燕莎, 朱亞, 楊建旭, 付毓平, 牛小斌, 李永偉△

1河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院)檢驗科 (河南鄭州 450002); 河南省人民醫(yī)院 2檢驗科, 3重癥醫(yī)學科(河南鄭州 450002); 4新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院醫(yī)學檢驗學院 (河南新鄉(xiāng) 453000)

膿毒癥是一種機體免疫系統(tǒng)對感染反應失調引起的一種危及生命的器官功能障礙綜合征,是重癥醫(yī)學科常見疾病,病情兇險,可導致多器官功能障礙,病死率極高[1]。急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是膿毒癥常見并發(fā)癥之一,臨床研究顯示,膿毒癥并發(fā)ARDS發(fā)病率可達50%以上,病死率在40%左右,較未合并ARDS的患者顯著升高[2]。并發(fā)ARDS是導致膿毒癥病情惡性進展的重要危險因素,臨床尚無特效治療藥物,僅能對癥支持治療。故尋找可靠的血清標志物評估膿毒癥并發(fā)ARDS患者近期死亡風險,有助于掌握病情變化及時調整治療策略。目前膿毒癥并發(fā)ARDS的機制尚不明確,過度炎癥反應、內皮功能紊亂均與其發(fā)生有關,生理狀態(tài)下各細胞因子之間相互作用形成平衡的網(wǎng)絡系統(tǒng),一旦網(wǎng)絡系統(tǒng)的平衡被打破則可能誘發(fā)炎癥“瀑布反應”,致使全身器官損害,導致ARDS[3]。因此,尋找能夠反映ARDS發(fā)病過程中炎癥反應的相關血清標志物,進而在疾病發(fā)生早期對病情進展作出預期判斷,將利于采取更合適的治療策略以改善預后。研究[4-6]已證實,自分泌運動因子(autotaxin,ATX)、血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like protein 4,Angptl4)、S100鈣結合蛋白A12(S100 calcium-binding protein A12,S100A12)均能參與機體炎癥反應過程,與炎癥相關疾病進展過程密切相關。NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)炎癥小體參與調控炎癥反應,其作為膿毒癥所致急性肺損傷/ARDS發(fā)病的核心已被證實[7],因此探討三項血清指標在膿毒癥并發(fā)ARDS過程中的作用及其與NLRP3炎癥小體及預后轉歸關系有重要臨床意義。關于ATX、Angptl4及S100A12表達水平與ARDS病情進展有關的NLRP3炎癥小體有何關系尚未明確,為此,本研究通過檢測ATX、Angptl4及S100A12在膿毒癥合并ARDS患者循環(huán)血中表達水平,并分析三指標與NLRP3炎癥小體及其細胞因子及患者近期預后之間的關系,為膿毒癥并發(fā)ARDS的臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2022年4月收治的303例膿毒癥患者,其中男178例,女125例;年齡46～77歲,平均(65.80±6.15)歲,根據(jù)是否合并ARDS分為ARDS組(106例)和非ARDS組(197例)。

納入標準:(1)膿毒癥患者符合膿毒癥及膿毒性休克第3次國際共識定義(Sepsis-3)[8],經(jīng)病原學檢查明確感染部位;(2)ARDS納入標準依據(jù)2012 ARDS柏林定義[9]:①急性起病(≤7 d);②氧合指數(shù)(OI)低于200 mmHg;③胸片提示雙側浸潤影、不能用積液、大葉/肺不張或結節(jié)完全解釋;④呼吸衰竭不能用心力衰竭或液體過度負荷完全解釋,并用超聲心動圖排除靜水壓增高型肺水腫;(3)年齡>18歲;(4)入組前未接受膿毒癥及ARDS相關治療;(5)患者或家屬簽訂知情同意書。

排除標準:(1)伴器質性心臟病者;(2)有哮喘、肺氣腫、慢性肺間質纖維化、肺結核、肺栓塞等病史者;(3)伴自身免疫性疾病或近期服用免疫抑制劑、激素藥物者;(4)血液系統(tǒng)疾病者;(5)放棄搶救或治療期間轉院者;(6)孕婦及哺乳期女性。

本研究已通過我院醫(yī)學倫理委員會審批(HNSZYY-20190010005)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 入院1 h內采用不含EDTA的真空管采集靜脈血10 mL,非抗凝血樣室溫靜置20 min后,2 800 r/min離心15 min(直徑12 cm)取上層血清,-80℃?zhèn)溆?入院第1天用含EDTA抗凝真空管采集靜脈血5 mL,按照1∶1體積與人外周血淋巴細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)混勻,離心分離外周血單個核細胞(PBMCs),與2 mL Trizol(日本TaKaLa)混合后置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清ATX、Angptl4、S100A12、白細胞介素(IL)-1β及IL-18水平的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清ATX、Angptl4、S100A12,ATX、Angptl4、S100A12 ELISA試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司(貨號:ZN2032、ZN2027、ZN2393),IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒購自英國Abcam公司(貨號ab214025、ab264615),按照試劑盒說明書于450/570 nm波長處測量吸光度值,根據(jù)標準曲線計算待測樣中ATX、Angptl4、S100A12、IL-1β及IL-18的水平。

1.2.3 外周血NLRP3檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測PBMCs中NLRP3 信使核糖核酸(mRNA)表達情況,Trizol法提取總RNA,檢測RNA濃度,并反轉錄合成互補鏈DNA(cDNA)。qPCR引物(上海生工生物公司設計與合成):NLRP3:F:5′-ACTGATGCTGGGTACGTCTCC-3′,R:5′-TAGCGGCATGAGCTAGTCG-3′,β-actin:F:5′-ACGTAGCTGATGCTGATCGC-3′,R:5′-TATGCTAGCTAGCTGACGTG-3′,根據(jù)SYBR Green qPCR Mix試劑盒(上海錸博生化科技有限公司)建立20 μL反應體系:SYBR Premix Ex Taq 8.5 μL,正反向游引物各1 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 7.5 μL;反應條件:94 ℃預變性3 min;38個循環(huán)(94 ℃變性10 s,59 ℃退火30 s),72 ℃延伸60 s,2-ΔΔCT法分析目的基因相對表達強度。

1.2.4 資料收集 收集膿毒癥患者的基本資料,包括性別、年齡、體質指數(shù)(BMI)、吸煙史、飲酒史、合并癥(高血壓、糖尿病、冠心病)、感染部位(尿路感染,腹腔感染,靜脈置管、氣管插管、導尿管等引起的導管相關血流感染),是否休克、侵入性置管,有無使用血管活性藥,記錄機械通氣時間、重癥監(jiān)護室(ICU)入住時間,入院24 h內評估急性生理與慢性健康評分Ⅱ(APACHE Ⅱ)[10]、序貫器官衰竭評估(SOFA)評分[11],GEM Premier 3000全自動血氣分析儀(美國IL)監(jiān)測血氣參數(shù):動脈二氧化碳分壓(PaCO2)、動脈氧分壓(PaO2)、OI及動脈血乳酸水平,采用全自動生化分析儀(雅培C1600)及配套試劑檢測白蛋白、血糖、血肌酐水平。APACHE Ⅱ包括A項(急性生理學評分,12項生理參數(shù),每項0～4分,總分0～48分)、B項(年齡,0～6分)、C項(慢性健康評分,0、2、5分)三個部分,分值越高病情越嚴重。SOFA評分涉及呼吸、凝血、腎臟等6個器官系統(tǒng)功能,每項0～4分,總分0～24分,分數(shù)越高多器官功能障礙程度越高。

1.2.5 治療及隨訪結果統(tǒng)計 膿毒癥并發(fā)ARDS患者入住ICU,根據(jù)《膿毒癥并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征的治療策略》[12]推薦方案治療,包括呼吸支持、抗炎、抗凝血、血管活性藥物、液體管理等,若合并糖尿病、高血壓等基礎疾病給予相應對癥治療,記錄入院30 d死亡情況,并分為死亡組(n=49)和生存組(n=57)。

2 結果

2.1 ARDS組和非ARDS組血清ATX、Angptl4、S100A12、NLRP3、IL-1β及IL-18水平比較 ARDS組血清ATX、Angptl4、S100A12、NLRP3、IL-1β及IL-18水平均高于非ARDS組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 ARDS組和非ARDS組血清ATX、Angptl4、S100A12、NLRP3、IL-1β及IL-18水平比較

2.2 血清ATX、Angptl4、S100A12與NLRP3、IL-1β和IL-18表達水平的相關性分析 Pearson相關性分析顯示,血清ATX、Angptl4、S100A12與NLRP3 mRNA、IL-1β、IL-18水平均呈正相關(P<0.05)。見表2。

表2 血清ATX、Angptl4、S100A12與NLRP3、IL-1β和IL-18表達水平的相關性分析

2.3 不同預后膿毒癥并發(fā)ARDS患者臨床資料及實驗室指標比較 住院期間膿毒癥并發(fā)ARDS患者死亡率為46.23%(49/106),死亡組年齡、APACHE Ⅱ評分、SOFA評分、血乳酸、血清ATX、Angptl4、S100A12水平及休克、機械通氣時間≥3 d、ICU入住時間≥10 d、侵入性置管占比均高于生存組,OI、白蛋白水平低于生存組(P<0.05)。兩組性別、BMI、吸煙史、飲酒史、合并癥、感染部位、血管活性用藥、PaCO2、PaO2、血肌酐、血糖水平方面比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同預后膿毒癥并發(fā)ARDS患者臨床資料及實驗室指標比較

2.4 Logistic回歸分析膿毒癥并發(fā)ARDS患者住院期間死亡的危險因素 以膿毒癥并發(fā)ARDS患者住院期間死亡為因變量,以表3中生存組與死亡組存在差異的因素為自變量納入進行l(wèi)ogistic回歸(受本研究樣本量限制,僅進行單因素回歸),賦值設計見表4。Logistic回歸結果顯示,入院時APACHE Ⅱ、SOFA評分、血清ATX、Angptl4、S100A12升高均是導致患者死亡的危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 Logistic回歸分析膿毒癥并發(fā)ARDS患者住院期間死亡的危險因素

2.5 血清ATX、Angptl4、S100A12對膿毒癥并發(fā)ARDS患者住院期間死亡的預測價值 以死亡組為陽性樣本(n=49),以生存組為陰性樣本(n=57),以血清ATX、Angptl4、S100A12為自變量(連續(xù)數(shù)值原型輸入)進行多因素logistic回歸,建立風險預測模型,以其Logit(P/1-P)=-0.039+0.091×ATX+0.009×Angptl4+0.024×S100A12為聯(lián)合應用的虛擬概率量指標,再行ROC曲線分析。ROC曲線分析顯示,血清ATX、Angptl4、S100A12及三者聯(lián)合預測膿毒癥并發(fā)ARDS患者住院期間死亡的AUC(95%CI)分別為0.729(0.455～0.984)、0.708(0.501～0.922)、0.780(0.596～0.959)、0.852(0.712～0.985),三血清指標聯(lián)合預測效能高于單項檢測。見表6、圖1。

圖1 血清ATX、Angptl4、S100A12對膿毒癥并發(fā)ARDS患者死亡的預測ROC曲線

表6 血清ATX、Angptl4、S100A12對膿毒癥并發(fā)ARDS患者住院期間死亡的預測價值

3 討論

ARDS是膿毒癥常見并發(fā)癥,其發(fā)病機制十分復雜。ATX是溶血磷脂酸生成相關的關鍵酶,參與增殖、轉移等細胞生物學過程,與多種炎癥及纖維化疾病有關[13]。研究顯示[14],致癌物二氧化硅顆粒能在呼吸道上皮細胞中引起NLRP3依賴性線粒體去極化及ATX活化,從而引起DNA損傷,加入ATX抑制劑能阻止NLRP3依賴性線粒體去極化,提示ATX與NLRP3密切相關。Angptl4是Angptl家族成員之一,該家族成員具有血管生成素(Ang)相似結構,但功能上卻有明顯差異,在糖脂代謝紊亂、炎癥等疾病中起重要調控作用[15]。Wu等[16]研究顯示,慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者循環(huán)血中Angptl4水平升高,且與肺部多種炎癥因子有關;NLRP3炎癥小體活化介導炎癥反應在COPD及其他肺部炎癥疾病中的作用已有多項研究證實[17-18],推測Angptl4與NLRP3炎癥小體活化有關。S100A12是S100鈣結合蛋白家族成員之一,主要表達于骨髓細胞及受損細胞中,當細胞損傷或發(fā)生炎癥反應時大量表達,參與調控促炎反應。有研究[19]發(fā)現(xiàn),S100A12可作為特發(fā)性肺纖維化患者病情嚴重程度及預后的標志物。從上述研究可知,ATX、Angptl4及S100A12表達水平與炎癥反應密切相關,推測三者可能參與膿毒癥患者ARDS的發(fā)生和發(fā)展過程。NLRP3炎癥小體是一種多蛋白復合體,活化后可產(chǎn)生多種炎癥因子如IL-1β、IL-18及細胞焦亡因子的釋放,在機體急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[20]。多種病因導致的ARDS發(fā)病實質上是一種過度炎癥反應,已有研究證實,NLRP3炎癥小體的形成和活化參與ARDS病情進展,且有望成為該病治療的潛在靶點[21]。

本研究發(fā)現(xiàn),ARDS組血清ATX、Angptl4、S100A12、NLRP3、IL-1β及IL-18水平均高于非ARDS組,提示膿毒癥并發(fā)ARDS患者血清ATX、Angptl4、S100A12水平升高。炎癥反應在膿毒癥并發(fā)ARDS進程中發(fā)揮關鍵作用,血清ATX、Angptl4、S100A12水平與炎癥反應密切相關。Trovato等[22]報道,急性-慢性肝衰竭患者血清ATX水平升高,與IL-6、腫瘤壞死因子-α相關,且能促進溶血磷脂酸依賴性PBMCs活化,引起全身炎癥反應,導致病死率增加;Jia等[23]報道ATX在ARDS、非纖維化、病毒性肺炎中均表達升高,提示ATX可作為多種肺部疾病的潛在治療靶點。說明ATX能通過促進炎癥反應參與加重呼吸系統(tǒng)重癥風險。動物學研究[24]顯示,沉默Angptl4可抑制核因子-κB介導的炎癥反應,從而減少骨關節(jié)炎小鼠局部炎癥反應;另有報道證實Angptl4上調能加重胰腺腺泡細胞損傷,從而加重胰腺炎[25],說明Angptl4參與多種急慢性炎癥疾病進展。Qiu等[24]研究顯示,入院時血清S100A12水平高與急性原發(fā)性腦出血患者炎癥反應程度有關,且與神經(jīng)功能惡化高度相關能夠反映疾病預后轉歸;Cem等[25]發(fā)現(xiàn),S100A12水平在大動脈炎患者糞便樣本中升高,能夠反映腸道受累程度及大動脈炎活動度。這說明S100A12在多種炎癥性疾病中高表達。從上述研究可知,ATX、Angptl4、S100A12均能促進炎癥介質的釋放,而本研究通過相關性分析可知,ATX、Angptl4、S100A12與NLRP3 mRNA及其細胞因子(IL-1β、IL-18)水平均呈正相關,分析其可能原因為膿毒癥并發(fā)ARDS實質上是炎癥反應失控所致,外源性因素誘發(fā)炎癥小體活化,ATX、Angptl4、S100A12水平升高進一步促進炎癥因子釋放,釋放的炎癥因子之間又存在相互作用,導致肺毛細血管內皮細胞及上皮細胞進一步受損,肺水腫加劇,最終導致疾病惡化、進展。

本研究采用logistic回歸分析法剔除了年齡、血乳酸、OI、白蛋白、是否休克等因素后發(fā)現(xiàn),入院時APACHE Ⅱ、SOFA評分、血清ATX、Angptl4、S100A12高水平均是導致患者死亡的危險因素,提示血清ATX、Angptl4、S100A12升高與并發(fā)ARDS的膿毒癥患者近期預后關系密切。APACHE Ⅱ與SOFA評分是評估危重癥患者病情程度及預后的常用指標,APACHE Ⅱ評分對預后預測的敏感度更好。血清ATX、Angptl4、S100A12高水平同樣能夠增加膿毒癥并發(fā)ARDS近期死亡風險,分析可能與其能夠促進機體炎癥反應有關。Araki等[26]研究認為,血清ATX可通過促進溶血磷脂酸的產(chǎn)生促進心肌炎癥及纖維化,從而導致擴張型心肌病不良臨床結局增加風險;Jung等[27]在胰腺炎研究中發(fā)現(xiàn),Angptl4可促進胰腺炎炎癥反應,加重胰腺炎嚴重程度;Angptl4是慢性間質性肺炎肺纖維化的關鍵調節(jié)因子,在肺纖維化急性期至慢性期的肺組織中顯著上調。說明Angptl4可能通過促進炎癥反應,從而不利病情轉歸。?berg等[28]研究顯示,轉移性前列腺癌患者血漿S100A12水平和PBMCs計數(shù)增多,兩者水平升高與前列腺癌預后生存期縮短有關;S100A12水平與社區(qū)獲得性肺炎病情嚴重程度、炎性細胞因子相關,其水平升高提示住院期間死亡風險升高。上述研究說明ATX、Angptl4、S100A12可通過促進機體中過度的炎癥反應進一步失控,大量炎性細胞滯留于肺組織內被激活,炎癥“瀑布樣連鎖反應”啟動,大量促炎介質進入血液循環(huán),肺部及全身性炎癥反應加劇,導致預后死亡風險增加。本研究進一步經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn),血清ATX、Angptl4、S100A12及三者聯(lián)合預測膿毒癥并發(fā)ARDS患者住院期間死亡的AUC(95%CI)分別為0.729(0.455～0.984)、0.708(0.501～0.922)、0.780(0.596～0.959)、0.852(0.712～0.985),三血清指標聯(lián)合預測效能高于單項檢測,說明聯(lián)合檢測血清ATX、Angptl4、S100A12有助于膿毒癥并發(fā)ARDS患者短期預后的判斷。

綜上所述,膿毒癥并發(fā)ARDS患者血清ATX、Angptl4、S100A12水平升高,與NLRP3炎性小體及其細胞因子關系密切,且是影響患者住院期間病情轉歸的獨立危險因素,聯(lián)合檢測血清ATX、Angptl4、S100A12有助于膿毒癥并發(fā)ARDS患者短期預后的判斷。提示臨床中可通過監(jiān)測膿毒癥患者ATX、Angptl4、S100A12水平變化了解患者病情進展,及時實施合理有效的措施改善患者的臨床結局。

利益相關聲明：所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻說明：燕莎:醞釀和設計試驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草論文;朱亞、楊建旭:支持實施研究、分析/解釋數(shù)據(jù)、對論文的知識性內容作批評性審閱、技術或材料支持;付毓平:支持實施研究、對論文的知識性內容作批評性審閱、指導;牛小斌、李永偉:支持實施研究、獲取研究經(jīng)費及行政、采集數(shù)據(jù)、對論文的知識性內容作批評性審閱、指導。