劉葉，彭健，郭利娟，孟曉依，陳仿如，高川

（山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評價重點實驗室，國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)用衛(wèi)生材料及生物防護器械質量評價重點實驗室，濟南 250101）

殼聚糖及其衍生物為天然高分子多糖，具有選擇性促進表皮細胞生長的獨特生物活性、生物相容性、生物可降解性且降解產物安全無毒等特點，除此之外，亦具有廣泛的抗菌、止血、止痛作用，是理想的醫(yī)用生物材料。殼聚糖及其衍生物具有優(yōu)異的生物學特性，被廣泛應用于醫(yī)療器械領域，如殼聚糖凝膠、殼聚糖敷料、殼聚糖止血粉等[1-3]。研究表明，醫(yī)用殼聚糖類產品的作用機理與分子量大小及其分布、濃度、脫乙酰度、金屬離子、菌株、晶型等因素相關[4-7]。董謙等[8]建議使用分子量作為殼聚糖類產品的屬性界定依據(jù)。綜上所述，分子量及其分布是評價殼聚糖類醫(yī)療器械產品安全性、有效性的重要指標之一。

醫(yī)用殼聚糖類產品按風險管理分類屬于ⅠⅠ、ⅠⅠⅠ類醫(yī)療器械，臨床使用時與人體直接接觸，存在潛在的安全風險，需對其安全性和有效性進行控制。醫(yī)用殼聚糖產品的穩(wěn)定性是反映其安全性和有效性的重要方面，而其相對分子質量及其分布的變化是表征其穩(wěn)定性的重要參數(shù)。現(xiàn)行有效的與醫(yī)用殼聚糖類產品相關的指南或行業(yè)標準有YY/T 0953—2020、YY/T 1699—2020 及ASTM F2602-18[9-11]，以上標準或指南中雖然規(guī)定了相關醫(yī)用殼聚糖產品相對分子質量及其分布的測試方法，但未涉及其貨架有效期內穩(wěn)定性的研究。目前，有關殼聚糖及其衍生物穩(wěn)定性的研究多集中于其抑菌性能[12-14]，如呂志華等[15]曾利用加速試驗并采用高效凝膠滲透色譜法、明膠比濁法、氧瓶燃燒法考察幾丁糖酯原料藥的穩(wěn)定性，但鮮有通過自然存放條件下相對分子量及其分布研究醫(yī)用殼聚糖類產品在貨架存放有效期內穩(wěn)定性的報道。

筆者利用凝膠滲透色譜-激光光散射聯(lián)用法檢測外科手術用防粘連沖洗液、醫(yī)用幾丁糖、醫(yī)用防粘連改性殼聚糖(膜)以及殼聚糖基可吸收止血非織布4種樣品狀態(tài)與預期目的具有代表性的醫(yī)用殼聚糖產品在貨架存放有效期內的相對分子質量及其分布的變化，以評價4 種產品在貨架存放有效期內的穩(wěn)定性。該研究結果可為相關審評部門提供技術支撐，為生產企業(yè)的產品質量控制及其在貨架存放有效期內的穩(wěn)定性提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

凝膠滲透色譜-激光光散射聯(lián)用儀：Agilent 1260Ⅰnfinity型，美國安捷倫科技有限公司。

示差檢測器：Optilab T-rEX 型，美國懷雅特技術公司。

18 角度激光光散射檢測器：DAWN HELEOS-Ⅱ型，美國懷雅特技術公司。

電子天平：XS204 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

純水/超純水一體化系統(tǒng)：Millipore Advantage A10型，美國密理博公司。

硝酸鈉、乙酸、乙酸鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

疊氮化鈉（NaN3）：分析純，北京化學試劑公司。

醫(yī)用幾丁糖樣品：1 mL，上海其勝制劑有限公司。

殼聚糖基可吸收止血非織布樣品：30 mm×30 mm，青島博益特生物材料股份有限公司。

外科手術用防粘連沖洗液：250 mL，杭州協(xié)合醫(yī)療用品有限公司。

醫(yī)用防粘連改性殼聚糖(膜)樣品：100×50×0.06 mm，北京百利康生化有限公司。

10 種葡聚糖相對分子質量標準品：編號、相對分子質量、來源見表1。

表1 10種葡聚糖相對分子質量標準品信息

1.2 色譜條件

色譜柱：OHpak SB-803 HQ（8.0 mm×300 mm，6 μm，日本昭和電工株式會社）、OHpak SB805 HQ（8.0 mm×300 mm，13 μm，日本昭和電工株式會社）、OHpak SB-806 HQ（8.0 mm×300 mm，13 μm，日本昭和電工株式會社）及OHpak SB-G 6B（6.0 mm×50 mm，13 μm，日本昭和電工株式會社）；柱溫：35 ℃；流動相：A 為0.1 mol/L 硝酸鈉溶液（含質量分數(shù)為2×10-4的NaN3）、B 為0.25 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液（含質量分數(shù)為2×10-4的NaN3，并用乙酸調節(jié)pH 為4.5）；流動相流量：1.0 mL/min；進樣體積：900 μL。

1.3 樣品選擇

選取作為Ш類醫(yī)療器械管理的4種醫(yī)用殼聚糖類產品，樣品名稱及貨架存放有效期見表2。

表2 樣品統(tǒng)計表

1.4 溶液配制

1.4.1 葡聚糖相對分子質量系列混合標準品溶液

分別稱取1#葡聚糖標準品11.7 mg、6#葡聚糖標準品10.1 mg，用流動相溶解并定容至10 mL，作為混合標準溶液1；分別稱取2#葡聚糖標準品14.2 mg、7#葡聚糖標準品13.3 mg，用流動相溶解并定容至10 mL，作為混合標準溶液2；分別稱取3#葡聚糖標準品12.8 mg、8#葡聚糖標準品13.0 mg，用流動相溶解并定容至10 mL，作為混合標準溶液3；分別稱取4#葡聚糖標準品13.4 mg、9#葡聚糖標準品16.5 mg，用流動相溶解并定容至10 mL，作為混合標準溶液4；分別稱取5#葡聚糖標準品11.8 mg、10號葡聚糖標準品12.7 mg，用流動相溶解并定容至10 mL，作為混合標準溶液5。

1.4.2 樣品溶液

樣品溶液1：5 mg/mL，稱取醫(yī)用幾丁糖約100 mg，分別加入流動相A、流動相B 稀釋至20 mL，靜置12 h。

樣品溶液2：1 mg/mL，稱取約20 mg 殼聚糖基可吸收止血非織布，分別加入流動相A、流動相B稀釋至20 mL，靜置12 h。

樣品溶液3：取外科手術用防粘連沖洗液直接測定。

樣品溶液4：1 mg/mL，稱取約20 mg 醫(yī)用防粘連改性殼聚糖（膜），分別加入流動相A、流動相B稀釋至20 mL，靜置12 h。

1.5 實驗方法

取1.4.2 配制的樣品溶液，按照1.2 色譜條件分別在流動相A 和流動相B體系下進行檢測；取1.4.1配制的葡聚糖相對分子質量標準品溶液按照1.2 色譜條件分別在流動相A 體系下進行檢測；取初始時4種樣品和自然條件下存放一年后的4種樣品，分別按照1.4.2方法配制樣品溶液按照1.2色譜條件在流動相A 體系下進行檢測，通過懷雅特Astra 6.1 軟件積分擬合計算得到不同時間點樣品溶液的重均相對分子質量、數(shù)均相對分子質量以及相對分子質量分布，通過比較相對分子質量來判斷樣品穩(wěn)定性。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

對比了兩種流動相對4 種樣品的溶解性，分別稱取醫(yī)用幾丁糖、殼聚糖基可吸收止血非織布、外科手術用防粘連沖洗液、醫(yī)用防粘連改性殼聚糖(膜)各10 mg 于玻璃瓶中，平行取樣，分為兩組，第1 組分別加入10 mL流動相A，第2組分別加入10 mL流動相B。30 min 后，第1 組中4 種樣品均完全溶解，第2 組中外科手術用防粘連沖洗液、醫(yī)用幾丁糖完全溶解，而醫(yī)用防粘連改性殼聚糖(膜)、殼聚糖基可吸收止血非織布未完全溶解。

同時分別以流動相A 和B 進行試驗，對比了1.4.2 配制的四種樣品溶液，色譜圖見圖1。結果表明，在流動相B 中樣品帶來的基線噪音大于流動相A，另外由于部分樣品未完全溶解于流動相B，影響檢驗結果的準確性。綜合考慮基線噪聲和溶解性能，選擇0.1 mol/L 硝酸鈉(含質量分數(shù)為2×10-4的NaN3)為樣品穩(wěn)定性試驗流動相。

圖1 分別使用流動相A和流動相B時的樣品色譜圖

2.2 色譜柱的選擇

選擇Shodex SB803、SB805、SB806 及保護柱四柱串聯(lián)，分別對1.4.1 配制的5種葡聚糖相對分子質量系列混合標準品溶液進行分析，色譜圖見圖2。結果表明，四柱串聯(lián)能實現(xiàn)良好的分離效果。

圖2 不同相對分子質量葡聚糖標準品分離色譜圖

2.3 樣品穩(wěn)定性試驗

在1.2色譜條件下，選擇表2列舉的4種樣品，分別于初始放置于貨架時及自然條件下存放一年后取樣，按照1.4.2方法配制樣品溶液，對兩個時間點的4種樣品分別進行檢測。用軟件計算出樣品的重均相對分子質量、數(shù)均相對分子質量以及相對分子質量分布結果，對初始值和一年后的檢驗數(shù)據(jù)進行比對計算，結果見表3。4種樣品穩(wěn)定性試驗相對分子質量色譜圖見圖3。

圖3 4種樣品穩(wěn)定性試驗相對分子質量色譜圖

表3 4種樣品穩(wěn)定性試驗結果

殼聚糖類產品的相對分子質量大小及分布與該類產品使用時的作用機理有關[16]，相對分子質量也被認為是影響殼聚糖抗菌性能的主要因素，有研究者[17-19]選取不同相對分子質量大小的殼聚糖產品在對常見的黃色葡糖糖球菌、大腸桿菌等菌種進行抑菌性能實驗時，均發(fā)現(xiàn)在抗菌作用的表現(xiàn)中殼聚糖產品相對分子質量大時能有效阻隔細菌，而小分子的殼聚糖會滲透至細菌中破壞細菌結構起到殺菌效果。結合以上作用機理，董謙等[8]建議使用相對分子質量作為殼聚糖類產品的屬性界定依據(jù)，當相對分子質量為1.0×105及以上時，殼聚糖利用物理阻隔作用達到抗菌目的，可認為是醫(yī)療器械作用；當相對分子質量為1.0×104及以下時，殼聚糖利用滲透細菌細胞干擾細胞新陳代謝活動達到抗菌目的，可認為是藥理作用；當相對分子質量為1.0×104至1.0×105時，對不同類型的殼聚糖產品其抑菌功效機理需要進一步考察界定。

幾丁糖類產品作為粘彈性補充物質直接恢復關節(jié)滑液的流變性特性(彈性和粘性)，起到關節(jié)潤滑作用，通過大分子自身的三維網(wǎng)絡結構，形成物理屏障，保護關節(jié)軟骨，減少相互之間的摩擦，作為眼科粘彈劑在手術過程中可以維持前房的深度，同時保護眼角膜內皮，防止角膜內皮損傷，并能起到潤滑作用[20-21]。對于防粘連產品來說，作用機理主要為物理阻隔，部分產品能夠具有選擇性的促進上皮細胞以及內皮細胞生長而抑制成纖維細胞生長的生物學特性，從而促進組織生理性修復，抑制疤痕形成，減少組織粘連，并具有局部止血作用及抑制血纖維蛋白束形成，從而減少了因血腫機化而造成的組織粘連，還能起到潤滑及生物屏障作用，能有效防止粘連發(fā)生[22-23]。表3 結果表明，醫(yī)用幾丁糖、外科手術用防粘連沖洗液、醫(yī)用防粘連改性殼聚糖(膜)產品的重均相對分子質量、數(shù)均相對分子質量及其分布變化均小于38%，并且重均相對分子質量均保持在1.0×105及以上，表明該類產品具有良好的穩(wěn)定性，在使用過程中能起到優(yōu)良的潤滑及生物屏障作用，有效防止粘連發(fā)生，并可在應用部位保持足夠的時間，達到預期目的，可認為屬于醫(yī)療器械作用。

殼聚糖基可吸收止血非織布與創(chuàng)面血液或者滲出液接觸后，能在接觸面形成高粘性凝膠，迅速與創(chuàng)面緊密貼附，有效封閉創(chuàng)面和血管斷端，達到快速止血的目的，同時也能使創(chuàng)面血液的紅細胞聚集，輔助凝血塊的形成，從而在局部控制出血中發(fā)揮輔助止血作用，置入人體后緩慢降解，最終降解物為氨基葡萄糖單體，可被肌體吸收[24-25]。此次實驗發(fā)現(xiàn)殼聚糖基可吸收止血非織布產品初始相對分子質量是4類產品中最大的，重均相對分子質量和數(shù)均相對分子質量均達到了1.0×106以上，同時也是相對分子質量及其分布變化最大的，重均相對分子質量從初始的1.42×106降低到9.35×104，減少93%；數(shù)均相對分子質量從1.09×106減少到9.22×104，減少約92%；相對分子質量分布從1.30減少到1.01。說明樣品在儲藏過程中發(fā)生了降解，其功能由原始的物理阻隔抑菌向其滲透抑菌發(fā)生了轉變，抑菌效果沒有發(fā)生改變，但是對于其是否能達到快速止血的功效需要進一步考察。

3 結語

通過激光散射-凝膠滲透色譜聯(lián)用法跟蹤了醫(yī)用幾丁糖、殼聚糖基可吸收止血非織布、外科手術用防粘連沖洗液、醫(yī)用防粘連改性殼聚糖(膜)4種醫(yī)用殼聚糖類產品在貨架有效期內的相對分子質量及其分布的變化。醫(yī)用幾丁糖、外科手術用防粘連沖洗液、醫(yī)用防粘連改性殼聚糖(膜)3種產品在貨架有效期內的相對分子質量及其分布變化在可接受范圍內，仍保持其產品原本作用機理。殼聚糖基可吸收止血非織布臨期時的相對分子質量及其分布較臨期1 年時急劇下降，表明該產品在貨架有效期內發(fā)生了明顯降解，其臨床使用時的安全性和有效性需進一步評估。研究結果表明，需要關注醫(yī)用殼聚糖類產品在貨架有效期內的穩(wěn)定性，以保證其臨床使用時的安全有效性。