張志威，周文喜，孟晶晶，秦雪姿，倪 娜，王 華

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古通遼 028043；2.通遼市農(nóng)牧科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古通遼 028000）

蕎麥?zhǔn)且荒晟荼局参?，又名烏麥、三角麥等，目前? 個(gè)栽培品種，分別是甜蕎（F.esculentum）和苦蕎（F.tataricum），分布范圍廣泛，栽培歷史悠久[1-2]。內(nèi)蒙古是蕎麥的主產(chǎn)區(qū)之一，通遼地區(qū)的蕎麥種植面積居全區(qū)首位，種植面積為20.48 khm2，總產(chǎn)量0.20 億kg，主要集中在庫(kù)倫旗，產(chǎn)量約占全國(guó)總產(chǎn)量的1/3。另外，蕎麥在奈曼旗和科爾沁左翼后旗等地也有不小的種植面積和產(chǎn)量[3]。

據(jù)已知數(shù)據(jù)，蕎麥中谷蛋白含量低，主要蛋白質(zhì)是球蛋白，必需氨基酸中賴氨酸含量較高，蛋氨酸含量低，膳食纖維含量也極為豐富，與普通稻米相比，可以高出10 倍以上，并且蕎麥比普通谷物含有更多種類和含量的微量元素[4]。蕎麥不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，還富含多糖、黃酮、糖醇等生物活性物質(zhì)，并具有抗氧化、降脂、抑菌、抗炎等生物功能活性[5-10]。

目前，對(duì)于蕎麥的研究絕大多數(shù)都集中在黃酮類物質(zhì)和蛋白質(zhì)，對(duì)多糖的研究鮮有報(bào)道。因此，試驗(yàn)選用通遼當(dāng)?shù)貜V泛種植的品種——通蕎3 號(hào)為研究對(duì)象，采用Plackett-burman 試驗(yàn)和Box-behnken試驗(yàn)優(yōu)化蕎麥多糖提取工藝，對(duì)其體外抗氧化能力進(jìn)行了相關(guān)研究。以期為通遼地區(qū)蕎麥資源的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥（通蕎3 號(hào)），通遼市農(nóng)牧科學(xué)研究所提供。將種子研磨過(guò)篩，置于4 ℃冰箱中備用。

石油醚（60～90 ℃）、無(wú)水乙醇，均為分析純，天津大茂試劑有限公司提供；中性蛋白酶（50 000.0 U/g），北京索萊寶科技有限公司提供；果膠酶（≥50.0 U/g）、纖維素酶（≥15 000.0 U/g），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；DPPH 自由基清除能力試劑盒、總抗氧化能力試劑盒（FRAP 法）、總抗氧化能力試劑盒（ABTS 法），南京建成生物工程研究所提供。

1.2 儀器與設(shè)備

XM-P30H 型無(wú)級(jí)調(diào)功超聲波清洗機(jī)，小美超聲儀器（昆山） 有限公司產(chǎn)品；RE-2000B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化設(shè)備儀器有限公司產(chǎn)品；5804R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司產(chǎn)品；Infinite M200 型多功能酶標(biāo)儀，瑞士帝肯公司產(chǎn)品；SA224S 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蕎麥多糖提取流程

干燥蕎麥粉→石油醚回流脫脂→干燥→80%乙醇回流脫色→干燥→加酶和適量蒸餾水置于超聲波清洗機(jī)→離心→上清液減壓濃縮→離心→取沉淀，加適量蒸餾水溶解→糖液減壓濃縮→-20 ℃預(yù)冷，-80 ℃冷凍→真空冷凍干燥→蕎麥粗多糖。

1.3.2 蕎麥多糖的含量測(cè)定及計(jì)算

蕎麥多糖測(cè)定采用苯酚- 硫酸法，依據(jù)相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)操作[11]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程Y=0.870 8X-0.007 2，R2=0.999 3。

1.3.3 蕎麥多糖得率計(jì)算

取一定量樣品液按照上述試驗(yàn)步驟操作。重復(fù)3 次取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定吸光度，按照下列公式計(jì)算蕎麥多糖得率。

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取苦蕎粉5.0 g，放入200 mL 錐形瓶中，在其他條件相同的情況下，依次采用不同中性蛋白酶添加量、纖維素酶添加量、果膠酶添加量、料液比、pH 值、提取溫度、超聲波功率進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，分析不同試驗(yàn)條件對(duì)多糖得率的影響。

1.5 Plackett-burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蕎麥多糖得率為響應(yīng)值，使用Design Expert.V 8.0.6.1 進(jìn)行Plackettburman 試驗(yàn)的設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

Plackett-burman 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表1。

表1 Plackett-burman 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

據(jù)上述試驗(yàn)選出顯著因素，觀察其正、負(fù)效應(yīng)，設(shè)計(jì)合理的步長(zhǎng)，增加試驗(yàn)的密集度，從而獲得最佳提取工藝區(qū)域的方法，將此最佳結(jié)果作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)展開試驗(yàn)[12]。

1.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，采用Design Expert.V 8.0.6.1進(jìn)行Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，蕎麥多糖得率作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)各因素及其對(duì)應(yīng)水平。

Box-behnken 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 Box-behnken 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.8 蕎麥多糖體外抗氧化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.8.1 蕎麥多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

根據(jù)教小磐等人[13]的試驗(yàn)方法稍加改動(dòng)。待測(cè)樣品于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度，并根據(jù)以下公式計(jì)算DPPH 自由基清除率。

式中：Ax——不同多糖溶液吸光度；

A0——對(duì)照溶液吸光度。

1.8.2 蕎麥多糖對(duì)ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

參考沈成龍等人[14]的方法適當(dāng)調(diào)整，待測(cè)樣混勻后置于室溫反應(yīng)6 min，于波長(zhǎng)405 nm 處測(cè)定吸光度，根據(jù)以下公式計(jì)算ABTS+自由基清除率。

式中：Ax——不同多糖溶液吸光度；

A0——對(duì)照溶液吸光度。

1.8.3 蕎麥多糖還原能力測(cè)定

Fe2+還原能力測(cè)定依據(jù)孫朋真等人[15]的方法稍作修改。配制不同質(zhì)量濃度的蕎麥多糖溶液于試管中，分別加入提前配制的FRAP 工作液，混勻后于37 ℃條件下孵育3～5 min，于波長(zhǎng)593 nm 處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 中性蛋白酶添加量的確定

中性蛋白酶添加量對(duì)蕎麥多糖得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 中性蛋白酶添加量對(duì)蕎麥多糖得率的影響

從多糖提取的角度來(lái)說(shuō)，中性蛋白酶可以水解與多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)，提高得率[16]。隨著加酶量增加，蕎麥多糖提取率迅速上升，1.000%時(shí)達(dá)到最大值，多糖得率為4.200%，而后出現(xiàn)下降?？赡苁怯捎陔S著增加酶的添加量，加深酶解程度，酶解液黏度增加，導(dǎo)致多糖附著各類雜質(zhì)形成沉淀，影響蕎麥多糖的得率[17]。因此，中性蛋白酶添加量1.000%時(shí)為最為適宜。

2.1.2 纖維素酶添加量的確定

纖維素酶添加量對(duì)蕎麥多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 纖維素酶添加量對(duì)蕎麥多糖得率的影響

纖維素酶能破壞蕎麥細(xì)胞壁，有利于提取蕎麥多糖。隨著添加量增加，得率先增加后減少。纖維素酶添加量為0.045%時(shí)，多糖得率最高；在0.045%～0.050%時(shí)，多糖得率開始下降，可能是因?yàn)槊阜肿语柡?，不易結(jié)合底物，從而減緩了細(xì)胞壁的水解速度[18]。此外，過(guò)多的酶會(huì)增加體系黏度，阻礙蕎麥多糖溶解，從而降低多糖得率。因此，纖維素酶添加量以0.045%為最宜，多糖得率為4.510%。

2.1.3 果膠酶添加量的確定

果膠酶添加量對(duì)蕎麥多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 果膠酶添加量對(duì)蕎麥多糖得率的影響

由圖3 可知，當(dāng)果膠酶添加量到達(dá)0.035%時(shí)，蕎麥多糖得率最高。在0.020%～0.035%時(shí)，蕎麥多糖得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)果膠酶添加量大于0.035%，蕎麥多糖得率呈下降趨勢(shì)。分析出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，可能與上述出現(xiàn)的情況大致相同；也可能是體系中3 種酶的添加量變大時(shí)，導(dǎo)致各種酶之間出現(xiàn)拮抗作用[19]。果膠酶添加量為0.035%時(shí)，多糖得率為4.890%。

2.1.4 料液比的確定

料液比對(duì)蕎麥多糖得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)蕎麥多糖得率的影響

隨料液比的變化，蕎麥多糖得率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在料液比為1∶20（g∶mL） 時(shí)，出現(xiàn)得率峰值，為5.580%。分析其原因可能為1∶20（g∶mL） 之前，蕎麥種子中的多糖未得到較好的溶解，才表現(xiàn)出多糖得率較低的現(xiàn)象。相反，當(dāng)提取液劑量增大會(huì)導(dǎo)致提取率降低的現(xiàn)象。

2.1.5 pH 值的確定

pH 值對(duì)蕎麥多糖得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 pH 值對(duì)蕎麥多糖得率的影響

由圖5 可知，蕎麥多糖得率隨著pH 值的增大而增大，當(dāng)pH 值達(dá)到7.0 時(shí)多糖得率最大，達(dá)到5.740%左右；當(dāng)pH 值繼續(xù)增大，得率不再增加，反而會(huì)有所下降?？赡苁且?yàn)樵谄渥钸mpH 值條件下，體系中的復(fù)合酶更易與底物結(jié)合，有利于酶促反應(yīng)的發(fā)生[20-21]。

2.1.6 提取溫度的確定

提取溫度對(duì)蕎麥多糖得率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 提取溫度對(duì)蕎麥多糖得率的影響

由圖6 可知，提取溫度為30～60 ℃時(shí)，多糖得率隨溫度的升高而增大，在60 ℃時(shí)多糖得率出現(xiàn)峰值。在60 ℃以后，多糖得率又出現(xiàn)大幅度下降的現(xiàn)象，可能原因是溶劑中尚未溶解的蕎麥粉末為60～70 ℃時(shí)發(fā)生糊化，高溫影響多糖的結(jié)構(gòu)和活性，導(dǎo)致多糖的變性；過(guò)高的溫度導(dǎo)致體系中復(fù)合酶的變性失活，從而導(dǎo)致蕎麥多糖的得率降低[22]?？紤]到能源成本與復(fù)合酶活性問(wèn)題，蕎麥多糖的提取溫度60 ℃時(shí)為最佳，此時(shí)蕎麥多糖得率為6.400%。

2.1.7 超聲功率的確定

超聲功率對(duì)蕎麥多糖得率的影響見(jiàn)圖7。

圖7 超聲功率對(duì)蕎麥多糖得率的影響

由圖7 可知，隨著超聲功率的不斷增大，蕎麥多糖的得率呈現(xiàn)先逐漸增大后降低的現(xiàn)象。在超聲功率為425 W 時(shí)多糖得率為7.500%，是各水平超聲功率下的最高值，說(shuō)明此功率下多糖可以得到最充分的溶解；在超聲功率為200～350 W 時(shí)，多糖得率隨功率的增加而增加，原因是隨著超聲功率的加大，蕎麥植物組織細(xì)胞壁逐漸破碎，蕎麥多糖逐漸溶于溶劑當(dāng)中[23]；大于425 W 時(shí)，多糖得率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是由于超聲功率過(guò)大打斷糖苷鍵，多糖結(jié)構(gòu)被破壞，在后期收集中出現(xiàn)損失，從而導(dǎo)致蕎麥多糖得率的下降[24]。因此，在超聲提取蕎麥多糖時(shí)，以超聲功率425 W 較為適宜。

2.2 Plackett-burman 試驗(yàn)

采用Design Expert.V 8.0.6.1 對(duì)Plackett-burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，對(duì)7 個(gè)影響因素進(jìn)行顯著性分析，以高水平（+1） 和低水平（-1） 表示，響應(yīng)值為多糖得率。

Plackett-burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，Plackett-burman 模型方差分析見(jiàn)表4。

表3 Plackett-burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 Plackett-burman 模型方差分析

由表3 可知，中性蛋白酶添加量（A）、果膠酶添加量（C） 和超聲功率（G） 對(duì)多糖提取影響顯著（0.01＜p＜0.05）。因此，選擇A、C、G作為最陡爬坡試驗(yàn)的考查因素。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

從Plackett-burman 試驗(yàn)結(jié)果可知，A、C、G3個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大且為負(fù)效應(yīng)，因此適當(dāng)降低各因素的水平，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，確定爬坡方向和合理步長(zhǎng)，從而快速接近最佳區(qū)域[25]。

最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表5 可知，最佳的組合為試驗(yàn)號(hào)4，即中性蛋白酶添加量為0.900 0%，果膠酶添加量為0.032 5%，超聲功率為425 W，故以試驗(yàn)號(hào)4 的條件為Boxbehnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心值。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

以Plackett-burman 試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，利用Design Expert.V 8.0.6.1 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析。

響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析見(jiàn)表7。

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

分析數(shù)據(jù)得方程：

由表8 可知，A，CG，A2，C2和G2極顯著，C，AC和AG顯著。影響蕎麥多糖得率因素先后順序?yàn)锳＞C＞B?？傮w分析，回歸模型p＜0.01，表明該模型極顯著；同時(shí)，回歸模型的失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），R2Adj=0.878 4，說(shuō)明該模型能解釋87.84%的響應(yīng)值變化，可用于超聲波輔助復(fù)合酶法提取蕎麥多糖提取工藝優(yōu)化。

2.4.2 兩因素交互作用影響提取工藝的響應(yīng)面分析

做出響應(yīng)曲面，分析中性蛋白酶添加量（A）、果膠酶添加量（C）、超聲功率（G） 對(duì)蕎麥多糖得率的影響。

中性蛋白酶添加量、果膠酶添加量交互作用對(duì)多糖得率的響應(yīng)面和等高線見(jiàn)圖8，中性蛋白酶添加量、超聲功率交互作用對(duì)多糖得率的響應(yīng)面和等高線見(jiàn)圖9，果膠酶添加量、超聲功率交互作用對(duì)多糖得率的響應(yīng)面和等高線見(jiàn)圖10。

圖8 中性蛋白酶添加量、果膠酶添加量交互作用對(duì)多糖得率的響應(yīng)面和等高線

圖9 中性蛋白酶添加量、超聲功率交互作用對(duì)多糖得率的響應(yīng)面和等高線

圖10 果膠酶添加量、超聲功率交互作用對(duì)多糖得率的響應(yīng)面和等高線

由圖8 ～圖10 可知，響應(yīng)面圖評(píng)估三者之間交互作用對(duì)蕎麥多糖得率的影響，曲面有極大值，工藝最優(yōu)參數(shù)在試驗(yàn)范圍內(nèi)，等高線圖近似于橢圓形，說(shuō)明各因素交互作用較顯著，與上表結(jié)果一致。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

以蕎麥多糖得率為最終優(yōu)化值，經(jīng)Design Expert.V 8.0.6.1 軟件預(yù)測(cè)可得最佳提取工藝為中性蛋白酶添加量0.900 0%，纖維素酶添加量0.045 0%，果膠酶添加量0.032 4%，料液比1∶20（g∶mL），pH值7.0，提取溫度60 ℃，超聲功率424 W，蕎麥多糖得率為7.25%。為驗(yàn)證其可靠性，重復(fù)試驗(yàn)3 次，多糖平均得率為7.11%，相對(duì)誤差為0.14%，與預(yù)測(cè)值基本一致。說(shuō)明該模型可行，具有實(shí)際操作意義。

2.5 蕎麥多糖體外抗氧化能力測(cè)定

2.5.1 蕎麥多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力

蕎麥多糖及維C 對(duì)DPPH 自由基的清除作用見(jiàn)圖11。

圖11 蕎麥多糖及維C 對(duì)DPPH 自由基的清除作用

由圖11 可知，在0.2～1.0 g/mL 范圍內(nèi)，維C 對(duì)DPPH 自由基有較高清除能力，最高清除率可達(dá)94.89%。隨著不斷增加樣品質(zhì)量濃度，蕎麥多糖對(duì)DPPH 自由基清除率呈上升趨勢(shì)，在樣品質(zhì)量濃度為1.0 g/mL 時(shí)，蕎麥多糖對(duì)DPPH 自由基清除率可以達(dá)到62.31%。整體來(lái)看，維C 對(duì)DPPH 自由基清除能力要強(qiáng)于蕎麥多糖。

2.5.2 蕎麥多糖對(duì)ABTS+自由基清除能力

蕎麥多糖及維C 對(duì)ABTS+自由基的清除作用見(jiàn)圖12。

圖12 蕎麥多糖及維C 對(duì)ABTS+自由基的清除作用

由圖12 可知，低于0.6 g/mL 時(shí)，蕎麥多糖對(duì)ABTS+自由基清除率大幅度上升，在0.6～1.0 g/mL，蕎麥多糖對(duì)ABTS+自由基清除率上升緩慢，在1.0 g/mL時(shí)，達(dá)到最大清除率88.78%。相較于不同質(zhì)量濃度蕎麥多糖和維C 對(duì)ABTS+自由基的清除作用，在1.0 g/mL 時(shí)蕎麥多糖的清除率更接近維C。由此可知，蕎麥多糖對(duì)于ABTS+自由基有著良好的清除作用。

2.5.3 蕎麥多糖鐵離子還原能力

蕎麥多糖及維C的還原能力見(jiàn)圖13。

由圖13 可知，隨著樣品質(zhì)量濃度升高，維C的還原能力快速增加；蕎麥多糖在各個(gè)質(zhì)量濃度條件下的還原力均較弱于維C。在樣品質(zhì)量濃度為0.8 g/mL 時(shí)，蕎麥多糖和維C的還原能力最為接近，分別是76.28%和96.99%。蕎麥多糖還原能力最大值出現(xiàn)在1.0 g/mL 時(shí)，為76.76%。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)、Plackett-burman 試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-behnken 試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助酶法提取蕎麥多糖的最佳提取工藝。結(jié)果表明，中性蛋白酶添加量0.900 0%，纖維素酶添加量0.045 0%，果膠酶添加量0.032 4%，料液比1∶20（g∶mL），pH 值7.0，提取溫度60 ℃，超聲功率424 W，此結(jié)果可充分驗(yàn)證該試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃浴?duì)通蕎3 號(hào)多糖進(jìn)行了體外抗氧化能力研究，結(jié)果表明雖然多糖清除自由基和還原能力弱于維C，但是蕎麥多糖對(duì)DPPH 自由基和ABTS+自由基有明顯清除能力，并且對(duì)鐵離子具有一定的還原性。該研究為蕎麥多糖提取工藝提供了技術(shù)參考，為進(jìn)一步開發(fā)和利用通遼當(dāng)?shù)厥w麥資源提供了理論依據(jù)。