李儒琳, 杜壯文, 王恩梁

瓊海市人民醫(yī)院脊柱外科(海南瓊海 571400)

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種典型的脊柱關(guān)節(jié)炎,其特征是脊柱、骶髂關(guān)節(jié)、脊柱附著點(diǎn)等中軸骨骼發(fā)生炎癥性損傷[1-2]。AS的病理變化伴有免疫系統(tǒng)的變化,免疫系統(tǒng)與骨骼系統(tǒng)之間的調(diào)控和交叉調(diào)控已成為AS發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)[3]。巨噬細(xì)胞是一類(lèi)重要的先天免疫細(xì)胞,在多種炎癥性疾病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,例如AS、炎癥性腸病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和癌癥等[4]。巨噬細(xì)胞在受到不同的刺激時(shí),可以極化為M1和M2兩種不同的表型[5]。M1巨噬細(xì)胞具有清除細(xì)菌并控制感染等功能,但過(guò)度的浸潤(rùn)會(huì)釋放大量促炎性因子,破壞組織并加重組織病理?yè)p傷。研究表明,與健康人群相比,AS患者外周血中M1型巨噬細(xì)胞比例顯著增加,并且白細(xì)胞介素1-β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)分泌水平顯著上調(diào),表明M1巨噬細(xì)胞參與了AS疾病發(fā)展[6]。肽?；彼崦搧啺访?(PAD4)在巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用[7]。有研究發(fā)現(xiàn),在LPS刺激巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中,PAD4基因表達(dá)上調(diào),表明PAD4可能調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞極化過(guò)程[8]。然而PAD4介導(dǎo)的M1巨噬細(xì)胞極化在強(qiáng)直性脊柱炎中是否發(fā)揮作用尚不清楚,其分子機(jī)制也需進(jìn)一步闡明。在本研究中,通過(guò)檢測(cè)AS患者體內(nèi)PAD4以及M1巨噬細(xì)胞標(biāo)記物水平,初步驗(yàn)證二者于AS疾病嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性,并體外采用PAD4抑制劑Cl-amidine抑制PAD4酶活性,進(jìn)一步探討PAD4對(duì)于M1巨噬細(xì)胞極化的影響與分子機(jī)制,為AS的治療提供可能的分子靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本 收集我院2021年6月至2022年12月的AS患者60例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)胸廓活動(dòng)度≤4 cm;(2)脊柱痛評(píng)分≥4分;(3)巴氏強(qiáng)直性脊柱炎活動(dòng)性指數(shù)≥4;(4)近2周內(nèi)未服用免疫抑制劑,近3個(gè)月未使用生物制劑。同期納入30例健康受試者為對(duì)照組。所有實(shí)驗(yàn)者都簽署知情同意書(shū),本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批通過(guò)(倫理編號(hào):202105-03)。

1.2 細(xì)胞和主要試劑 THP-1細(xì)胞(貨號(hào):CL-0233)、含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號(hào):PM150110B)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;人的PAD4(貨號(hào):ml062499)、一氧化氮合酶(iNOS)(貨號(hào):ml061044)和骨鈣素(BGP)(貨號(hào):ml058528)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EILSA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;白細(xì)胞分化抗原14(CD14)(貨號(hào):565283)、CD68(貨號(hào):556078)、CD86(貨號(hào):612784)購(gòu)自美國(guó)BD公司;Cl-amidine(貨號(hào):ajci22092)購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司;RIPA裂解液(貨號(hào):P0013B)購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司;佛波酯(PMA)(貨號(hào)P6741)、LPS(貨號(hào):L8880)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;PAD4抗體(貨號(hào): ab128086))、iNOS抗體(貨號(hào):ab178945)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號(hào):ab8245)、Janus激酶3(JAK3)抗體(貨號(hào):ab45141)、磷酸化Janus激酶3(p-JAK3)抗體(貨號(hào):ab278789)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活轉(zhuǎn)錄蛋5(STAT5)抗體(貨號(hào):ab32364)、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活轉(zhuǎn)錄蛋白5(p-STAT5)抗體(貨號(hào):ab278764)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(貨號(hào):ab6721)購(gòu)自美國(guó)abcam;NEB Next Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina試劑盒(貨號(hào):E7530)購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs;Trizol裂解液(貨號(hào):abs9331)購(gòu)自愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司。

1.3 AS患者的疾病活動(dòng)度評(píng)分 采用3種方式將患者分為低AS疾病患者和高AS疾病患者[9]:(1)患者總體評(píng)價(jià):患者根據(jù)自身情況采用數(shù)字評(píng)分法(VAS)評(píng)分(0～10分;0:疾病無(wú)影響,10:疾病影響十分嚴(yán)重);VAS評(píng)分≥6分記為高AS疾病患者。(2)醫(yī)生總體評(píng)價(jià):醫(yī)生根據(jù)患者的癥狀、體檢及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果,采用VAS對(duì)患者進(jìn)行評(píng)價(jià)(0～10分;0:疾病無(wú)影響,10:疾病影響十分嚴(yán)重);VAS評(píng)分≥6分記為高AS疾病患者。(3)患者是否需要強(qiáng)化治療決策:由2位醫(yī)生對(duì)患者進(jìn)行綜合判斷,決定患者是否需要更改治療,若維持原始治療認(rèn)為低AS疾病患者,若更改治療方式認(rèn)為高AS疾病患者。

1.4 EILSA檢測(cè)PAD4、iNOS和BGP水平 分別按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)指示進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50 μL于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1 h。每孔加入80 μL的親和鏈酶素,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30 min。甩去孔內(nèi)液體,每孔加入底物A、B各50 μL,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10 min。避免光照。取出酶標(biāo)板,迅速加入50 μL終止液,加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞比例 清晨抽取受試者空腹外周靜脈血4 mL,500g 離心收集細(xì)胞。加入CD14、CD68、CD86抗體檢測(cè)M1單核細(xì)胞,振蕩混勻,室溫避光反應(yīng)40 min;加入2 mL 熒光激活細(xì)胞分離儀溶血?jiǎng)?振蕩混勻,室溫避光放置10 min;于2～8 ℃暗處保存,24 h內(nèi)上機(jī)分析。

1.6 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)與分組誘導(dǎo) 人THP-1細(xì)胞使用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng),置于37℃、5%CO2恒溫的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。PMA溶解于二甲基亞砜中,稀釋成劑量為0.1 μg/mL,按照2 mL細(xì)胞懸液含4×105個(gè)THP-1細(xì)胞,添加20 μL PMA(100 ng/mL),將經(jīng)PMA刺激貼壁轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞更換培養(yǎng)基,誘導(dǎo)分化為M0巨噬細(xì)胞。將M0巨噬細(xì)胞分為3組:M0組、M1組、M1+Cl-amidine組。M0組不做處理;M1組加入LPS(10 pg/mL)刺激48 h,使M0向M1型細(xì)胞方向極化(M1組);M1+Cl-amidine組除了加入LPS(10 pg/mL)外,加入Cl-amidine(20 μmol/L)。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞,使用RIPA裂解液提取總蛋白。樣品變性后通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂牛奶4℃封閉1 h,吐溫-tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次,每次10 min。加入PAD4抗體(1∶1 000)、iNOS抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶5 000),4℃搖床孵育過(guò)夜。加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)37℃孵育1 h。TBST洗膜3次,每次10 min。顯影曝光,利用Image-J軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.8 RNA-seq檢測(cè)差異基因 使用Trizol試劑提取細(xì)胞組織中的總RNA,NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina試劑盒用于生成測(cè)序文庫(kù),Illumina測(cè)序由青島歐益生物科技有限公司進(jìn)行。去除原始序列中低質(zhì)量、接頭污染及未知堿基N含量過(guò)高的序列。參考文獻(xiàn)[10]的方法,通過(guò)SOAPnuke過(guò)濾總讀數(shù)。將過(guò)濾后的序列與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì),使用RSEM 1.2.8版本計(jì)算基因表達(dá)。倍數(shù)變化≥2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率≤0.05的基因被認(rèn)為是差異表達(dá)基因。使用京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)進(jìn)行信號(hào)通路富集分析:http://www.genome.jp/kegg/。

2 結(jié)果

2.1 AS患者血清PAD4、iNOS水平與疾病程度呈正相關(guān) ELISA結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,低AS疾病組血清中PAD4、iNOS水平升高,BGP水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與低AS疾病組相比,高AS疾病組血清中PAD4、iNOS水平進(jìn)一步升高,BGP水平進(jìn)一步降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示,PAD4水平與iNOS水平呈正相關(guān)(r=0.380 4,P<0.001),與BGP水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.265 6,P<0.001);iNOS水平與BGP水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.313 3,P<0.001),見(jiàn)圖1。

圖1 AS患者血清中PAD4、iNOS、GBP水平相關(guān)性分析

表1 3組人群血清中PAD4、iNOS、GBP水平比較

2.2 AS患者外周血M1型巨噬細(xì)胞比例升高 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,低AS疾病組外周血M1型巨噬細(xì)胞比例升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與低AS疾病組相比,高AS疾病組外周血M1型巨噬細(xì)胞比例進(jìn)一步升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2和表2。

圖2 三組人群外周血中M1型巨噬細(xì)胞水平比較

表2 3組人群外周血中M1型巨噬細(xì)胞比例比較

2.3 Cl-amidine抑制巨噬細(xì)胞向M1極化 Western blot結(jié)果顯示,與M0組相比,M1組PAD4和iNOS蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與M1組相比,M1+Cl-amidine組iNOS蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3和表3。

圖3 三組細(xì)胞中PAD4、iNOS蛋白表達(dá)水平比較

表3 3組細(xì)胞中PAD4、iNOS蛋白表達(dá)水平比較

2.4 RNA-seq解析Cl-amidine的作用機(jī)制 RNA-seq結(jié)果顯示,與M1組相比,M1+Cl-amidine組有163個(gè)基因表達(dá)上調(diào), 272個(gè)基因表達(dá)下調(diào),下調(diào)基因包括iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性相關(guān)基因,見(jiàn)圖4A。KEGG分析結(jié)果顯示,M1+Cl-amidine組下調(diào)基因主要參與JAK-STAT、TNF、核因子-κB(NF-κB)等炎性相關(guān)信號(hào)通路,見(jiàn)圖4B。

注:A:M1組和M1+Cl-amidine組差異基因火山圖及iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)差異;B:KEGG分析M1+Cl-amidine組下調(diào)基因。*代表P<0.05

2.5 Cl-amidine抑制巨噬細(xì)胞JAK3-STAT5信號(hào)通路 Western blot結(jié)果顯示,與M0組相比,M1組p-JAK3/ JAK3、p-STAT5/ STAT5蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與M1組相比,M1+Cl-amidine組p-JAK3/ JAK3、p-STAT5/ STAT5蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖5和表4。

圖5 三組細(xì)胞中p-JAK3/JAK3、p-STAT5/STAT5蛋白表達(dá)水平比較

表4 三組細(xì)胞中p-JAK3/ JAK3、p-STAT5/ STAT5蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)

3 討論

AS是一種免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的炎癥性疾病,特征是是中軸關(guān)節(jié)的骨質(zhì)增生和骨融合,在普通人群中的患病率約為1‰～3‰,患者通常為青壯年[11]。常見(jiàn)的幾種AS致病因素包括遺傳易感性、細(xì)菌感染和免疫系統(tǒng)失調(diào)等[12]。在臨床上,用于AS的治療藥物主要包括患者非甾體類(lèi)抗炎藥、TNF-α抑制劑和IL-17A拮抗劑,但是往往伴隨許多不良反應(yīng),例如上呼吸道感染、鼻咽炎、頭痛和腹瀉等[13]。鑒于生物療法在AS等免疫炎癥性疾病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用,尋找新的生物標(biāo)志物對(duì)于開(kāi)發(fā)新的臨床診療藥物意義重大。

一些研究已經(jīng)表征了在AS 患者中富集的炎癥免疫細(xì)胞亞群[14],表現(xiàn)為T(mén)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞過(guò)度活化和增殖,并伴隨滑膜組織高水平的細(xì)胞因子浸潤(rùn),例如IL-1β、IL-6、干擾素(IFN-γ)和TNF-α[15]。這種持續(xù)的炎癥激活反應(yīng)會(huì)引發(fā)患者持續(xù)高熱、全血細(xì)胞減少、肝脾腫大、肝功能障礙、腦病和凝血功能異常[16]。其中,巨噬細(xì)胞具有豐富的功能多樣性,是參與AS炎癥進(jìn)展的關(guān)鍵免疫細(xì)胞群。作為造血系統(tǒng)中重塑性最強(qiáng)的一類(lèi)免疫細(xì)胞,巨噬細(xì)胞可以根據(jù)環(huán)境條件變化而改變其生理功能,產(chǎn)生兩種具有不同功能的細(xì)胞亞群[17]:一是由經(jīng)典活化途徑產(chǎn)生的M1型巨噬細(xì)胞,以高表達(dá)iNOS為特征,往往由LPS單獨(dú)或與Th1 細(xì)胞因子(如 IFN-γ、TNF-α)聯(lián)合極化產(chǎn)生,具有促炎作用;二是M2型巨噬細(xì)胞,可高表達(dá)精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1),由Th2 細(xì)胞因子如 IL-4 和 IL-13 刺激極化產(chǎn)生,具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。當(dāng)M1/M2巨噬細(xì)胞失衡將會(huì)導(dǎo)致炎癥失調(diào),引發(fā)組織器官損傷[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),AS患者外周血M1型巨噬細(xì)胞比例及其標(biāo)志物iNOS水平增加,表明M1巨噬細(xì)胞參與AS疾病進(jìn)程,這與前人研究[6]結(jié)果一致。

PAD4基因位于人類(lèi)1號(hào)染色體上,編碼蛋白包含兩個(gè)N末端免疫球蛋白樣子域和一個(gè)高度保守的C末端催化結(jié)構(gòu)域[19]。PAD4 在調(diào)節(jié)基因表達(dá)和免疫功能等方面發(fā)揮多重作用,據(jù)報(bào)道,PAD4與巨噬細(xì)胞的激活和功能相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)[20]。另外,最近的一項(xiàng)關(guān)于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究發(fā)現(xiàn),M1型基因CC類(lèi)趨化因子受體(CCR7)與PAD4的表達(dá)呈正相關(guān),PAD4可以促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞的極化,表明PAD4可能是治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)[21]。BGP又稱(chēng)骨γ-羧谷氨酸包含蛋白,由成骨細(xì)胞合成,是評(píng)估骨形成能力的重要指標(biāo)。Cl-amidine是PAD4的抑制劑,可以抑制其活性[22]。本研究發(fā)現(xiàn),在AS患者體內(nèi),PAD4與iNOS表達(dá)呈正相關(guān),PAD4、iNOS與BGP呈負(fù)相關(guān),同時(shí)體外誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞PAD4表達(dá)上調(diào),而使用Cl-amidine抑制PAD4后可以抑制iNOS蛋白的表達(dá),阻止巨噬細(xì)胞向M1極化。以上結(jié)果說(shuō)明,PAD4可能參與AS患者體內(nèi)M1巨噬細(xì)胞極化,導(dǎo)致骨形成水平降低,進(jìn)而加重AS。

巨噬細(xì)胞極化是多因子多通路共同調(diào)控的結(jié)果[23]。為了進(jìn)一步探究Cl-amidine通過(guò)抑制PAD4介導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1極化的分子機(jī)制,采用RNA-seq結(jié)合KEGG分析尋找可能發(fā)揮作用的關(guān)鍵信號(hào)通路。結(jié)果表明,使用Cl-amidine后可以下調(diào)炎性基因表達(dá),并抑制JAK-STAT、TNF、NF-κB等炎性相關(guān)信號(hào)通路。之前的研究發(fā)現(xiàn),JAK3/STAT5參與多種炎癥疾病進(jìn)程,并參與巨噬細(xì)胞極化,例如楊非柯等[24]研究發(fā)現(xiàn),二氫楊梅素可通過(guò)JAK3/STAT5信號(hào)通路抑制OxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1型極化。通過(guò)檢測(cè)Cl-amidine作用后巨噬細(xì)胞的JAK3、STAT5磷酸化水平,本研究發(fā)現(xiàn)Cl-amidine可以顯著抑制JAK3/STAT5信號(hào)通路的激活。以上結(jié)果說(shuō)明,Cl-amidine拮抗PAD4通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞JAK3-STAT5信號(hào)通路抑制M1巨噬細(xì)胞極化。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),在AS患者中,PAD4和M1型巨噬細(xì)胞水平與其疾病程度呈正相關(guān)。PAD4抑制劑Cl-amidine可能通過(guò)JAK3-STAT5信號(hào)通路抑制巨噬細(xì)胞向M1極化。本研究為探索AS的生物標(biāo)志物以及尋找AS免疫療法提供了新的參考思路。

利益相關(guān)聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：李儒琳負(fù)責(zé)科研設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析整理以及論文撰寫(xiě)和修改;李儒琳和杜壯文負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施;王恩梁負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)及論文審閱。