圍定位的調(diào)節(jié),對(duì)于MF和CC而言,主要富集情況見圖3A、3B、3C及表1、表2、表3;②KEGG通路主要富集在癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)通路、焦點(diǎn)粘連通路、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路、ECM-受體相互作用通路、蛋白質(zhì)消化吸收通路,見圖3D、表4。

表1 BP富集分析結(jié)果

表2 CC富集分析結(jié)果

表3 MF富集分析結(jié)果

表4 KEGG通路功能富集分析結(jié)果

2.3 共同差異表達(dá)基因的蛋白互助網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及模塊分析利用STRING對(duì)305個(gè)DEmRNAs進(jìn)行分析,設(shè)定最低相互作用分?jǐn)?shù)為0.7,得到由286個(gè)節(jié)點(diǎn)、162條連線構(gòu)成的相互作用關(guān)系圖。將STRING的計(jì)算結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,獲得PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖(圖4A);用MCODE插件對(duì)該蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,得到DEmRNAs核心模塊(圖4B、4C、4D);用Cytoscape篩選出10個(gè)Hub基因(圖5)。

注:A為PPI網(wǎng)絡(luò)圖;B、C、D為核心模塊

注:紅色代表與疾病相關(guān)性高,顏色越淺代表關(guān)聯(lián)度越低

2.4 OA相關(guān)的核心基因篩選在OMIM人類基因和遺傳疾病的在線目錄中搜索已報(bào)道的與OA相關(guān)的基因363個(gè),并與Hub核心模塊和Hub核心基因用Venn圖取交集(圖6A),得到4個(gè)候選基因,分別為COL2A1、COL1A2、COL5A1、COL1A1。

注:A為MCODE模塊與OMIM交集基因;B為GSEA與OMIM交集基因;C、D為GSEA通路富集分析

2.5 GSEA差異基因篩選GSEA基因集富集分析以KEGG基因集為預(yù)設(shè)基因集,對(duì)芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,將這些富集通路中的核心基因分別于OMIM數(shù)據(jù)庫得到的文獻(xiàn)中報(bào)道的OA相關(guān)基因取交集,Venn圖中兩個(gè)基因集與OMIM共同存在的基因5個(gè)(圖6B),分別為:COL1A1、COL1A2、FN1、COL2A1、COL5A1。在GSE57218芯片中,COL1A1、COL1A2、FN1、COL2A1、COL5A1均是細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用(ECM receptor interaction,ECM)、黏附斑激酶信號(hào)(focal adhesion,FAK)通路的核心基因(圖6C、6D)。

2.6 基因定位分析將Cytoscape預(yù)測的核心基因、OMIM篩選的核心基因及信號(hào)通路核心基因?qū)隑ioGPS數(shù)據(jù)庫,篩選標(biāo)準(zhǔn):(1)組織特異性表達(dá)水平>中位數(shù)的10倍;(2)第二高表達(dá)水平不到最高水平的三分之一。共篩選出2個(gè)有組織特異性的Hub基因,PLOD1、COL5A2在平滑肌細(xì)胞中特異性表達(dá)(圖7)。

圖7 靶向基因組織定位分析

2.7 靶向基因篩選根據(jù)Cytoscape預(yù)測的核心基因中,COL5A2、PLOD1為組織特異性基因;MOCDE模塊與OMIM交集基因?yàn)镃OL1A1、COL1A2、FN1、COL2A1、COL5A1;GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)COL1A1、COL1A2、FN1、COL2A1、COL5A1為ECM受體相互作用、黏附斑激酶信號(hào)通路核心基因。綜上,共篩選出7個(gè)與OA發(fā)病密切相關(guān)的Hub基因及2條信號(hào)傳導(dǎo)通路。

3 討 論

OA最具特征的病理變化為軟骨細(xì)胞死亡、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解和軟骨下骨重塑。研究發(fā)現(xiàn)[6-7],ECM由多種大分子組成,包括纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白和蛋白多糖;ECM降解可能是導(dǎo)致OA的核心機(jī)制:一方面,軟骨的ECM由膠原纖維和大蛋白多糖組成,可作為保護(hù)性支架抵抗軟骨的彈性和剪切力,還可通過基質(zhì)細(xì)胞相互作用調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的行為,軟骨細(xì)胞的異常調(diào)節(jié)以及組織降解和形成之間的不平衡導(dǎo)致軟骨ECM進(jìn)行性破壞;ECM作為骨組織框架,對(duì)維持骨組織穩(wěn)定及骨重塑有重要意義,若骨細(xì)胞等無法黏附至骨基質(zhì)上,則骨細(xì)胞無法正?；罨踔了劳鯷8-9];另一方面[10-12],骨細(xì)胞與ECM底物連接疏松也可導(dǎo)致OA的發(fā)生,FAK為黏附斑激酶信號(hào)通路,該通路由整合素β1受體介導(dǎo),當(dāng)整合素β1識(shí)別ECM蛋白,順勢激活下游FAK信號(hào)通路,后者可啟動(dòng)磷酸化,對(duì)維持骨細(xì)胞黏附有重要意義。

Ⅰ型膠原蛋白由COL1A1、COL1A2基因共同編碼,兩者具有相似的非螺旋末端肽-端肽的三螺旋結(jié)構(gòu),三螺旋由兩條pro-α1(Ⅰ)-膠原鏈和一條pro-α2(Ⅰ)-膠原鏈折疊,具有骨基質(zhì)生成、抵抗形變的功能[13-14]。Ⅰ型膠原蛋白是一種具有纖維化組織蛋白質(zhì)特征的組織結(jié)構(gòu),存在于大多數(shù)結(jié)締組織中,并且在骨骼、角膜、真皮和肌腱中含量豐富。上述兩個(gè)基因的突變與Ⅰ～Ⅳ型成骨不全癥、ⅦA型Ehlers-Danlos綜合征、經(jīng)典型Ehlers-Danlos綜合征、Caffey病和特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥有關(guān)。正常軟骨組織中含有大量的Ⅱ型膠原蛋白,這種蛋白纖維可為關(guān)節(jié)提供正常功能所必需的生物力學(xué)特性,為軟骨提供承載能力;Ⅰ型膠原纖維主要介導(dǎo)軟骨損傷后修復(fù),修復(fù)后的軟骨可形成膠原蛋白網(wǎng)絡(luò),為骨組織提供抗拉性,但這種膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)內(nèi)無血管網(wǎng)絡(luò),不能為軟骨再生提供微環(huán)境。因此,軟骨幾乎無再生能力[15]。

COL5A1、COL5A2基因編碼V型膠原蛋白的alpha-1(Ⅴ)鏈,Ⅴ型膠原蛋白是一種較微小的纖維網(wǎng)狀膠原蛋白,對(duì)調(diào)節(jié)體內(nèi)膠原蛋白的大小及構(gòu)型至關(guān)重要,COL5A1、COL5A2基因可以調(diào)節(jié)由Ⅰ型和Ⅴ型膠原蛋白組成的異型纖維組裝。COL5A1、COL5A2基因缺失會(huì)導(dǎo)致纖維組織生成不良、拉伸強(qiáng)度和結(jié)締組織剛度降低等[16]。此外,許多研究表明,COL5A1與Ehlers-Danlos綜合征、前交叉韌帶斷裂、腕管綜合征及膝關(guān)節(jié)韌帶變性相關(guān)。關(guān)節(jié)過度屈伸、韌帶斷裂間接加劇軟骨組織的磨損,COL5A1基因可使Ⅴ型膠原蛋白過表達(dá),改變韌帶、肌腱的機(jī)械性能,從而保護(hù)軟骨免遭磨損。

COL3A1基因編碼Ⅲ型膠原蛋白的原α1鏈,這是一種纖維狀膠原蛋白,常與Ⅰ型膠原纖維組裝成異型纖維蛋白,并被證明與膠原蛋白交聯(lián)、皮質(zhì)骨骼發(fā)育和骨修復(fù)明顯相關(guān)。在膝關(guān)節(jié)中,關(guān)節(jié)軟骨提供壓縮承載,通過多孔黏彈性能量耗散和潤滑吸收沖擊[17-19]。這些功能由ECM賦予,ECM是由眾多膠原纖維網(wǎng)狀蛋白組成,我們通過KEGG分析發(fā)現(xiàn),DEmiRNAs主要富集在ECM-受體相互作用通路,與既往研究一致。PLOD1是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池的膜結(jié)合同源二聚體蛋白,PLOD1中羥基基團(tuán)是膠原蛋白碳水化合物的附著位點(diǎn),特異性作用于端肽賴氨酰羥化酶,促進(jìn)分子交聯(lián)。據(jù)報(bào)道[20],PLOD1可促進(jìn)ECM分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和成熟,我們的分析發(fā)現(xiàn),OA發(fā)展與ECM-受體相互作用通路密切相關(guān),而PLOD1作為OA的核心基因,其在OA發(fā)病的機(jī)制中相互促進(jìn),這一結(jié)論與COHEN等的結(jié)論相似。

COL2A1是一種在軟骨中發(fā)現(xiàn)的纖維狀膠原蛋白。該基因的突變與軟骨發(fā)育不良、早發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎、Langer-Saldino軟骨發(fā)育等疾病有關(guān)。COL2A1被證實(shí)作為啟動(dòng)子/增強(qiáng)子在肢體早期發(fā)育中起重要作用[21],這種相關(guān)性主要表現(xiàn)在促進(jìn)骨骼祖細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檐浌羌?xì)胞;OA發(fā)病的主要機(jī)制就包括骨軟骨發(fā)育不良,若骨骼祖細(xì)胞大量轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞或可逆轉(zhuǎn)這一機(jī)制。

綜上所述,本研究分析得到的核心基因和信號(hào)通路為研究OA的發(fā)生機(jī)制和藥物治療提供了新的思路,或?yàn)镺A藥物研發(fā)提供作用靶點(diǎn)。然而,本研究所得到的結(jié)論尚需通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。