王 錦，夏霜莉，楊 媛，代 蓉#（.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，昆明 650500；.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)中心，昆明 65003）

神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）主要包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）、細(xì)胞外基質(zhì)等，各組成間相互協(xié)調(diào)，共同維持腦組織內(nèi)環(huán)境的整體穩(wěn)態(tài)。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemic reperfusion injury，CIRI）發(fā)生后，BMECs、膠質(zhì)細(xì)胞被激活，血腦屏障通透性發(fā)生改變，神經(jīng)元受損凋亡，導(dǎo)致NVU的穩(wěn)態(tài)失衡，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)功能[1―2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在NVU微環(huán)境中，BMECs不僅可為神經(jīng)元提供突觸間信號(hào)傳遞時(shí)所需要的能量，還可在CIRI情況下通過釋放腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）調(diào)控神經(jīng)元活性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[3―4]。因此，通過藥物干預(yù)加強(qiáng)BMECs 與神經(jīng)元之間的信號(hào)聯(lián)系以促進(jìn)機(jī)體自身的內(nèi)源性修復(fù)，對(duì)CIRI的治療具有重要的意義。

本課題組前期研究表明，天麻主要活性成分3，4-二羥基苯甲醛（3，4-dihydroxybenzaldehyde，3，4-DD）具有減輕大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型大鼠腦損傷，保護(hù)受損神經(jīng)元的作用[5―7]，但作用機(jī)制尚不明確。目前常以神經(jīng)元和BMECs 共培養(yǎng)模擬NVU[8]，但是由于原代神經(jīng)元生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，無法進(jìn)行傳代，故常用中分化型的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞PC12 代替神經(jīng)元進(jìn)行研究[9]。基于此，本研究采用Transwell小室建立BMECs-PC12共培養(yǎng)氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧（oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）損傷模型，探討3，4-DD 對(duì)CIRI 的改善作用及機(jī)制，以期為CIRI的治療藥物開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

3111 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、QuantStudio 5 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；Ti-S 型倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司；Infinite M200 PRO型酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司；ERS-2型細(xì)胞電阻儀、Transwell小室（孔徑0.4 μm，有效膜面積0.33 cm2）購自美國(guó)Millipore公司。

1.2 主要藥品與試劑

3，4-DD（批號(hào)256775）購于北京百靈威科技有限公司；丁苯酞（NBP，批號(hào)118170230）購于石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（批號(hào)AGH1533A）購自日本Takara公司；0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（批號(hào)分別為03-050-1A、04-01-1A）購自以色列Biological Industries公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（批號(hào)033100g）購自美國(guó)Amresco 公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基、DMEM/RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號(hào)分別為CLL330500B、58903）購自美國(guó)Gibco公司；兔抗Ⅷ因子單克隆抗體（批號(hào)NB10091761Cy）購自美國(guó)Novus Biologicals 公司；山羊抗兔熒光單克隆抗體（二抗，批號(hào)C2306）購自美國(guó)Sigma公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測(cè)試盒（批號(hào)QS1001）購自南京建成生物工程研究所；BDNF 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)K2401874）購自武漢華美生物工程有限公司。酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）、磷脂酶c-γ（phospholipase c-γ，Plc-γ）、微管蛋白2（microtubule associated protein-2，Map-2）、神經(jīng)調(diào)節(jié)素43（growth associated protein-43，GAP-43）的引物由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成，具體信息見表1。

1.3 細(xì)胞

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞PC12購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，將其以DMEM/RPMI 1640 培養(yǎng)基（含10% FBS，40 U/mL 青鏈霉素雙抗）于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF 級(jí)SD 大鼠，體重250～300 g，購自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（遼）2015-0001。取成年雌鼠1 只、雄鼠2只進(jìn)行合籠飼養(yǎng)，于第2天觀察鼠籠底層是否有陰栓，于見到陰栓之日將雌鼠與雄鼠分開飼養(yǎng)，等待雌鼠生產(chǎn)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～24 ℃，濕度50%～60%，12 h 明暗交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)為R-06202003）。

2 方法

2.1 原代BMECs分離、培養(yǎng)和鑒定

取出生7 d 的乳鼠大腦皮質(zhì)，用無菌組織剪將皮層組織剪碎，1 000 r/min 離心3 min；棄除上清液后按1∶1的體積比加入BSA 溶液，并充分吹打混勻，2 500 r/min離心8 min；棄去上清液，收集管底微血管段沉淀，然后接種于DMEM/F12 培養(yǎng)基（含20% FBS、40 U/mL 青鏈霉素雙抗）的明膠包被培養(yǎng)瓶中，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；24 h 后更換新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后每2 d換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)90%，進(jìn)行傳代純化，取傳至第3代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。取部分BMECs以Ⅷ因子抗體染色后在熒光顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)Ⅷ因子陽性表達(dá)（呈紅色）時(shí)，則表明原代BMECs培養(yǎng)成功。

2.2 BMECs-PC12 共培養(yǎng)體系構(gòu)建和OGD/R 損傷模型的建立

分別取PC12 細(xì)胞和BMECs，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2 次，加入0.25%胰酶置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化5 min；當(dāng)80%細(xì)胞收縮變圓并漂浮時(shí)，向PC12 細(xì)胞中立即加入含10% FBS 的DMEM/RPMI 1640 培養(yǎng)基終止消化，向BMECs 中加入含20% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化；將兩種細(xì)胞以1 000 r/min離心5 min，收集管底細(xì)胞沉淀，加入培養(yǎng)基重懸，調(diào)整PC12 細(xì)胞、BMECs 的密度分別至1.0×106、4.0×105個(gè)/mL。將PC12 細(xì)胞接種于6 孔板中，待其生長(zhǎng)1 d 后用于共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。將BMECs接種于已提前包被好明膠的Transwell小室內(nèi)側(cè)，將插入室放入已接種PC12細(xì)胞的6孔板中共培養(yǎng)2 d。當(dāng)兩種細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)90%時(shí)，檢測(cè)BMECs-PC12 共培養(yǎng)體系的跨膜電阻（transendothelial electronic resistance，TEER）、PC12 細(xì)胞中LDH 活性；當(dāng)BMECs-PC12 共培養(yǎng)體系的TEER 和其中PC12 細(xì)胞中LDH 活性相較于兩種細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)顯著升高時(shí)，則表明BMECs-PC12共培養(yǎng)體系構(gòu)建成功[10]。

將上述BMECs-PC12共培養(yǎng)體系取出，棄掉原培養(yǎng)基，以PBS清洗細(xì)胞后，換入無糖無血清培養(yǎng)基，置于含1% O2的37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行氧糖剝奪；8 h后取出，棄去無糖無血清培養(yǎng)基，換入新鮮的完全培養(yǎng)基，置于含5% CO2的37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行復(fù)糖復(fù)氧10 h；復(fù)糖復(fù)氧結(jié)束后，檢測(cè)BMECs-PC12共培養(yǎng)體系4 h滲漏液面差、TEER、PC12 細(xì)胞中LDH 活性，當(dāng)4 h 滲漏液面差增大，TEER、PC12細(xì)胞中LDH活性降低時(shí)，表明BMECs-PC12共培養(yǎng)OGD/R損傷模型構(gòu)建成功[10]。

2.3 分組與給藥

將BMECs-PC12 共培養(yǎng)體系分為對(duì)照組、模型組、NBP 組（陽性對(duì)照組，0.1 mmol/L，濃度參考文獻(xiàn)[11]設(shè)置）、3，4-DD組（0.1 μmol/L，濃度依據(jù)前期研究[7]設(shè)置），每組均設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。NBP組和3，4-DD組給予相應(yīng)藥物干預(yù)Transwell 小室內(nèi)側(cè)BMECs 24 h，對(duì)照組和模型組以等量培養(yǎng)基代替，然后除對(duì)照組外，其余各組均按“2.2”項(xiàng)下方法復(fù)制BMECs-PC12 共培養(yǎng)OGD/R 損傷模型。

2.4 BMECs-PC12 共培養(yǎng)體系的TEER 和PC12 細(xì)胞中LDH活性的檢測(cè)

氧糖剝奪8 h/復(fù)糖復(fù)氧10 h 后，采用ERS-2 型電阻儀檢測(cè)BMECs-PC12 共培養(yǎng)體系的TEER，取平均值。上述檢測(cè)結(jié)束后，取體系中部分PC12細(xì)胞進(jìn)行裂解，然后離心取上清液，按試劑盒說明書方法操作，測(cè)定PC12細(xì)胞中LDH活性。

2.5 PC12細(xì)胞中BDNF水平的檢測(cè)

“2.4”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取板底PC12細(xì)胞的培養(yǎng)液，然后按ELISA 試劑盒說明書方法操作，檢測(cè)PC12 細(xì)胞中BDNF水平。

2.6 PC12 細(xì)胞中TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

采用熒光定量PCR 法進(jìn)行檢測(cè)。“2.4”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取部分PC12細(xì)胞進(jìn)行裂解，然后用相應(yīng)試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA 進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：50 ℃預(yù)處理2 min；95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸7 min，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法檢測(cè)PC12細(xì)胞中TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA的表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)，組間兩兩比較采用Dunnett’st檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 原代BMECs的分離鑒定結(jié)果

結(jié)果顯示，顯微鏡下Ⅷ因子呈紅色，原代BMECs培養(yǎng)成功。結(jié)果見圖1。

圖1 原代BMECs的分離鑒定結(jié)果

3.2 3，4-DD 對(duì)共培養(yǎng)體系OGD/R 損傷模型的TEER以及PC12細(xì)胞中LDH活性及BDNF水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組BMECs-PC12共培養(yǎng)體系的TEER 以及PC12 細(xì)胞中LDH 活性和BDNF 水平均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，NBP 組、3，4-DD 組BMECs-PC12 共培養(yǎng)體系中上述指標(biāo)均顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組共培養(yǎng)體系的TEER以及PC12細(xì)胞中LDH活性和BDNF水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝4）

表2 各組共培養(yǎng)體系的TEER以及PC12細(xì)胞中LDH活性和BDNF水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝4）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

組別對(duì)照組模型組NBP組3，4-DD組TEER/（Ω·cm2）364.8±29.68 235.3±26.27a 289.3±11.44b 349.8±18.79c LDH活性/（U/g）3.00±0.30 2.20±0.22a 2.73±0.17b 3.18±0.22c BDNF水平/（ng/L）4.29±0.43 2.52±0.47a 4.38±0.49c 3.97±0.55c

3.3 3，4-DD對(duì)共培養(yǎng)體系OGD/R損傷模型PC12細(xì)胞中TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組PC12 細(xì)胞中TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，NBP 組、3，4-DD 組PC12 細(xì)胞中上述指標(biāo)表達(dá)水平均進(jìn)一步顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 PC12細(xì)胞中TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝4）

表3 PC12細(xì)胞中TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝4）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組NBP組3，4-DD組TrkB mRNA 1.00±0.00 8.18±1.23a 13.63±1.60b 11.55±1.85c Plc-γ mRNA 1.00±0.00 8.16±1.21a 14.73±0.88b 12.61±2.17b Map-2 mRNA 1.00±0.00 8.83±0.28a 12.38±1.23b 10.35±0.82c GAP-43 mRNA 1.00±0.00 21.19±1.29a 26.83±1.45b 26.05±1.68b

4 討論

CIRI的發(fā)生是由NVU中多種細(xì)胞相互作用導(dǎo)致的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可引起神經(jīng)炎癥的發(fā)生、BMECs間緊密連接破壞、腦微環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào)、神經(jīng)功能受損。BMECs是血腦屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其產(chǎn)生的BDNF 可作用于軸突，為神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)[12]。TEER是評(píng)價(jià)緊密連接功能和血腦屏障細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)的方法[13]；LDH 存在于所有細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞膜損傷時(shí)可快速釋放至細(xì)胞培養(yǎng)液中，因此常作為衡量細(xì)胞是否完整的重要指標(biāo)[14]。本研究結(jié)果顯示，BMECs-PC12 共培養(yǎng)體系經(jīng)OGD/R 后，TEER、PC12 細(xì)胞中LDH活性和BDNF水平均降低，提示BMECs-PC12共培養(yǎng)體系的屏障功能被破壞，PC12細(xì)胞受損；經(jīng)3，4-DD干預(yù)后，共培養(yǎng)體系的TEER以及PC12細(xì)胞中LDH活性和BDNF水平均升高，表明3，4-DD可減輕BMECs-PC12 共培養(yǎng)體系的OGD/R 損傷，并促進(jìn)BMECs、PC12細(xì)胞生成并釋放BDNF。

BMECs的旁分泌功能可通過調(diào)控BDNF/TrkB信號(hào)通路，增加神經(jīng)元細(xì)胞膜上Plc-γ、Map-2、GAP-43 蛋白的表達(dá)，其中Plc-γ 可介導(dǎo)蛋白激酶C 調(diào)節(jié)突觸可塑性[15]；Map-2是組成神經(jīng)元細(xì)胞骨架的重要組成部分，其表達(dá)水平能反映神經(jīng)元樹突的破壞情況[16]；GAP-43可參與神經(jīng)細(xì)胞外生長(zhǎng)及突觸發(fā)育形成和神經(jīng)細(xì)胞再生，能調(diào)節(jié)軸突的延伸作用，增強(qiáng)與G蛋白偶聯(lián)的受體的轉(zhuǎn)運(yùn)作用[17]。促進(jìn)Plc-γ、Map-2、GAP-43 的表達(dá)可維持神經(jīng)元軸突和樹突的生長(zhǎng)，恢復(fù)神經(jīng)元間信號(hào)的傳導(dǎo)，減輕神經(jīng)元的損傷[18]。本研究結(jié)果顯示，BMECs-PC12 共培養(yǎng)體系經(jīng)OGD/R 后，PC12 細(xì)胞中TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA 表達(dá)水平升高，提示共培養(yǎng)體系在受到OGD/R 刺激后，細(xì)胞自身觸發(fā)內(nèi)源性修復(fù)作用；經(jīng)3，4-DD干預(yù)后，PC12細(xì)胞中上述指標(biāo)表達(dá)水平均進(jìn)一步升高，提示3，4-DD 可通過作用于Transwell 小室上層BMECs，促進(jìn)BDNF 分泌，啟動(dòng)BDNF/TrkB 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)PC12的突觸可塑性，增強(qiáng)BMECs與神經(jīng)元之間的信號(hào)聯(lián)系以促進(jìn)內(nèi)源性修復(fù)，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元。

綜上所述，3，4-DD 可通過作用于BMECs 減輕神經(jīng)元OGD/R 損傷，其作用機(jī)制可能與激活BDNF/TrkB 信號(hào)通路有關(guān)。由于本實(shí)驗(yàn)無法充分反映細(xì)胞間和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，后續(xù)還需要觀察多個(gè)細(xì)胞之間的相互作用，進(jìn)一步探討3，4-DD保護(hù)神經(jīng)元的作用機(jī)制。