曹施靜，胡海霞，楠 極

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014109）

0 引言

食醋采用多菌種混合發(fā)酵工藝，由眾多微生物發(fā)酵而形成的一種酸味調(diào)味劑。食醋釀造主要包括固態(tài)和半固態(tài)工藝，微生物在開放式環(huán)境下經(jīng)過各種作用機制及相互作用從而釀造出食醋[1-2]。食醋生產(chǎn)原料種類豐富，主要包括高粱、大米、小米、麩皮、小麥等，不同的原料所呈現(xiàn)的食醋品質(zhì)有所不同。在我國，傳統(tǒng)食醋主要以“四大名醋”而聞名。山西老陳醋，以谷物為主要原料，酒化完成后再經(jīng)醋酸發(fā)酵等工序釀制而成；四川保寧醋，其主要原料為麩皮，輔料為小麥、玉米和大米，通過生料固態(tài)發(fā)酵的方式在低溫條件下釀造而成；鎮(zhèn)江香醋，其主要原料為優(yōu)質(zhì)糯米，通過固態(tài)發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵而成；福建永春老醋，其主要經(jīng)過多次添加糯米等原料，通過液體發(fā)酵方式并經(jīng)過3 年以上陳釀而成。

山西陳醋作為四大名醋之一，被譽為國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，富含豐富的氨基酸等營養(yǎng)成分，具有軟化血管等獨特功效；四川保寧醋，具有促進鈣、鐵吸收、降脂減肥、預(yù)防動脈硬化和美容養(yǎng)顏等功能性作用；鎮(zhèn)江香醋，具有降血壓、血脂、分解乳酸、抗菌發(fā)等功效；福建永春老醋含有多重營養(yǎng)成分和有益微生物，經(jīng)常食用福建永春老醋能增進食欲、開健脾胃，對治療皮膚病、動脈硬化、高血壓等有重要功效。

近年來，國內(nèi)外有關(guān)傳統(tǒng)四大名醋發(fā)酵過程中的功能微生物及作用機制剖析越來越深入，對釀造過程中的微生物菌種及發(fā)酵作用機理的深入剖析，將有利于開辟新的市場，滿足食醋市場需求。在傳統(tǒng)四大名醋研究中也存在著一些難題，由于大多數(shù)微生物在環(huán)境中難以培養(yǎng)，單純依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法對發(fā)酵過程中的功能微生物組成及豐度變化很難測定。目前，大多數(shù)研究多采用分子生物鑒定及基因測序等方式對發(fā)酵過程中的微生物結(jié)構(gòu)組成等進行研究，為食醋研究提供一定的理論指導(dǎo)和現(xiàn)實意義。

1 發(fā)酵微生物種類

1.1 霉菌

霉菌主要產(chǎn)生于淀粉糖化階段，在此過程中，糖在淀粉前期作用下形成，氨基酸在蛋白質(zhì)前期作用下形成。除此之外，在發(fā)酵過程中還會產(chǎn)生蛋白酶，對原料中產(chǎn)生的各種氨基酸和多肽具有分解作用，蛋白酶的含量是衡量食醋品質(zhì)優(yōu)劣的一個標(biāo)準(zhǔn)。王佳麗等人[3]從山西老陳醋大曲樣品中篩選鑒定出75 株霉菌，經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)，黑曲霉和米曲霉在大曲中占據(jù)主要地位。王龍[4]通過菌種分離法從山西老陳醋中分離篩選到2 株高產(chǎn)酶的霉菌菌株（M3，M8），經(jīng)過鑒定M3 菌株為犁頭霉屬，M8 菌株為曲霉屬。

1.2 酵母菌

酵母菌主要產(chǎn)生于酒精發(fā)酵階段，在發(fā)酵過程中為其他菌種提供營養(yǎng)物質(zhì)，提升食醋的風(fēng)味和醋體品質(zhì)。酵母菌由于在發(fā)酵過程中處于無氧環(huán)境，在酶的作用下，把糖最終轉(zhuǎn)換成乙醇和CO2，最終以醋酸的形式呈現(xiàn)出來，該過程提供了一個基于代謝產(chǎn)物呈遞的簡單相互作用。范三紅等人[5]對山西陳醋微生物群落進行測序發(fā)現(xiàn)伊薩酵母菌屬在整個發(fā)酵過程中都處于優(yōu)勢地位。Zhang Qi 等人[6]通過分離法從山西老陳醋大曲中純化篩選出了一株酵母菌（Y14）。經(jīng)過基因測序和生化鑒定，大曲酵母Y14 為產(chǎn)酯能力最高的東北畢赤酵母（Pichia manshurica）。

1.3 乳酸菌

乳酸菌主要產(chǎn)生在醋酸發(fā)酵階段，其產(chǎn)生的有機酸類賦予食醋特殊的風(fēng)味物質(zhì)。乳酸菌中富含不揮發(fā)性酸，在食醋發(fā)酵過程中，乳酸菌產(chǎn)生的相關(guān)產(chǎn)物具有防腐殺菌、緩解食醋刺激口感和改善食醋品質(zhì)的作用。此外，乳酸菌在風(fēng)味香氣方面也發(fā)揮著重要作用，其代謝產(chǎn)生的酶系能將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化分解為氨基酸[7]。杜宏福等人[8]對山西老陳醋酒精及醋酸發(fā)酵微生物構(gòu)成與有機酸變化關(guān)系進行研究，結(jié)果表明，在酒精發(fā)酵階段，乳酸菌產(chǎn)量及其多樣性呈上升趨勢。邢曉瑩等人[9]從山西老陳醋中篩選得出54 株乳酸菌，經(jīng)過進一步的產(chǎn)酸能力分析，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)酸可達（9.56±0.23） g/L，同時具有耐高溫的性能。張雅琳等人[10]對四川麩醋發(fā)酵中的細菌微生物構(gòu)成和變化規(guī)律進行基因測序分析，結(jié)果表明在細菌微生物組成中，主要優(yōu)勢細菌為耐酸乳桿菌和巴氏醋桿菌。

1.4 醋酸菌

醋酸菌作為醋酸發(fā)酵的一類重要的微生物，在發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要作用，能將乙醇氧化成乙酸，影響食醋的品質(zhì)與口感[11-12]。在食醋發(fā)酵過程中，醋酸菌產(chǎn)酸能力的大小與工藝生產(chǎn)有著直接關(guān)系，篩選性能優(yōu)良的醋酸菌對提高企業(yè)生產(chǎn)效率發(fā)揮重要影響。王夢穎等人[13]對山西老陳醋細菌組成和微生物相對豐度通過基因測序技術(shù)進行分析，表明在整個發(fā)酵過程中，乳桿菌屬、醋酸桿菌屬及Faecalibacterium 在細菌種類中占有絕對比例。華青松等人[14]從鎮(zhèn)江香醋前期篩選出來的醋酸菌中分離得到 2 株耐高溫及產(chǎn)酸能力強的醋酸菌，并且將其命名為菌株AABA，AABC，經(jīng)過16S rDNA 基因鑒定，菌株AABA，AABC 都是巴氏醋酸桿菌屬。此外，醋酸菌AABA 生長狀態(tài)在37 ℃最好，醋酸菌AABC 生長狀態(tài)在40 ℃最好。在產(chǎn)酸能力方面，醋酸菌AABA 為45.5 g/L，醋酸菌AABC 為28 g/L。

在食醋整個生產(chǎn)中，主要功能微生物是霉菌、酵母菌、乳酸菌及醋酸菌，霉菌在食醋初期發(fā)酵過程中能將淀粉轉(zhuǎn)化為糖類物種，為微生物提供一定的營養(yǎng)物質(zhì)，為酒精發(fā)酵提供良好的前提；酵母菌能將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為遺傳，提供發(fā)酵動力；乳酸菌中的有機酸類能賦予食醋良好的口感及品質(zhì)；醋酸菌能將乙醇氧化為醋酸，正是通過這些發(fā)酵的微生物的協(xié)同作用，最終呈現(xiàn)出來風(fēng)味多樣的食醋[15-17]。

2 四大名醋發(fā)酵為微生物研究

2.1 Alpha 多樣性指數(shù)

在已有多樣性指數(shù)內(nèi)容研究中，Shannon、Simpson 代表著多樣性，Chao1 和ACE 代表豐富度。其中Shannon 和Simpson 指數(shù)代表物種分布多樣性和均勻度情況，分布越均勻表示多樣性也就越高，相應(yīng)指數(shù)變化也就越大；Chao1 和ACE 指數(shù)表示物種總數(shù)，物種總數(shù)越大表示豐富度越高，相應(yīng)指數(shù)變化也就越大。程荷芳[18]高通量測序技術(shù)對四川麩醋發(fā)酵過程中的菌種多樣性進行測序分析。研究表明，在發(fā)酵初期最高的是Shannon 和ACE 指數(shù)，但在發(fā)酵過程中多樣性和豐富度指數(shù)開始逐漸下降，在末期又呈上升趨勢，在整個醋酸發(fā)酵過程中，乳桿菌屬和醋桿菌屬處于優(yōu)勢地位。寇容等人[19]利用測序技術(shù)分析山西陳醋不同發(fā)酵時段醋醅樣品的微生物多樣性及組成情況。研究發(fā)現(xiàn)，細菌群落微生物分布比真菌群落分布均勻，在Shannon 和Simpson 多樣性指數(shù)也就越大；在Chao1 和ACE 豐富度指數(shù)方面，細菌群落也高于真菌群落，根據(jù)其上結(jié)論得出細菌群落比真菌群落更具有豐富性。

2.2 微生物多樣性曲線

樣品稀釋曲線用來評價測序量是否可以占據(jù)所有微生物菌群，并間接反映物種的豐富度，也可表示取樣是否適量。Shannon-Wiener 曲線可以根據(jù)在不同測序深度的各樣品測序量來構(gòu)建微生物多樣性指數(shù)曲線，反映各樣品在不同測序量多樣性變化。李雅茹[20]通過測序技術(shù)對山西陳醋醅微生物多樣性及組成情況進行研究。分析發(fā)現(xiàn)，在多樣性及豐富度變化情況中，細菌大于真菌；此外，大曲中的優(yōu)勢細菌和真菌屬分別為乳酸桿菌屬和覆膜孢酵母屬。Zhu Yunping 等人[21]通過高通量測序和代謝組學(xué)的方法對山西老陳醋微生物細菌演替和風(fēng)味形成進行探究。研究表明，早期優(yōu)勢細菌為泛菌、片球菌、乳球菌和根瘤菌；中期優(yōu)勢細菌為乳酸菌（67.72%）；后期優(yōu)勢細菌為醋酸桿菌、小馬桿菌和克氏桿菌。孟燕華[22]利用高通量測序技術(shù)對醋醅樣品中的微生物多樣性進行分析，結(jié)果表明，乳桿菌屬和醋桿菌屬屬于優(yōu)勢菌屬。此外，乳桿菌屬的豐富度大于醋桿菌屬，在發(fā)酵過程中占據(jù)主要優(yōu)勢。崔寧波[23]對食醋原料及大曲樣品利用高通量進行測定分析，結(jié)果表明，釀酒酵母在原料中為優(yōu)勢真菌，相對豐富占比為99.73%；黑曲霉在大曲為優(yōu)勢菌種，相對豐度占比為98.86%。

2.3 物種分布情況

按照分類學(xué)分析結(jié)果，可將群落組成分為門、綱、目、科、屬、種這幾大類。王俊奇等人[24]通過高通量測序和分子標(biāo)記對永春老醋醋酸發(fā)酵過程中醋醅、成品醋和不同陳釀時期細菌、真菌多樣性演替規(guī)律進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成品醋和1 年陳釀在綱水平上，α - 變形菌綱和芽孢桿菌綱是占有很大比例；在屬水平上，具有絕對優(yōu)勢的是醋酸桿菌屬和乳桿菌，細菌群落在10 年陳釀中沒有檢測到；在真菌多樣性動態(tài)變化研究中，酵母綱和散囊菌綱在4個不同發(fā)酵階段的樣品中都具有一定比例。Nie Zhiqiang 等人[25]對山西老陳醋大曲中的細菌和真菌結(jié)構(gòu)借助PCR-DGGE 測序技術(shù)進行研究，結(jié)果顯示，在大曲的發(fā)酵過程中覆膜孢酵母屬、曲霉菌屬、畢赤酵母屬、紅曲霉等為主要優(yōu)勢真菌。

3 發(fā)酵微生物關(guān)聯(lián)作用研究

傳統(tǒng)食醋在發(fā)酵過程中由于環(huán)境開放性、菌種結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，導(dǎo)致發(fā)酵過程由多個微生物菌種通過相互作用形成，由于這些作用機制的存在，最終呈現(xiàn)了各種交互作用關(guān)系，從而影響了群落的結(jié)構(gòu)組成及功能。在互利共生關(guān)系中，微生物菌種相互受益；在偏利共生關(guān)系中，一種微生物菌種受益，而另一種微生物不受影響；競爭關(guān)系指微生物菌種通過搶奪營養(yǎng)物質(zhì)及限制多種生長因子而獲得優(yōu)勢地位的現(xiàn)象；寄生是指通過消耗另一種微生物而使自身收益的關(guān)系；中立是指2 種微生物自身代謝能力的差距，從而導(dǎo)致生長互不干涉的現(xiàn)象。

寇蓉[26]對鎮(zhèn)江香醋釀造過程中分離的優(yōu)勢細菌屬的相互作用通過原位模擬培養(yǎng)和異位培養(yǎng)方法進行分析，研究發(fā)現(xiàn)在醋醅中乳酸桿菌和醋酸桿菌可以同時穩(wěn)定存在，但在發(fā)酵條件的改變下，不同種類的乳酸桿菌和醋酸桿菌其共現(xiàn)關(guān)系也隨著變動。有研究對山西老陳醋釀造過程中主要乳酸桿菌（Lactobacillus（L） . helveticus CGMCC 1.1877） 和醋酸桿菌（Acetobacter (A). pasteurianus CP-A11） 的相互作用通過原位模擬共培養(yǎng)方法進行了深入剖析，研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)對乳酸桿菌有抑制作用，而對醋酸桿菌有促進作用。目前，微生物作用機理在食醋釀造過程中對微生物動態(tài)變化和生長代謝起著關(guān)鍵作用，將不同的優(yōu)良菌株應(yīng)用于不同發(fā)酵過程，對食醋品質(zhì)和穩(wěn)定性具有重要影響，該研究將對食醋釀造具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。

4 高通量測序技術(shù)的應(yīng)用

該測序技術(shù)能同時對數(shù)量非常多的基因分子片段進行測定。在保持高精準(zhǔn)度的同時，降低了檢驗成本并提升了測定速度。如今在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中被廣泛應(yīng)用，為傳統(tǒng)發(fā)酵食品開發(fā)研究提供了現(xiàn)實指導(dǎo)和參考。通常來說，發(fā)酵食品主要通過微生物在發(fā)酵過程中的轉(zhuǎn)化作用而形成。由于開放式的環(huán)境，使微生物組成豐富多樣[27]，對發(fā)酵體系的研究必須以代謝機制研究為前提[28]。伴隨基因測序及高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，研究發(fā)酵食品中的微生物組成及結(jié)構(gòu)等內(nèi)容將在食品研究領(lǐng)域中成為主流趨勢[29-31]，將對食醋行業(yè)發(fā)展起著重要推動作用。

4.1 PCR-DGGE 技術(shù)

該技術(shù)主要針對微生物多樣性和微生物群落進行分析。在酒曲、泡菜、乳制品等發(fā)酵食品中已被廣泛應(yīng)用[32-34]，與其他高通量測序方法相比，該方法能直接提取DNA，具有分析速度快、能反映整個微生物群落等優(yōu)點。Wei Xu 等人[35]通過該技術(shù)對鎮(zhèn)江香醋的發(fā)酵微生物動態(tài)變化趨勢進行分析。數(shù)據(jù)顯示，在發(fā)酵過程中主要以醋酸桿菌屬、乳酸桿菌屬等為主要細菌，以酵母菌屬為主要真菌。Li Pan 等人[36]對山西老陳醋細菌群落組成進行測序分析，研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌和醋桿菌屬在醋酸發(fā)酵時期中具有較高占比。此外，歐文氏菌、假單胞菌、埃希氏菌、芽孢桿菌等在發(fā)酵過程中也占有一定比例。

4.2 RT-FQPCR 技術(shù)

RT-FQPCR 是對DNA 或RNA 序列進行實時擴增和檢測特定的測序技術(shù)。該測序技術(shù)利用熒光染料或探針，當(dāng)與擴增的DNA 或RNA 分子結(jié)合時會發(fā)出信號，從而可以對目標(biāo)序列進行量化。夏夢雷等人[37]對鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過程中菌種動態(tài)變化利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-FQPCR） 測序技術(shù)進行分析發(fā)現(xiàn)，酵母菌、乳酸菌及醋酸菌為醋醅中的優(yōu)勢微生物，三者超過80%在真菌、細菌總占比中。

4.3 宏基因組技術(shù)

宏基因組測序是將樣品中的DNA 進行擴增、純化、片段化、連接到適當(dāng)?shù)倪m配器上，利用此技術(shù)進行測序。該技術(shù)針對測定的樣品基因，通常從樣品中直接提取，從而分析微生物之間的多樣性、種群結(jié)構(gòu)、功能信息、與環(huán)境之間的關(guān)系，近年來在微生物學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。劉愛平等人[38]對四川麩醋醅發(fā)酵過程中的菌種組成通過宏基因組測序進行研究。分析發(fā)現(xiàn)，金山乳桿菌、巴氏醋桿菌等在微生物種類中占據(jù)優(yōu)勢比例，且這些優(yōu)勢菌種同屬70 個門、885 個屬和3 168 個種。Wang Zongmin等人[39]對鎮(zhèn)江香醋宏基因組學(xué)和偏好分析，數(shù)據(jù)顯示，醋酸菌屬和乳酸菌屬在細菌中占有絕對優(yōu)勢，曲霉屬和鏈格孢屬在真菌中占有絕大比例。

4.4 宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)

宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在轉(zhuǎn)錄水平，以特定樣本中微生物群落的全部轉(zhuǎn)錄本為研究對象，分析微生物群落的基因表達與調(diào)控。該技術(shù)沒有微生物的分離培養(yǎng)，為研究人員提供了研究的特定環(huán)境、特定時期微生物群落基因組轉(zhuǎn)錄情況以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的高效工具。Wu Yanfang 等人[40]通過宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)對山西老陳醋中有機酸的代謝機制進行研究發(fā)現(xiàn)，乙酸、乳酸代謝來源與乳酸桿菌屬和醋酸桿菌屬有著直接關(guān)聯(lián)，而影響微生物代謝活性的環(huán)境因子主要是溫度、乙酸。

4.5 幾種測序方法優(yōu)缺點比較

針對幾種測序方法優(yōu)缺點進行了概括，如鑒定微生物的群落種類，PCR-DGGE 和RT-FQPCR 測序技術(shù)更適用，若對深入的生物學(xué)功能進行研究，宏基因組相關(guān)測序技術(shù)更適用。目前，隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測成本的減少，宏基因組有關(guān)的測序技術(shù)將會被廣泛應(yīng)用，成為研究的主要趨勢。

測序方法優(yōu)缺點比較見表1。

表1 測序方法優(yōu)缺點比較

5 結(jié)語

綜上所述，發(fā)酵微生物在食醋的整個釀造過程起著關(guān)鍵作用，對食醋的出醋率及醋體品質(zhì)有著重要影響，因此探索食醋發(fā)酵微生物的結(jié)構(gòu)組成及發(fā)酵機理對控制食醋品質(zhì)十分必要。目前，對傳統(tǒng)四大名醋的研究大多集中在微生物的組成剖析、菌種的分離篩選等方面，對發(fā)酵微生物背后的作用機制以及釀造機理的相關(guān)研究還較少，相信隨著人們對食醋研究的不斷深入、檢測方法的不斷發(fā)展完善，對四大名醋的發(fā)酵微生物研究內(nèi)容將進一步擴展深入，為食醋企業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)和現(xiàn)實指導(dǎo)。