丁文珺, 金劍, 丁文聰, 原陽(yáng)陽(yáng), 岳晏如

1鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院(河南省婦幼保健院)科研中心(河南鄭州 450052); 2南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院神經(jīng)外科(河南鄭州 421002)

自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)是一種最早于幼兒期發(fā)病的神經(jīng)發(fā)育障礙,其特征是社交互動(dòng)和溝通技巧以及刻板行為和興趣的缺陷[1]。根據(jù)自閉癥和發(fā)育障礙監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)最近進(jìn)行的流行病學(xué)研究,美國(guó)8歲兒童中ASD的患病率為1.68%,遺傳、表觀遺傳和環(huán)境因素與 ASD 的病因有關(guān)[2]。而ASD的病因尚不清楚,臨床實(shí)踐中缺乏用于診斷ASD或測(cè)量癥狀的可靠生物標(biāo)志物。高達(dá)80%的ASD兒童有睡眠問題,失眠是最常見的主訴之一,根據(jù)體動(dòng)記錄儀或PSG確定,與正常發(fā)育的同齡人相比,患有ASD的兒童總睡眠時(shí)間縮短,睡眠潛伏期延長(zhǎng),睡眠效率降低[3]。研究顯示ASD患兒睡眠障礙的假說為調(diào)節(jié)基本晝夜節(jié)律的下丘腦-垂體-腎上腺環(huán)路異常,以及激素/神經(jīng)遞質(zhì)[褪黑素/ 5-羥色胺(5-TH)]產(chǎn)生的變化異常[4]。而orexin是由下丘腦orexin神經(jīng)元所分泌出的一種具有促進(jìn)食欲和攝食作用的小分子神經(jīng)肽,其主要功能是調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期,還參與調(diào)節(jié)各種其他關(guān)鍵的身體功能,如喂養(yǎng)行為、能量平衡、壓力反應(yīng)、獎(jiǎng)勵(lì)處理、情緒和認(rèn)知。研究發(fā)現(xiàn)orexin及其受體都是維持覺醒所必需的,它們的缺失或缺陷可以導(dǎo)致人類和動(dòng)物出現(xiàn)發(fā)作性睡病[5]。但相反的是,在孤獨(dú)癥兒童血液中檢測(cè)到,orexin的含量較高,5-HT、褪黑素含量較少,這可能就是導(dǎo)致他們有睡眠障礙的原因之一[6]。但關(guān)于orexin的研究還處于初期,而本研究主要探索孤獨(dú)癥譜系障礙患兒血液成分與睡眠障礙的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年1月至2022年12月醫(yī)院被診斷患有ASD患者24例及健康對(duì)照組18例。將ASD患者根據(jù)自閉癥診斷觀察時(shí)間表(ADOS)評(píng)分分界點(diǎn)(12分),將ASD患兒分為重度ASD(11例,ADOS評(píng)分≥12)和輕度ASD(13例,ADOS評(píng)分<12)[7]。排除標(biāo)準(zhǔn):排除其他精神類疾病。根據(jù)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn),長(zhǎng)時(shí)間的夜間醒來會(huì)改變睡眠效率,其定義為睡眠與總睡眠時(shí)間的比率[睡眠時(shí)間/(總臥床時(shí)間-入睡時(shí)間)],睡眠效率達(dá)到或高于85%被認(rèn)為是良好的睡眠[8]。根據(jù)睡眠分?jǐn)?shù)分為睡眠良好組和睡眠不良組。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)【倫審】2021-064-01)。

1.2 采集血液樣本 將外周血(非空腹)收集到抗凝劑處理的試管中(EDTA)。收集后立即倒置管子,按照標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)DTA與血液混合。在Eppendorf 5810R離心機(jī)中,在室溫下以3 500 r/min離心樣品10 min。將收獲的血漿儲(chǔ)存在-80℃,并在樣品首次解凍當(dāng)天進(jìn)行分析。將樣品在冰上解凍,并提供100 μL等分試樣用于測(cè)定。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血漿中orexin表達(dá)水平 將標(biāo)準(zhǔn)、空白和樣品孔設(shè)置在酶板上,用稀釋劑將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1.0～2.0 μg/mL,并用50 μL稀釋液加入每個(gè)孔。后將40 μL樣品稀釋液加入酶板的樣品孔中,并加入10 μL樣品進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試,避免觸摸周圍的管壁加樣完成后,輕輕搖晃。并將酶板用密封膜密封,并在37℃下保溫30 min。接下來,揭開密封膜,將液體丟棄在孔中,并用稀釋的洗滌液洗滌每個(gè)孔5次。除空白孔外,向每個(gè)孔中加入50 μL酶標(biāo)準(zhǔn)試劑,用密封膜密封板,并保溫30 min,然后將液體丟棄,在每個(gè)孔中洗滌5次。后將50μL顯色試劑A和50 μL顯色試劑B加入到每個(gè)孔中。搖動(dòng)后,在37℃的溫度下避免光污染反應(yīng)15 min。最后,向每個(gè)孔中加入50 μL停止溶液,空白孔值為零,在15 min內(nèi),在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量每個(gè)孔中的OD值。

2 結(jié)果

2.1 ASD組和對(duì)照組患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和orexin水平 本研究共收集了24例ASD患者,13例男性和11例女性,年齡(7.78±1.67)歲,BMI(7.78±1.67)kg/m2,而對(duì)照組共18例,7例男性和11例女性,年齡(8.68±1.95)歲,BMI為(7.79±2.53)kg/m2,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而ASD組的orexin為1 402.4±100.60,而對(duì)照組為1 064.24±71.82,明顯低于ASD組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 ASD組和對(duì)照組患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和orexin水平

2.2 ASD患者及睡眠不良患者orexin水平 與輕度ASD患者比較,重度ASD患者的血漿orexin水平較高;與睡眠良好組比較,睡眠不良組的血漿orexin水平較高,患者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注:*P<0.05

2.3 orexin水平與ASD評(píng)分及睡眠分?jǐn)?shù)的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)orexin水平與ASD評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.887,P<0.001),orexin水平與睡眠分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.821,P<0.001),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

圖2 orexin水平與ASD評(píng)分及睡眠分?jǐn)?shù)的相關(guān)性

2.4 血漿orexin水平對(duì)ASD患者的預(yù)測(cè)價(jià)值 為了獲得ASD患者預(yù)測(cè)價(jià)值,以ASD分?jǐn)?shù)≥12其預(yù)后作為狀態(tài)變量進(jìn)行ROC曲線分析。重度ASD組orexin水平的曲線下面積(AUC)為0.675,95%CI為0.511～0.846,標(biāo)準(zhǔn)誤為0.085,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045)。見圖3。

3 討論

患有ASD的兒童極易受到睡眠問題的影響,潛在的生物和行為節(jié)律使其易受到影響睡眠的外在和內(nèi)在壓力源的影響[9]。暫沒有根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度來呈現(xiàn)orexin的水平以及orexin與睡眠障礙的相關(guān)性研究,因此該研究的結(jié)果為orexin作為ASD睡眠異常的相關(guān)性生物標(biāo)志物非常重要。本研究通過ASD患兒研究其血液成分與睡眠障礙的關(guān)系,為ASD嚴(yán)重程度提供一定的參考依據(jù)。

orexin纖維在大腦中分布廣泛,具有許多生理功能,例如興奮、睡眠調(diào)節(jié)、認(rèn)知、應(yīng)激、食欲和新陳代謝,orexin功能障礙也與各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān),包括成癮、抑郁、焦慮和精神分裂癥[10]。由于ASD患者睡眠障礙的患病率高,可假設(shè)orexin系統(tǒng)性改變可能與這些疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。研究顯示ASD患者的睡眠障礙取決于與5-HT和褪黑激素降低相關(guān)的食欲素系統(tǒng)活性增加(可能是杏仁核功能障礙所致)[11]。一項(xiàng)研究顯示,ASD患者血漿中的orexin A水平高于健康人群,強(qiáng)調(diào)了ASD組中催產(chǎn)素和orexin A的血漿水平之間的強(qiáng)相關(guān)性[12]。在這項(xiàng)研究中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組比較,ASD患者orexin水平顯著升高,此外,orexin與ASD呈正相關(guān),與睡眠分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。表明orexin與ASD患者睡眠成相關(guān)性。

由于ASD是最普遍的神經(jīng)發(fā)育障礙之一,發(fā)病率不斷上升并產(chǎn)生相應(yīng)經(jīng)濟(jì)后果,該領(lǐng)域的研究正在尋找有助于早期診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物[13]。此外,兒童治療管理的黃金標(biāo)準(zhǔn)仍然是年齡和病理學(xué)調(diào)整的行為治療,因此非常需要執(zhí)行功能藥物增強(qiáng)劑來放大心理治療的效果。研究顯示orexin功能障礙與認(rèn)知功能的神經(jīng)疾病的治療靶點(diǎn)相關(guān),神經(jīng)心理缺陷本身可能是由于睡眠剝奪而產(chǎn)生的,而不是orexin系統(tǒng)中特定的潛在神經(jīng)病理學(xué)所導(dǎo)致的[6]。因此,認(rèn)知缺陷可能不是直接由orexin功能障礙引起的,而是嗜睡的次要結(jié)果[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)重度ASD患者及睡眠不良組orexin水平升高,此外,orexin預(yù)測(cè)重度ASD組的AUC為0.675。這表明orexin可以作為行為ASD的潛在標(biāo)志物,結(jié)合特定的診斷測(cè)試,如ADOS和ADI-R。但本研究有以下局限性。首先,本研究為單中心、小樣本研究,其結(jié)論需要在多中心、大樣本研究中得到證實(shí)。

綜上所述,本研究顯示ASD患者及重度ASD患者orexin水平升高,orexin預(yù)測(cè)重度ASD組的AUC為0.675;此外,其睡眠不良組orexin水平升高更明顯,且orexin水平與ASD評(píng)分呈正相關(guān),睡眠分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。研究表明orexin水平對(duì)ASD患者具有一定的診斷價(jià)值,可以作為ASD患者嚴(yán)重程度的相關(guān)指標(biāo)。

利益相關(guān)聲明：本文所有作者聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：丁文珺:負(fù)責(zé)論文的全部撰寫和進(jìn)行研究設(shè)計(jì);金劍、丁文聰、原陽(yáng)陽(yáng):負(fù)責(zé)實(shí)施本論文中病例收集、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)等;岳晏如:在論文撰寫修改、討論以及研究設(shè)計(jì)中有做出貢獻(xiàn)。