王依婷，彭偉文 ，王珠強，黃梨婷（廣州中醫(yī)藥大學附屬中山中醫(yī)院，廣東 中山 528400）

肺纖維化是由多種原因引起的肺部損傷，前期表現(xiàn)為肺泡上皮細胞損傷、成纖維細胞增殖、炎性細胞浸潤等，后期發(fā)展為肺組織過度修復，伴隨成纖維細胞大量增殖、細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）異常沉積，最終發(fā)展為肺纖維化[1]。其常見的致病因素有長期吸煙、環(huán)境污染和慢性支氣管炎等。目前美國FDA批準治療肺纖維化的藥物有吡非尼酮與尼達尼布，這兩種藥物雖可顯著減緩肺功能的退化，但是均有嚴重的不良反應，仍未達到良好的治療效果[2]，所以抗肺纖維化藥物近年來逐漸成為研究的熱點。

黃酮類成分幾乎存在于所有綠色植物中，該類化合物按結構特點可分為黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮、二氫異黃酮、查爾酮、橙酮、花色素等多個類型。隨著研究的不斷深入，利用黃酮類成分治療肺纖維化的探索逐漸增多，有相當數(shù)量的黃酮類成分在研究中表現(xiàn)出對肺纖維化的防治作用，其可通過多種信號通路來調(diào)控不同細胞因子的水平，進而減輕炎癥反應，抑制氧化應激、成纖維細胞分化、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），影響細胞自噬、凋亡等，從而抑制肺纖維化的發(fā)展。本文對近5年國內(nèi)外報道的具有抗肺纖維化作用的黃酮類成分進行整理，并對其作用機制進行歸納總結，以期為黃酮類抗肺纖維化藥物的研發(fā)奠定理論基礎。

1 黃酮類成分抗肺纖維化的作用機制

1.1 抑制成纖維細胞分化

成纖維細胞是肺纖維化的關鍵效應細胞，受細胞因子和生長因子刺激后增殖，并分化為肌成纖維細胞，導致 ECM 的積累，從而形成肺纖維化[3]。相關研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素能夠抑制小鼠肺成纖維細胞的遷移，降低α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、纖維連接蛋白（fibronectin）、Ⅰ型膠原（collagen-Ⅰ）、磷酸化的細胞信號轉(zhuǎn)導分子Smad 2/3（phosphorylated Smad 2/3，p-Smad 2/3）的表達水平，通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad 信號通路，抑制成纖維細胞活化及ECM 生成[4]。Miao 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，桑色素對TGF-β1誘導的小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3 模型及博來霉素（bleomycin，BLM）誘導的動物模型均有保護作用，能通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ），抑制谷氨酰胺分解，干預谷氨酰胺代謝產(chǎn)物2-HG-組蛋白賴氨酸特異性脫甲基酶4（2-HG-KDM4）軸，從而增強含DEP 結構域的雷帕霉素靶蛋白相互作用蛋白的穩(wěn)定性，進而阻止成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抗肺纖維化的作用。在用BLM 誘導的肺癌人肺泡基底上皮細胞A549 體外肺纖維化模型中，漆黃素可提高磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylated AMP-activated protein kinase，p-AMPK）的水平，降低磷酸化p65（phosphorylated p65，p-p65）、白介素1β（interlenkin 1β，IL-1β）、TGF-β、羥脯氨酸、IL-6 的水平，激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NFκB），減緩肺泡上皮細胞衰老，減少成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化及膠原沉積[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)，甜橙黃酮能夠降低平滑肌肌動蛋白α2、磷酸化糖原合成酶激酶3β、周期素D1、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的表達水平，通過靶向糖原合成酶激酶3β 阻斷Wnt/β-catenin 信號通路，從而抑制成纖維細胞的增殖和分化，抑制肺部纖維化的進展[7]。由此可知，二氫楊梅素、桑色素、漆黃素、甜橙黃酮等黃酮類成分能夠通過不同的信號通路抑制成纖維細胞分化，進而發(fā)揮抗肺纖維化的作用。

1.2 抗炎

炎癥反應在肺纖維化過程中起著關鍵作用，能激發(fā)機體的修復和防御反應。在長期損傷刺激下，受損細胞釋放促炎和促纖維化因子，如TGF-β1和IL-6等，這些因子會招募更多炎癥細胞聚集在損傷部位，導致免疫紊亂和過度修復[8]。葉倩云等[9]以PM2.5誘導的肺纖維化大鼠為動物模型，觀察阿爾泰金蓮花總黃酮對肺纖維化的保護作用，結果發(fā)現(xiàn)，阿爾泰金蓮花總黃酮能夠降低白細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的含量，同時減少腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、IL-1β 等炎性因子的釋放，抑制肺組織炎癥反應，減輕肺損傷和膠原沉積。陳宏等[10]研究發(fā)現(xiàn)，橘皮苷能降低血清中TGF-β1、TNF-α 的水平，升高血清中炎癥因子干擾素γ的水平，同時降低氧化應激指標髓過氧化物酶、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的水平，下調(diào)磷酸化蛋白激酶B、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinases 1/2，p-ERK 1/2）的蛋白表達水平，推測橘皮苷具有抗氧化應激的作用，且還可能通過調(diào)控蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）及ERK相關信號通路發(fā)揮抗炎作用，從而減輕肺損傷，發(fā)揮抗肺纖維化的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，蒙花苷對BLM誘導的肺纖維化小鼠體內(nèi)模型及TGF-β1誘導的人胚肺成纖維細胞HFL1體外模型有顯著的抗肺纖維化作用，能降低TNF-α、TGF-β1、IL-6、collagen-Ⅰ和p-ERK 1/2的表達水平，推測該成分是通過調(diào)控ERK及炎癥相關信號通路來發(fā)揮抗肺纖維化作用的[11]。由此可知，阿爾泰金蓮花總黃酮、橘皮苷、蒙花苷等黃酮類成分可通過降低炎癥因子如TNF-α、IL-6的表達水平來發(fā)揮抗炎作用，進而抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

1.3 抑制EMT

EMT是上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程，被認為是肺纖維化發(fā)病過程中重要的發(fā)病機制。反復的損傷與炎癥過程會導致纖維母細胞聚集，從而導致上皮細胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞，進而產(chǎn)生大量的ECM 并破壞肺組織結構，引發(fā)進行性肺纖維化[12]。Yang等[13]通過體外培養(yǎng)A549 細胞研究黃芪總黃酮對EMT 的影響，結果顯示，黃芪總黃酮可以抑制A549細胞遷移，降低間充質(zhì)干細胞標記物波形蛋白（vimentin）、β-catenin及Smad信號通路相關蛋白p-Smad 2/3、p-p65-NF-κB 的水平，升高上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的水平，通過抑制EMT 及Smad 信號通路來發(fā)揮抗肺纖維化的作用。Peng 等[14]研究表明，黃芩苷能通過抑制IL-1β、IL-18 的表達從而抑制TGF-β1的釋放進而影響EMT，還能通過抑制NF-κB/核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）信號通路介導EMT，使fibronectin、vimentin、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）、MMP-9 的表達水平降低，E-cadherin的表達水平升高，證實了黃芩苷可通過抑制NF-κB/NLRP3 的信號轉(zhuǎn)導阻止EMT 過程，發(fā)揮抗肺纖維化的作用。盧林明等[15]發(fā)現(xiàn)白楊素可升高緊密連接蛋白和E-cadherin 的mRNA 和蛋白表達水平，降低vimentin和α-SMA的mRNA和蛋白表達水平，抑制核因子κB 抑制因子α（recombinant inhibitory subunit of NF Kappa B Alpha，IκBα）的表達水平，同時還能下調(diào)胞漿與胞核內(nèi)NF-κB的蛋白表達水平，抑制NF-κB p65的核轉(zhuǎn)移，在體外細胞實驗中也得出了相同的結果，由此推測白楊素可能通過逆轉(zhuǎn)Ⅱ型肺泡上皮細胞發(fā)生的EMT來發(fā)揮抗肺纖維化的作用。有研究表明，異甘草素可以降低調(diào)控EMT 過程的重要轉(zhuǎn)錄因子蝸牛蛋白、扭曲蛋白、鋅指蛋白及p-ERK/ERK的水平，由此推測異甘草素可能通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶/ERK信號通路來抑制A549 細胞的EMT 進程，進而改善肺纖維化[16]。另有研究表明，毛蕊異黃酮能夠通過抑制AKT/糖原合酶激酶3β/β-catenin 信號通路及微小RNA-375/Yes 相關蛋白1 信號通路抑制EMT，進而抑制肺纖維化[17―18]。由此可知，黃芪總黃酮、黃芩苷、白楊素、異甘草素、毛蕊異黃酮等黃酮類成分可通過多通路、多靶點抑制EMT，并能降低vimentin 的表達水平，升高E-cadherin 的表達水平，進而抑制肺纖維化。

1.4 抑制氧化應激

氧化應激是機體氧化物與抗氧化物之間失衡而造成的應激狀態(tài)。因為肺暴露于比其他組織相對更高的氧張力下，所以對氧化應激特別敏感。外源氧化劑和污染物如煙霧等會增加氧化產(chǎn)物，并激活炎性細胞產(chǎn)生自由基如活性氧（reactive oxygen species，ROS），當過量的ROS 存在于組織或細胞中，可以誘發(fā)氧化應激，從而造成不同程度的肺損傷[19―20]。李嘉斌等[21]研究發(fā)現(xiàn)，荔枝核總黃酮對BLM誘導的小鼠肺纖維化模型有顯著的保護作用，能明顯提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低MDA、ROS 水平，且可升高具有抑制肺纖維化活性的PPARγ的含量，從而通過減緩氧化應激對肺部的損傷來發(fā)揮抗肺纖維化的作用。地奧司明是一種存在于柑橘類和橄欖葉中的糖基化多酚類黃酮，研究發(fā)現(xiàn)其能降低MDA水平，提高谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過氧化氫酶水平，進而抑制氧化應激過程，發(fā)揮抗肺纖維化的作用[22]。Ren 等[23]分別用BLM 和TGF-β1誘導建立肺纖維化體內(nèi)、外模型，發(fā)現(xiàn)銀杏素能降低膠原纖維中的關鍵調(diào)節(jié)劑賴氨酰氧化酶樣蛋白2、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（recombinant nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）的表達水平，減少ROS 的產(chǎn)生，同時能升高p-AMPK 的蛋白表達水平，表明銀杏素可能通過激活AMPK 信號通路來抑制肺成纖維細胞的活化和氧化應激，從而減少肺組織中ECM的沉積。任維鑫等[24]發(fā)現(xiàn)水飛薊賓能夠通過上調(diào)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9/骨成型蛋白受體2/Smad 信號通路來降低MDA 水平，提高SOD、谷胱甘肽過氧化物酶水平及總抗氧化能力，從而抑制氧化應激，進而減輕肺損傷。Zhou等[25]發(fā)現(xiàn)橙皮苷可通過抑制TGF-β1/Smad3/AMPK 信號通路和IκBα/NF-κB 信號通路，促進氧化應激標志物核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）的表達，以抑制肺纖維化過程中的氧化應激。由此可知，荔枝核總黃酮、地奧司明、銀杏素、水飛薊賓、橙皮苷等黃酮類成分能通過多通路抑制氧化應激，并降低ROS、MDA 的含量，升高SOD的水平，進而抑制肺纖維化。

1.5 影響自噬

自噬是一種進化保守的細胞自我保護機制，能夠凈化生物體自身多余或受損的細胞器，這一過程有助于維持蛋白質(zhì)代謝平衡及細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。自噬缺陷在各種纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能下調(diào)肺纖維化大鼠NOX4、p62蛋白表達水平，降低IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8的含量，由此推測槲皮素在減輕炎癥反應的同時也能抑制NOX4-p62信號通路，激活自噬，從而發(fā)揮抗肺纖維化的作用[27]。另有報道稱黃芩苷能促進A549 細胞中微管相關蛋白1 輕鏈3B（microtubule-associated-protein light-chain-3B，LC3B）Ⅰ型向Ⅱ型的轉(zhuǎn)化，減少p62蛋白積累，同時升高自噬相關基因ATG3、ATG5、ATG7、ATG12的表達水平；通過轉(zhuǎn)染Ad-mCherry-GFP-LC3B 雙熒光標記腺病毒來追蹤自噬過程，發(fā)現(xiàn)給予黃芩苷干預后，A549細胞紅色和黃色斑點數(shù)量增多，自噬能力被激活，表明黃芩苷能夠提高TGF-β1誘導的A549 細胞的自噬流水平，從而抑制肺纖維化[28]。肺泡巨噬細胞（alveolar macrophages，AMs）是肺組織中主要的先天免疫細胞，在肺纖維化修復和體內(nèi)平衡中發(fā)揮著重要的作用，然而過度的AMs自噬會加重肺纖維化的病程。白輝輝等[29]發(fā)現(xiàn)芹菜素能夠減少AMs自噬體數(shù)量，降低AMs中Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）的表達水平，同時顯著降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，升高p62 蛋白表達水平，由此推測芹菜素的作用機制可能與抑制TLR4-TNF 受體關聯(lián)因子6（recombinant TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）激活，進而改善AMs自噬過度有關。由此可知，槲皮素、黃芩苷能夠通過降低p62的表達水平、促進LC3BⅠ向LC3BⅡ的轉(zhuǎn)化來激活自噬，進而抑制肺纖維化；而芹菜素能夠通過升高p62的表達水平、減少自噬體的數(shù)量來抑制自噬，進而抑制肺纖維化。

1.6 調(diào)控細胞凋亡

細胞凋亡是組織穩(wěn)態(tài)發(fā)展和維持的重要生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，在肺纖維化患者中，肺泡上皮細胞易于凋亡，而成纖維細胞/肌成纖維細胞具有凋亡抵抗性[30]，說明抑制肺泡上皮細胞的凋亡和促進成纖維細胞的凋亡有助于防治肺纖維化。Li等[31]研究發(fā)現(xiàn)，鐮形棘豆總黃酮可使肺纖維化大鼠肺組織中p-Smad 2/3 的蛋白表達水平降低，Smad7的蛋白表達水平升高，膠原沉積減少，同時誘導細胞凋亡，減少ECM 的沉積；此外，加入不同濃度的鐮形棘豆總黃酮藥物血清培養(yǎng)人胚肺成纖維細胞HFL-1亦可觀察到相應的藥效，其后續(xù)研究結果還發(fā)現(xiàn)鐮形棘豆總黃酮可使細胞骨架中的微絲和微管紊亂，減少粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量，由此推測鐮形棘豆總黃酮可能是通過破壞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的骨架來誘導細胞凋亡并影響TGF-β/Samd 信號通路從而發(fā)揮抗肺纖維化的作用。Hohmann等[32]建立了肺成纖維細胞的衰老模型，發(fā)現(xiàn)肺纖維化患者的肺成纖維細胞比正常的肺成纖維細胞更容易衰老，同時發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠促進凋亡相關因子配體重組蛋白的表達，并抑制AKT的激活，從而促進成纖維細胞的凋亡，發(fā)揮抗肺纖維化的作用。Zhao等[33]發(fā)現(xiàn)黃芩苷能上調(diào)抗凋亡蛋白B 淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達水平，下調(diào)促凋亡蛋白Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X，Bax）及凋亡過程中最主要的終末剪切酶胱天蛋白酶3（caspase-3）的表達水平，通過鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴激酶Ⅱ和AKT 途徑逆轉(zhuǎn)BLM 誘導的肺組織凋亡和肺纖維化。另有研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮能夠降低Bax、p62、MDA、天冬酰胺內(nèi)肽酶的水平，提高SOD、Nrf2、HO-1、Bcl-2、X 連鎖凋亡抑制蛋白的水平，抑制氧化應激，激活Nrf2/HO-1 信號通路，降低肺組織中的細胞凋亡水平，從而發(fā)揮抗肺纖維化的作用[18]。Yuan 等[34]構建了二氧化硅誘導的人支氣管上皮細胞HBE模型，發(fā)現(xiàn)二氫槲皮素能夠升高谷胱甘肽過氧化物酶4、GSH、鐵蛋白重鏈1 的水平，降低Fe、ROS、MDA、LC3 的水平，使用特異性鐵死亡誘導劑時會逆轉(zhuǎn)結果，推測其作用機制可能是通過抑制鐵蛋白吞噬來抑制細胞凋亡，進而發(fā)揮抗肺纖維化的作用。由此可知，鐮形棘豆總黃酮、槲皮素能夠誘導肺成纖維細胞的凋亡，而黃芩苷、毛蕊異黃酮、二氫槲皮素能夠抑制細胞凋亡，進而抑制肺纖維化。

1.7 抑制細胞焦亡

細胞焦亡是一種特殊的程序性細胞死亡方式，其主要由NLRP3 等炎癥小體的活化及其下游效應因子caspase1 的激活介導。NLRP3 炎癥小體被激活后產(chǎn)生IL-1β和IL-18，引起細胞焦亡，并參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程[35]。蔣怡芳等[36]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素能降低肺組織中炎癥因子IL-18 的水平，同時降低NLRP3 相關蛋白Asc型氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白1（recombinant Asc type amino acid transporter 1，ASC1）和caspase-1的mRNA及蛋白表達水平，表明柚皮素能通過抑制NLRP3炎癥小體活化，減輕肺部炎癥反應，抑制細胞焦亡，從而發(fā)揮抗肺纖維化作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能夠降低p-p65-NF-κB、NLRP3、caspase-1、ASC、Gasdermin D 蛋白（GSDMD）N端片段、IL-1β、IL-18 的水平，升高IκBα 的水平，抑制NF-κB/NLRP3 的信號轉(zhuǎn)導，發(fā)揮抗細胞焦亡的作用，進而抑制肺纖維化[14]。呂佳敏等[37]發(fā)現(xiàn)香草蘭總黃酮能夠降低p62、ASC、caspase-1、GSDMD、NLRP3 的蛋白表達水平及IL-1β、IL-18 的含量，升高芐氯素1、人自噬相關蛋白5的蛋白表達水平，由此推測香草蘭總黃酮能夠通過激活自噬及抑制細胞焦亡來改善肺纖維化。由此可知，柚皮素、黃芩苷、香草蘭總黃酮等黃酮類成分能夠通過降低IL-1β、IL-18、NLRP3、caspase-1 的含量，從而抑制細胞焦亡的發(fā)生，進而抑制肺纖維化。

2 結語

橘皮苷、黃芩苷、槲皮素、鐮形棘豆總黃酮、黃芩總黃酮等黃酮類成分具有良好的抗肺纖維化活性，在BLM、二氧化硅誘導的動物肺纖維化模型與TGF-β1、BLM誘導的體外細胞肺纖維化模型中均發(fā)揮了良好的抗肺纖維化作用。這些黃酮類成分可通過多種機制發(fā)揮抗肺纖維化作用，如毛蕊異黃酮可通過抑制EMT 和細胞凋亡來發(fā)揮抗肺纖維化作用；槲皮素既可以調(diào)節(jié)自噬，又可以調(diào)控細胞凋亡，進而發(fā)揮抗肺纖維化作用；異甘草素、黃芪總黃酮等則可通過抑制EMT，進而抑制ECM 的沉積來改善肺纖維化；而黃芩苷能通過抑制EMT、細胞焦亡、細胞凋亡及激活自噬幾種機制來發(fā)揮抗肺纖維化作用；阿爾泰金蓮花總黃酮、甜橙黃酮、銀杏素等可分別通過抗炎、抑制成纖維細胞分化及抑制氧化應激從而發(fā)揮抗肺纖維化的作用。

多種黃酮類成分均表現(xiàn)出顯著的抗肺纖維化活性，是開發(fā)抗肺纖維化藥物的潛在資源。但是，黃酮類成分通常具有較大的分子量，大多數(shù)屬于極性化合物，這可能導致其水溶性較高，從而降低口服后在血液中的有效濃度；且該類成分通常在體內(nèi)通過肝臟代謝，這可能導致藥物在通過肝臟時被代謝掉，降低其有效血藥濃度。為了克服這些瓶頸，未來的突破方向可以研究黃酮類成分的腸道吸收情況，觀察其是否可以通過對腸道的影響來間接發(fā)揮藥效，同時可以將其與藥物載體相結合，從而提高其生物利用度。