張海旺 梁美春 周宜慶 阮永春 李明暉 王丹 茅國峰 蘇美霞 于麗俠

2021 年全國51 家醫(yī)院臨床分離菌株耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌是最常見的革蘭陽性分離菌，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）在金黃色葡萄球菌中的檢出率達(dá)30%[1]。研究表明，MRSA 是導(dǎo)致菌血癥、心內(nèi)膜炎、皮膚軟組織感染、骨關(guān)節(jié)感染以及醫(yī)院獲得性感染的主要原因之一[2]，其發(fā)病率和死亡率均較高。近年來，社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（community-acquired methicillin-resistant staphylococcus aureus，CA-MRSA）受到越來越多的關(guān)注。CAMRSA 常感染無危險因素的健康社區(qū)人群，表現(xiàn)出較醫(yī)院獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（hospital-acquired methicillin-resistant staphylococcus aureus，HAMRSA）更強的毒力[3]。相對而言，HA-MRSA 發(fā)生場所固定，可以通過手衛(wèi)生及消毒隔離措施等來減少傳播，但CA-MRSA 是社區(qū)感染，沒有很好的防控方法，易引起流行。因此，本研究對本院收集的CA-MRSA與HA-MRSA 的分子分型、毒力基因及耐藥基因作一比較，以期為臨床診治提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2019 年1 月至2020 年12 月紹興市人民醫(yī)院收治的34 例門診及住院患者，其中男20 例，女14 例；年齡6～87（57.41±20.43）歲。共分離獲得MRSA 34 株（僅納入首次分離的菌株），包括CA-MRSA 7 株（占20.6%），HA-MRSA 27 株（占79.4%）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過（批準(zhǔn)文號：2019-K-Y-039-01），所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 MRSA 分類標(biāo)準(zhǔn) （1）CA-MRSA 需符合以下5個條件[4]：①菌株分離自門診或住院48 h 內(nèi)的患者；②無MRSA 感染或定植史；③最近1 年內(nèi)未住過醫(yī)院或護(hù)理院；④未接受過透析或手術(shù)；⑤未接受過長期置管或使用穿透皮膚的醫(yī)療器械。（2）本研究分離獲得的MRSA 中，不符合以上條件者被認(rèn)為是HA-MRSA。

1.2.2 MRSA 藥敏試驗 采用頭孢西丁紙片擴散法。參照美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，以瓊脂稀釋法檢測MRSA 對頭孢西丁、苯唑西林、慶大霉素、紅霉素、左氧氟沙星、克林霉素、利福平、磷霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、替加環(huán)素、萬古霉素、利奈唑烷、替考拉寧等藥物的敏感性。

1.2.3 MRSA 基因組分析 采用全基因組測序法。使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（批號：DP302，北京天根生化科技有限公司）提取MRSA 菌株基因組；所提取的基因組DNA 置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，同時送浙江天科公司進(jìn)行基因組二代測序。所得的序列采用Unicycler 組裝，葡萄球菌mec 盒式染色體（staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）Finder（https://cge.cbs.dtu.dk/services/SCCmecFinder/）檢測SCCmec 分型，葡萄球菌A 蛋白（staphylococcal protein A，spa）Type（https://cge.cbs.dtu.dk/services/spaTyper/）檢測spa 分型，多位點基因序列類型（multilocus sequence typing，MLST）2.0（https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/）檢測MLST分型；VirulenceFinder（https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/）檢測毒力基因；ResFinder 4.1（https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/）檢測耐藥基因。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料組間比較采用Fisher 確切概率法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CA-MRSA 與HA-MRSA 對常用抗菌藥物敏感率比較 MRSA 對利奈唑胺、萬古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素均敏感。其中CA-MRSA 對慶大霉素、左氧氟沙星、利福平、磷霉素、四環(huán)素均敏感，對復(fù)方新諾明的敏感率為85.7%；HA-MRSA 對慶大霉素、利福平、復(fù)方新諾明、四環(huán)素的敏感率均在80%以上。CA-MRSA 與HA-MRSA 對各種常用抗菌藥物敏感率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 CA-MRSA與HA-MRSA對常用抗菌藥物敏感率比較[株（%）]

2.2 CA-MRSA 與HA-MRSA 分子分型比較

2.2.1 SCCmec 分型CA-MRSA 攜帶的SCCmec 分型以Ⅳa（2B）（占14.3%）、Ⅳg（2B）（占14.3%）、Ⅴ（5C2&5）（占14.3%）為主，HA-MRSA 以Ⅱ（2A）（占37.1%）、Ⅳa（2B）（占18.5%）、Ⅴ（5C2）（占14.8%）為主；兩種不同來源菌株SCCmec 分型比例比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

2.2.2 spa 分型 CA-MRSA 攜帶的spa 分型以t437（占28.5%）為主，HA-MRSA 以t311（占33.4%）為主；兩種不同來源菌株spa 分型比例比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

表3 CA-MRSA 與HA-MRSA 的spa分型比例比較[株（%）]

2.2.3 MLST 分型 CA-MRSA攜帶的MLST分型以ST59（占28.6%）、ST22（占28.6%）為主，HA-MRSA 以ST5（占22.3%）為主；兩種不同來源菌株MLST 分型比例比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表4。

表4 CA-MRSA與HA-MRSA的MLST分型比例比較[株（%）]

2.3 CA-MRSA 與HA-MRSA 毒力基因檢出率比較CA-MRSA 攜帶22種毒力基因，HA-MRSA攜帶27種毒力基因。兩種不同來源菌株均攜帶毒力基因aur、hlgA、hlgB、hlgC，其中CA-MRSA 攜帶sak（占85.7%）、scn（占85.7%）為主，HA-MRSA 攜帶scn（占92.6%）、sak（占88.9%）為主；CA-MRSA 的lukF-PV、lukS-PV 檢出率均明顯高于HA-MRSA（均P＜0.05），sea 檢出率明顯低于CA-MRSA（P＜0.05），兩種不同來源菌株其他毒力基因檢出率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表5。

表5 CA-MRSA與HA-MRSA毒力基因檢出率比較[株（%）]

2.4 CA-MRSA 與HA-MRSA 耐藥基因檢測結(jié)果

2.4.1 CA-MRSA 與HA-MRSA 抗菌藥物耐藥基因檢出率比較 HA-MRSA 的環(huán)丙沙星耐藥基因gyrA 檢出率明顯高于CA-MRSA，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩種不同來源菌株其余抗菌藥物耐藥基因檢出率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表6。

表6 CA-MRSA 與HA-MRSA 抗菌藥物耐藥基因檢出率比較

2.4.2 CA-MRSA 與HA-MRSA 同時耐受抗菌藥物基因譜 CA-MRSA 同時攜帶1～6 種抗菌藥物耐藥基因，頭孢西丁-青霉素-克林霉素-紅霉素為優(yōu)勢耐藥譜；HA-MRSA 同時攜帶1～9 種抗菌藥物耐藥基因，頭孢西丁-青霉素-克林霉素-紅霉素、阿米卡星-妥布霉素-頭孢西丁-青霉素-環(huán)丙沙星-克林霉素-紅霉素和慶大霉素-阿米卡星-妥布霉素-頭孢西丁-青霉素-環(huán)丙沙星-四環(huán)素-克林霉素-紅霉素為優(yōu)勢耐藥譜。

3 討論

Nichol 等[5]對加拿大1 963 例MRSA 感染患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，CA-MRSA 是加拿大MRSA 感染的最常見菌株。一項對全國22 家三級醫(yī)院1 900 例金黃色葡萄球菌感染患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在434 例社區(qū)相關(guān)金黃色葡萄球菌感染患者中，CA-MRSA 感染占24.2%；在763 例MRSA 感染患者中，CA-MRSA 感染占13.8%[6]。本研究結(jié)果顯示，在34例MRSA感染患者中，CA-MRSA感染占20.6%，提示醫(yī)院應(yīng)引起高度重視。盡管CA-MRSA 是指在無醫(yī)源性暴露情況下發(fā)生的MRSA 感染，但是醫(yī)源性暴露并不能排除患者在社區(qū)感染CA-MRSA 的可能，在一定程度下會低估CA-MRSA 發(fā)生率。

相關(guān)研究表明，CA-MRSA 對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類等非β-內(nèi)酰胺類藥物往往較為敏感[7]。Preeja 等[8]研究表明，CAMRSA 菌株對左氧氟沙星的耐藥率明顯低于HAMRSA 菌株對左氧氟沙星的耐藥率（12.3%比41.2%，P＜0.05）。本研究結(jié)果顯示，CA-MRSA 菌株對左氧氟沙星敏感率為100.0%，HA-MRSA 菌株對左氧氟沙星的敏感率為59.3%，提示左氧氟沙星可作為經(jīng)驗性抗菌藥物用于本院CA-MRSA 感染患者的治療。但由于本研究病例數(shù)較少，今后仍需進(jìn)一步加強本地區(qū)CAMRSA 耐藥監(jiān)測來指導(dǎo)臨床經(jīng)驗性用藥。

CA-MRSA 流行克隆菌株在許多國家和地區(qū)存在較大差異。Peng 等[9]研究顯示，SCCmec Ⅳa 型是CAMRSA 的主要流行類型（占70.9%），其次是Ⅴ型（占15.4%）、Ⅲ型（占10.3%）、不可分型（占3.4%）；而多數(shù)HA-MRSA 攜帶SCCmec Ⅲ型（占58.3%），其次是Ⅱ型（占25.5%）、Ⅳa 型（占11.7%）、不可分型（占3.3%）、Ⅰ型（占0.6%）、Ⅴ型（占0.6%）。本研究通過基因組測序結(jié)果顯示，本院CA-MRSA 攜帶的SCCmec 分型以Ⅳ型和Ⅴ型為主，其中Ⅳa（2B）、Ⅳg（2B）、Ⅴ（5C2&5）各占14.3%，不可分型占57.1%；而HA-MRSA 以Ⅱ（2A）為主（占37.1%），其次為Ⅳa（2B）（占18.5%）、Ⅴ（5C2）（占14.8%）和Ⅴ（5C2&5）（3.7%），不可分型為25.9%。郭慶昕等[10]研究發(fā)現(xiàn)，44 株CA-MRSA 的spa 分型主要為t437（占50.0%）、t062（占20.5%），39 株HA-MRSA 的spa 分型主要為t437（占28.2%）、t062（占23.1%）。本研究通過基因組測序結(jié)果顯示，CA-MRSA 的spa 分型以t437（占28.5%）為主，而HA-MRSA 以t311（占33.4%）為主。Peng 等[9]研究顯示，ST59 是我國醫(yī)院CA-MRSA的主要MLST 分型，占52.5%。本研究結(jié)果顯示，CAMRSA 的MLST 分型以ST59（占28.6%）、ST22（占28.6%）為主。

MRSA 保守攜帶多個涉及多種功能的毒力基因[11]。CA-MRSA 和HA-MRSA 之間的毒力基因含量存在差異[9]。PVL 基因被認(rèn)為是CA-MRSA 的潛在重要毒力因子。El-Baghdady等[4]研究顯示，92.2%的CA-MRSA能檢測到PVL 基因，而只有28.6%的HA-MRSA 能檢測到PVL 基因。本研究結(jié)果顯示，CA-MRSA 攜帶毒力基因lukF-PV、lukS-PV 的比例為57.1%，明顯高于HA-MRSA 的11.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Klein 等[12]通過全基因組測序?qū)?6 株P(guān)VL 基因陽性的MRSA 進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)32.6%的PVL 基因陽性的MRSA 符合醫(yī)院獲得標(biāo)準(zhǔn)。PVL 基因陽性的CA-MRSA 克隆可能進(jìn)入醫(yī)院并導(dǎo)致醫(yī)院感染，應(yīng)做好預(yù)防措施和持續(xù)監(jiān)測的準(zhǔn)備，以防止傳播和克隆暴發(fā)。同時本研究發(fā)現(xiàn)MASA 攜帶較多超抗原腸毒素，HA-MRSA 攜帶毒力基因sea 的比例明顯高于CA-MRSA。

MecA 基因是MRSA 特有的耐藥性遺傳決定基因，通過產(chǎn)生青霉素結(jié)合蛋白PBP2a 表現(xiàn)出耐藥性。本研究結(jié)果顯示，絕大多數(shù)MRSA 含有mecA 基因。HAMRSA 的環(huán)丙沙星gyrA 耐藥基因檢出率明顯高于CAMRSA。此外，CA-MRSA 以頭孢西丁-青霉素-克林霉素-紅霉素為優(yōu)勢耐藥譜；HA-MRSA 以頭孢西丁-青霉素-克林霉素-紅霉素、阿米卡星-妥布霉素-頭孢西丁-青霉素-環(huán)丙沙星-克林霉素-紅霉素和慶大霉素-阿米卡星-妥布霉素-頭孢西丁-青霉素-環(huán)丙沙星-四環(huán)素-克林霉素-紅霉素為優(yōu)勢耐藥譜。

綜上所述，本院CA-MRSA 分離率較高，其攜帶毒力基因lukF-PV、lukS-PV 的比例高于HA-MRSA。