劉葉，彭健，郭利娟，孟曉依，陳仿如，高川

（山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)用衛(wèi)生材料及生物防護(hù)器械質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101）

殼聚糖及其衍生物為天然高分子多糖，具有選擇性促進(jìn)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)的獨(dú)特生物活性、生物相容性、生物可降解性且降解產(chǎn)物安全無毒等特點(diǎn)，除此之外，亦具有廣泛的抗菌、止血、止痛作用，是理想的醫(yī)用生物材料。殼聚糖及其衍生物具有優(yōu)異的生物學(xué)特性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療器械領(lǐng)域，如殼聚糖凝膠、殼聚糖敷料、殼聚糖止血粉等[1-3]。研究表明，醫(yī)用殼聚糖類產(chǎn)品的作用機(jī)理與分子量大小及其分布、濃度、脫乙酰度、金屬離子、菌株、晶型等因素相關(guān)[4-7]。董謙等[8]建議使用分子量作為殼聚糖類產(chǎn)品的屬性界定依據(jù)。綜上所述，分子量及其分布是評(píng)價(jià)殼聚糖類醫(yī)療器械產(chǎn)品安全性、有效性的重要指標(biāo)之一。

醫(yī)用殼聚糖類產(chǎn)品按風(fēng)險(xiǎn)管理分類屬于ⅠⅠ、ⅠⅠⅠ類醫(yī)療器械，臨床使用時(shí)與人體直接接觸，存在潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，需對(duì)其安全性和有效性進(jìn)行控制。醫(yī)用殼聚糖產(chǎn)品的穩(wěn)定性是反映其安全性和有效性的重要方面，而其相對(duì)分子質(zhì)量及其分布的變化是表征其穩(wěn)定性的重要參數(shù)?，F(xiàn)行有效的與醫(yī)用殼聚糖類產(chǎn)品相關(guān)的指南或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有YY/T 0953—2020、YY/T 1699—2020 及ASTM F2602-18[9-11]，以上標(biāo)準(zhǔn)或指南中雖然規(guī)定了相關(guān)醫(yī)用殼聚糖產(chǎn)品相對(duì)分子質(zhì)量及其分布的測(cè)試方法，但未涉及其貨架有效期內(nèi)穩(wěn)定性的研究。目前，有關(guān)殼聚糖及其衍生物穩(wěn)定性的研究多集中于其抑菌性能[12-14]，如呂志華等[15]曾利用加速試驗(yàn)并采用高效凝膠滲透色譜法、明膠比濁法、氧瓶燃燒法考察幾丁糖酯原料藥的穩(wěn)定性，但鮮有通過自然存放條件下相對(duì)分子量及其分布研究醫(yī)用殼聚糖類產(chǎn)品在貨架存放有效期內(nèi)穩(wěn)定性的報(bào)道。

筆者利用凝膠滲透色譜-激光光散射聯(lián)用法檢測(cè)外科手術(shù)用防粘連沖洗液、醫(yī)用幾丁糖、醫(yī)用防粘連改性殼聚糖(膜)以及殼聚糖基可吸收止血非織布4種樣品狀態(tài)與預(yù)期目的具有代表性的醫(yī)用殼聚糖產(chǎn)品在貨架存放有效期內(nèi)的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布的變化，以評(píng)價(jià)4 種產(chǎn)品在貨架存放有效期內(nèi)的穩(wěn)定性。該研究結(jié)果可為相關(guān)審評(píng)部門提供技術(shù)支撐，為生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)量控制及其在貨架存放有效期內(nèi)的穩(wěn)定性提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

凝膠滲透色譜-激光光散射聯(lián)用儀：Agilent 1260Ⅰnfinity型，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

示差檢測(cè)器：Optilab T-rEX 型，美國(guó)懷雅特技術(shù)公司。

18 角度激光光散射檢測(cè)器：DAWN HELEOS-Ⅱ型，美國(guó)懷雅特技術(shù)公司。

電子天平：XS204 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

純水/超純水一體化系統(tǒng)：Millipore Advantage A10型，美國(guó)密理博公司。

硝酸鈉、乙酸、乙酸鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

疊氮化鈉（NaN3）：分析純，北京化學(xué)試劑公司。

醫(yī)用幾丁糖樣品：1 mL，上海其勝制劑有限公司。

殼聚糖基可吸收止血非織布樣品：30 mm×30 mm，青島博益特生物材料股份有限公司。

外科手術(shù)用防粘連沖洗液：250 mL，杭州協(xié)合醫(yī)療用品有限公司。

醫(yī)用防粘連改性殼聚糖(膜)樣品：100×50×0.06 mm，北京百利康生化有限公司。

10 種葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品：編號(hào)、相對(duì)分子質(zhì)量、來源見表1。

表1 10種葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品信息

1.2 色譜條件

色譜柱：OHpak SB-803 HQ（8.0 mm×300 mm，6 μm，日本昭和電工株式會(huì)社）、OHpak SB805 HQ（8.0 mm×300 mm，13 μm，日本昭和電工株式會(huì)社）、OHpak SB-806 HQ（8.0 mm×300 mm，13 μm，日本昭和電工株式會(huì)社）及OHpak SB-G 6B（6.0 mm×50 mm，13 μm，日本昭和電工株式會(huì)社）；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：A 為0.1 mol/L 硝酸鈉溶液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2×10-4的NaN3）、B 為0.25 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2×10-4的NaN3，并用乙酸調(diào)節(jié)pH 為4.5）；流動(dòng)相流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：900 μL。

1.3 樣品選擇

選取作為Ш類醫(yī)療器械管理的4種醫(yī)用殼聚糖類產(chǎn)品，樣品名稱及貨架存放有效期見表2。

表2 樣品統(tǒng)計(jì)表

1.4 溶液配制

1.4.1 葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液

分別稱取1#葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品11.7 mg、6#葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品10.1 mg，用流動(dòng)相溶解并定容至10 mL，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1；分別稱取2#葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品14.2 mg、7#葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品13.3 mg，用流動(dòng)相溶解并定容至10 mL，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2；分別稱取3#葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品12.8 mg、8#葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品13.0 mg，用流動(dòng)相溶解并定容至10 mL，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液3；分別稱取4#葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品13.4 mg、9#葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品16.5 mg，用流動(dòng)相溶解并定容至10 mL，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液4；分別稱取5#葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品11.8 mg、10號(hào)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品12.7 mg，用流動(dòng)相溶解并定容至10 mL，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5。

1.4.2 樣品溶液

樣品溶液1：5 mg/mL，稱取醫(yī)用幾丁糖約100 mg，分別加入流動(dòng)相A、流動(dòng)相B 稀釋至20 mL，靜置12 h。

樣品溶液2：1 mg/mL，稱取約20 mg 殼聚糖基可吸收止血非織布，分別加入流動(dòng)相A、流動(dòng)相B稀釋至20 mL，靜置12 h。

樣品溶液3：取外科手術(shù)用防粘連沖洗液直接測(cè)定。

樣品溶液4：1 mg/mL，稱取約20 mg 醫(yī)用防粘連改性殼聚糖（膜），分別加入流動(dòng)相A、流動(dòng)相B稀釋至20 mL，靜置12 h。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

取1.4.2 配制的樣品溶液，按照1.2 色譜條件分別在流動(dòng)相A 和流動(dòng)相B體系下進(jìn)行檢測(cè)；取1.4.1配制的葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照1.2 色譜條件分別在流動(dòng)相A 體系下進(jìn)行檢測(cè)；取初始時(shí)4種樣品和自然條件下存放一年后的4種樣品，分別按照1.4.2方法配制樣品溶液按照1.2色譜條件在流動(dòng)相A 體系下進(jìn)行檢測(cè)，通過懷雅特Astra 6.1 軟件積分?jǐn)M合計(jì)算得到不同時(shí)間點(diǎn)樣品溶液的重均相對(duì)分子質(zhì)量、數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量以及相對(duì)分子質(zhì)量分布，通過比較相對(duì)分子質(zhì)量來判斷樣品穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

對(duì)比了兩種流動(dòng)相對(duì)4 種樣品的溶解性，分別稱取醫(yī)用幾丁糖、殼聚糖基可吸收止血非織布、外科手術(shù)用防粘連沖洗液、醫(yī)用防粘連改性殼聚糖(膜)各10 mg 于玻璃瓶中，平行取樣，分為兩組，第1 組分別加入10 mL流動(dòng)相A，第2組分別加入10 mL流動(dòng)相B。30 min 后，第1 組中4 種樣品均完全溶解，第2 組中外科手術(shù)用防粘連沖洗液、醫(yī)用幾丁糖完全溶解，而醫(yī)用防粘連改性殼聚糖(膜)、殼聚糖基可吸收止血非織布未完全溶解。

同時(shí)分別以流動(dòng)相A 和B 進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)比了1.4.2 配制的四種樣品溶液，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，在流動(dòng)相B 中樣品帶來的基線噪音大于流動(dòng)相A，另外由于部分樣品未完全溶解于流動(dòng)相B，影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。綜合考慮基線噪聲和溶解性能，選擇0.1 mol/L 硝酸鈉(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2×10-4的NaN3)為樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)流動(dòng)相。

圖1 分別使用流動(dòng)相A和流動(dòng)相B時(shí)的樣品色譜圖

2.2 色譜柱的選擇

選擇Shodex SB803、SB805、SB806 及保護(hù)柱四柱串聯(lián)，分別對(duì)1.4.1 配制的5種葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行分析，色譜圖見圖2。結(jié)果表明，四柱串聯(lián)能實(shí)現(xiàn)良好的分離效果。

圖2 不同相對(duì)分子質(zhì)量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分離色譜圖

2.3 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

在1.2色譜條件下，選擇表2列舉的4種樣品，分別于初始放置于貨架時(shí)及自然條件下存放一年后取樣，按照1.4.2方法配制樣品溶液，對(duì)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的4種樣品分別進(jìn)行檢測(cè)。用軟件計(jì)算出樣品的重均相對(duì)分子質(zhì)量、數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量以及相對(duì)分子質(zhì)量分布結(jié)果，對(duì)初始值和一年后的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)計(jì)算，結(jié)果見表3。4種樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)相對(duì)分子質(zhì)量色譜圖見圖3。

圖3 4種樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)相對(duì)分子質(zhì)量色譜圖

表3 4種樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

殼聚糖類產(chǎn)品的相對(duì)分子質(zhì)量大小及分布與該類產(chǎn)品使用時(shí)的作用機(jī)理有關(guān)[16]，相對(duì)分子質(zhì)量也被認(rèn)為是影響殼聚糖抗菌性能的主要因素，有研究者[17-19]選取不同相對(duì)分子質(zhì)量大小的殼聚糖產(chǎn)品在對(duì)常見的黃色葡糖糖球菌、大腸桿菌等菌種進(jìn)行抑菌性能實(shí)驗(yàn)時(shí)，均發(fā)現(xiàn)在抗菌作用的表現(xiàn)中殼聚糖產(chǎn)品相對(duì)分子質(zhì)量大時(shí)能有效阻隔細(xì)菌，而小分子的殼聚糖會(huì)滲透至細(xì)菌中破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)起到殺菌效果。結(jié)合以上作用機(jī)理，董謙等[8]建議使用相對(duì)分子質(zhì)量作為殼聚糖類產(chǎn)品的屬性界定依據(jù)，當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量為1.0×105及以上時(shí)，殼聚糖利用物理阻隔作用達(dá)到抗菌目的，可認(rèn)為是醫(yī)療器械作用；當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量為1.0×104及以下時(shí)，殼聚糖利用滲透細(xì)菌細(xì)胞干擾細(xì)胞新陳代謝活動(dòng)達(dá)到抗菌目的，可認(rèn)為是藥理作用；當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量為1.0×104至1.0×105時(shí)，對(duì)不同類型的殼聚糖產(chǎn)品其抑菌功效機(jī)理需要進(jìn)一步考察界定。

幾丁糖類產(chǎn)品作為粘彈性補(bǔ)充物質(zhì)直接恢復(fù)關(guān)節(jié)滑液的流變性特性(彈性和粘性)，起到關(guān)節(jié)潤(rùn)滑作用，通過大分子自身的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，形成物理屏障，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，減少相互之間的摩擦，作為眼科粘彈劑在手術(shù)過程中可以維持前房的深度，同時(shí)保護(hù)眼角膜內(nèi)皮，防止角膜內(nèi)皮損傷，并能起到潤(rùn)滑作用[20-21]。對(duì)于防粘連產(chǎn)品來說，作用機(jī)理主要為物理阻隔，部分產(chǎn)品能夠具有選擇性的促進(jìn)上皮細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)而抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)特性，從而促進(jìn)組織生理性修復(fù)，抑制疤痕形成，減少組織粘連，并具有局部止血作用及抑制血纖維蛋白束形成，從而減少了因血腫機(jī)化而造成的組織粘連，還能起到潤(rùn)滑及生物屏障作用，能有效防止粘連發(fā)生[22-23]。表3 結(jié)果表明，醫(yī)用幾丁糖、外科手術(shù)用防粘連沖洗液、醫(yī)用防粘連改性殼聚糖(膜)產(chǎn)品的重均相對(duì)分子質(zhì)量、數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量及其分布變化均小于38%，并且重均相對(duì)分子質(zhì)量均保持在1.0×105及以上，表明該類產(chǎn)品具有良好的穩(wěn)定性，在使用過程中能起到優(yōu)良的潤(rùn)滑及生物屏障作用，有效防止粘連發(fā)生，并可在應(yīng)用部位保持足夠的時(shí)間，達(dá)到預(yù)期目的，可認(rèn)為屬于醫(yī)療器械作用。

殼聚糖基可吸收止血非織布與創(chuàng)面血液或者滲出液接觸后，能在接觸面形成高粘性凝膠，迅速與創(chuàng)面緊密貼附，有效封閉創(chuàng)面和血管斷端，達(dá)到快速止血的目的，同時(shí)也能使創(chuàng)面血液的紅細(xì)胞聚集，輔助凝血塊的形成，從而在局部控制出血中發(fā)揮輔助止血作用，置入人體后緩慢降解，最終降解物為氨基葡萄糖單體，可被肌體吸收[24-25]。此次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殼聚糖基可吸收止血非織布產(chǎn)品初始相對(duì)分子質(zhì)量是4類產(chǎn)品中最大的，重均相對(duì)分子質(zhì)量和數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量均達(dá)到了1.0×106以上，同時(shí)也是相對(duì)分子質(zhì)量及其分布變化最大的，重均相對(duì)分子質(zhì)量從初始的1.42×106降低到9.35×104，減少93%；數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量從1.09×106減少到9.22×104，減少約92%；相對(duì)分子質(zhì)量分布從1.30減少到1.01。說明樣品在儲(chǔ)藏過程中發(fā)生了降解，其功能由原始的物理阻隔抑菌向其滲透抑菌發(fā)生了轉(zhuǎn)變，抑菌效果沒有發(fā)生改變，但是對(duì)于其是否能達(dá)到快速止血的功效需要進(jìn)一步考察。

3 結(jié)語(yǔ)

通過激光散射-凝膠滲透色譜聯(lián)用法跟蹤了醫(yī)用幾丁糖、殼聚糖基可吸收止血非織布、外科手術(shù)用防粘連沖洗液、醫(yī)用防粘連改性殼聚糖(膜)4種醫(yī)用殼聚糖類產(chǎn)品在貨架有效期內(nèi)的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布的變化。醫(yī)用幾丁糖、外科手術(shù)用防粘連沖洗液、醫(yī)用防粘連改性殼聚糖(膜)3種產(chǎn)品在貨架有效期內(nèi)的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布變化在可接受范圍內(nèi)，仍保持其產(chǎn)品原本作用機(jī)理。殼聚糖基可吸收止血非織布臨期時(shí)的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布較臨期1 年時(shí)急劇下降，表明該產(chǎn)品在貨架有效期內(nèi)發(fā)生了明顯降解，其臨床使用時(shí)的安全性和有效性需進(jìn)一步評(píng)估。研究結(jié)果表明，需要關(guān)注醫(yī)用殼聚糖類產(chǎn)品在貨架有效期內(nèi)的穩(wěn)定性，以保證其臨床使用時(shí)的安全有效性。