李少儒, 戶瑞麗, 秦海霞

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科(河南新鄉(xiāng) 453100)

卵巢癌是我國(guó)女性生殖系統(tǒng)腫瘤病死率居于首位的惡性腫瘤之一[1]。由于卵巢癌臨床特征不明顯,在多數(shù)情況下,患者卵巢癌被確診時(shí)其腫瘤分期已達(dá)到Ⅲ期或Ⅳ期,治療效果極差,通過(guò)手術(shù)治療后易復(fù)發(fā),危害著患者身心健康[2]。輔助化療是中晚期卵巢癌及卵巢癌術(shù)后的主要治療策略。由于藥物的價(jià)格、耐受性等限制,使卵巢癌的治療受到限制。因此深入了解卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制,尋找新的分子靶點(diǎn),并明確藥物的耐藥機(jī)制和增加化療敏感性對(duì)于改善卵巢癌患者預(yù)后是意義重大的。MicroRNA可通過(guò)降解靶mRNA 或抑制其翻譯,從而調(diào)控基因的表達(dá),并調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和組織分化等[3-4]。數(shù)據(jù)表明,MicroRNA在腫瘤發(fā)生中起重要作用。MicroRNA 作為致癌基因或腫瘤抑制基因[5]。與正常組織相比,癌癥組織中MicroRNA譜的改變表明特定MicroRNA可能代表新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物[6]。最近的研究表明,在多種癌細(xì)胞中miR-184的表達(dá)異常,并且miR-184可通過(guò)調(diào)控靶基因或信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖[7-9]。FOXO3是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、新陳代謝等多個(gè)方面,并且對(duì)癌細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵作用。然而,關(guān)于miR-184是否參與促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖,在卵巢癌的發(fā)展中發(fā)揮何種作用,以及是否調(diào)控卵巢癌細(xì)胞中FOXO3基因的表達(dá)目前尚不清楚。因此本研究旨在探討miR-184通過(guò)調(diào)節(jié)FOXO3促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響,為探討其在卵巢癌發(fā)生以及發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年8月至2020年10月期間于我院就診的21例卵巢癌患者的癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。患者年齡39～61(48.5±6.2)歲。所有患者均為首次發(fā)現(xiàn)卵巢癌,既往病史無(wú)特殊,入組前3個(gè)月未進(jìn)行任何治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LHGJ20200525),所有患者和家屬均告知并簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞和主要試劑 人源卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和人卵巢上皮細(xì)胞IOSE80購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(貨號(hào):SH30251)、胎牛血清(FBS,貨號(hào):SH30084)、0.25%的胰酶消化液(貨號(hào)SH30042)及10×磷酸鹽緩沖液(PBS,貨號(hào):SH30156)購(gòu)買(mǎi)至Sigma公司;CyclinD1、p27kip1、FOXO3和β-actin抗體由Abcam公司提供;TaqMan? MicroRAN Reverse Transcription試劑盒(貨號(hào):4366596)、TaqMan? Universal PCR Mas-ter Mix(貨號(hào):4324018)由ABI公司提供;miR-184 mimics、mimics對(duì)照物、miR-184 inhibitor和inhibitor對(duì)照物由上海生工生物有限公司提供;miR-184 mimics正義鏈:UACGCAUACGAAUCAGUAG,反義鏈:CUACUGAUUCGUAUGCGUA;mimics對(duì)照物正義鏈:UUCACGGAUCGUAACUGCU,反義鏈:AGCAGUUACGAUCCGUGAA;miR-184 inhibitor正義鏈:AGGCAACAAAGUGAGACGU,反義鏈:ACGUCUCACUUUGUUGCCU;inhibitor對(duì)照物正義鏈UGGACGGAGAACUGAUAAGGGU,反義鏈: ACCCUUAUCAGUUCUCCGUCCA。Lipo-fectamine? 2000 Transfection Reagent(貨號(hào):11668027)和TRIzol試劑(貨號(hào):15596-026)由Invitrogen公司提供;噻唑藍(lán)(MTT,貨號(hào):M2128)購(gòu)買(mǎi)于Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 卵巢癌細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 (1)細(xì)胞復(fù)蘇:從液氮罐中取出的人源卵巢癌細(xì)胞SKOV3,37℃水浴鍋融化,隨后4℃ 、300 r/min離心3 min,棄去上清液,加入將細(xì)胞重懸(1 mL RPMI -1640培養(yǎng)液(含10% FBS)),置于培養(yǎng)皿中,放入 CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)生長(zhǎng)至細(xì)胞密度為70%～80%時(shí),對(duì)其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞,將SKOV3細(xì)胞調(diào)整為2×106個(gè)/mL的密度,接種與6孔板中,于培養(yǎng)箱中,37℃培養(yǎng)24 h,當(dāng)細(xì)胞密度融合至70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染過(guò)程參考Lipo-fectamine? 2000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。分別將miR-184 mimics、mimics對(duì)照物、miR-184 inhibitor和inhibitor對(duì)照物轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染完成后于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24,48和72 h后,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。具體過(guò)程如下:轉(zhuǎn)染后在不同時(shí)間點(diǎn)(24、48和72 h)分別收集細(xì)胞于96孔板,加入20 μL MTT溶液,置于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h,棄上清液后再加入120 μL二甲基亞砜,診斷裂解10 min。待沉淀完全溶解后,采用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。縱坐標(biāo)為測(cè)得的OD值,橫坐標(biāo)為時(shí)間,進(jìn)行細(xì)胞增殖曲線的繪制。檢測(cè)miR-184 mimics和miR-184 inhibitor對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖活力的影響。

1.3.3 Q-PCR檢測(cè)miR-184在細(xì)胞和組織中的表達(dá)水平 細(xì)胞中的RNA使用TRIzol進(jìn)行提取。提起后的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,獲得cDNA樣品。將獲得的cDNA濃度調(diào)整為50 ng/μL,采用SYBR premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。以U6為內(nèi)參基因,以相對(duì)定量2-ΔΔCt分析組織和細(xì)胞中miR-184相對(duì)表達(dá)水平?；蛞镄蛄幸?jiàn)表1。

表1 基因引物序列

1.3.4 QPCR檢測(cè)FOXO3、cyclinD1和p27 mRNA的表達(dá) TRIzol法分別提取細(xì)胞中的RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,將獲得的cDNA濃度調(diào)整為50 ng/μL,采用SYBR premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參基因,以相對(duì)定量2-ΔΔCt分析細(xì)胞中FOXO3、cyclinD1和p27 mRNA相對(duì)表達(dá)水平?；蛞镄蛄幸?jiàn)表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS 20.0和Microsoft Office Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并使用GraphPad Prism 7.0制圖,差異比較通過(guò)one-way ANOVA分析評(píng)估,數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織和細(xì)胞中miR-184的表達(dá)水平 如圖1A所示,與癌旁組織相比,卵巢癌組織中miR-184表達(dá)顯著升高;如圖1B所示,與IOSE80組相比,SKOV3細(xì)胞中miR-184表達(dá)顯著升高。

注: A: miR-184在卵巢癌組織和癌旁組織的表達(dá)水平; B:miR-184在人卵巢上皮細(xì)胞IOSE80和人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中的表達(dá)水平;*P<0.05

2.2 人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中FOXO3、cyclin D1和p27 mRNA的表達(dá)水平 如圖2所示,與IOSE80細(xì)胞相比,SKOV3細(xì)胞中FOXO3和p27 mRNA表達(dá)水平顯著降低,而cyclin D1 mRNA表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注: A:人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中FOXO3 mRNA的表達(dá)水平; B:人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中cyclin D1 mRNA的表達(dá)水平; C:人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中p27 mRNA的表達(dá)水平;*P<0.05

2.3 轉(zhuǎn)染miR-184 minmic和miR-184 inhibitor對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中miR-184表達(dá)的影響 如圖3所示,與SKOV3組、NC-mimic組和NC-inhibitor組相比,miR-184 mimic組細(xì)胞中miR-184表達(dá)顯著升高,而miR-184 inhibitor組細(xì)胞中miR-184表達(dá)顯著降低,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注:*與SKOV3組比較P<0.05; #與NC組比較P<0.05

2.4 miR-184 對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖活性的影響 如圖4所示,轉(zhuǎn)染miR-184 mimic組細(xì)胞比轉(zhuǎn)染miR-184 inhibitor組細(xì)胞增殖活性更高。結(jié)果表明miR-184能夠促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖活性(P<0.05)。

注: *與SKOV3組比較P<0.05; #與NC組比較P<0.05

2.5 miR-184對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中FOXO3、cyclin D1和p27 mRNA表達(dá)的影響 如圖5所示,在過(guò)表達(dá)miR-184后,SKOV3細(xì)胞的cyclin D1 mRNA表達(dá)量顯著升高,而FOXO3和p27 mRNA表達(dá)量則顯著降低(P<0.05)。與此相反,當(dāng)抑制miR-184的表達(dá)后,SKOV3細(xì)胞的cyclin D1 mRNA表達(dá)量顯著降低,而FOXO3和p27 mRNA表達(dá)量則顯著升高(P<0.05)。

注:A:FOXO3 mRNA表達(dá);B:cyclin D1 mRNA表達(dá);C:p27 mRNA表達(dá)。*與SKOV3組比較P<0.05; #與NC組比較P<0.05

3 討論

卵巢癌是嚴(yán)重威脅廣大女性身心健康的惡性生殖系統(tǒng)腫瘤之一,5年生存率僅為30%左右[10]。卵巢癌發(fā)病隱匿,確診時(shí)多已為中晚期,且病情發(fā)展迅速,致死率居高不下[11]。目前,卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制尚不清除,且缺乏高效的治療靶點(diǎn)。因此,探索卵巢癌治療的新靶點(diǎn)是迫切需要的。

MicroRNA是一類廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的長(zhǎng)度為21～25nt的非編碼RNA,通過(guò)與目的基因mRNA的3′-URT區(qū)域堿基互補(bǔ)配對(duì)而調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。MicroRNA是多種生物過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子,包括增殖、分化、遷移和凋亡,并在不同組織中差異表達(dá)[12]。最近研究表明,miR-184的異常表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性[5,7,13]。馮強(qiáng)[14]研究發(fā)現(xiàn)在腎癌患者中腎癌組織中miR-184的表達(dá)水平低于癌旁組織,其細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-184的表達(dá)升高會(huì)抑制癌細(xì)胞的增殖能力,表明miR-184可能作為腎癌細(xì)胞的抑癌因子。Li等[5]研究表明,卵巢癌細(xì)胞中miR-184 mRNA表達(dá)顯著升高。Cui等[15]研究表明,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中miR-184表達(dá)顯著升高,并且miR-184的表達(dá)水平隨神經(jīng)膠質(zhì)瘤級(jí)別的增加而升高。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)人卵巢癌組織、正常卵巢組織、人卵巢癌細(xì)胞SKOV3和人卵巢上皮細(xì)胞IOSE80,結(jié)果表明:miR-184在卵巢癌組織和人卵巢癌細(xì)胞SKOV3表達(dá)水平顯著升高。過(guò)表達(dá)miR-184后,人卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖能力顯著提高,而抑制miR-184表達(dá)后,人卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖能力顯著降低。這表明miR-184在促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

叉頭轉(zhuǎn)錄因子FOXO家族包括FOXO1、FOXO3a和FOXO4,是ATK蛋白激酶的主要靶蛋白,在細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程中起著重要作用[16]。FOXO家族分子能夠直接通過(guò)調(diào)控與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的基因p27kip1和cyclin D1的轉(zhuǎn)錄而調(diào)控細(xì)胞的增殖[17]。最近一些研究表明,在不同惡性程度的腫瘤中FOXO3的表達(dá)水平和蛋白水平均出現(xiàn)顯著降低現(xiàn)象[12,18-19]。陳莉萍等[20]研究發(fā)現(xiàn),在卵巢癌組織中FOXO3的mRNA水平和蛋白水平顯著降低。Cui等[15]也研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中FOXO3的蛋白表達(dá)顯著降低。上述研究結(jié)果都顯示FOXO3蛋白的表達(dá)異常與惡性腫瘤的發(fā)生存在相關(guān)性。本研究結(jié)果表明,FOXO3a和p27 mRNA表達(dá)水平在SKOV3細(xì)胞中顯著降低,而cyclin D1 mRNA表達(dá)水平則顯著降低。此外,過(guò)表達(dá)miR-184后,SKOV3細(xì)胞的cyclin D1 mRNA表達(dá)水平顯著升高,而FOXO3和p27 mRNA表達(dá)水平則顯著降低;而抑制miR-184后則與此相反。上述結(jié)果表明,miR-184可能通過(guò)調(diào)控FOXO3而影響與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的基因p27kip1和cyclin D1的轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述,上調(diào)miR-184促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖能力是調(diào)節(jié)FOXO3從而影響其下游與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的靶基因從而影響細(xì)胞增殖能力的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-184可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,可為治療卵巢癌提高潛在的靶點(diǎn)。

利益相關(guān)聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：李少儒設(shè)計(jì)了這項(xiàng)研究,分析了數(shù)據(jù),進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)并撰寫(xiě)了論文。戶瑞麗設(shè)計(jì)了這項(xiàng)研究并分析了數(shù)據(jù)以及進(jìn)行了試驗(yàn)。秦海霞整理了數(shù)據(jù)。