馮梓琦 鄭景文 王霞 萬(wàn)莉紅△

（1. 明遠(yuǎn)學(xué)園——基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)拔尖學(xué)生培養(yǎng)基地（懷德班）2019 級(jí)，四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 成都 610041；3. 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610041）

細(xì)菌性腦膜炎（Bacterial meningitis，BM）是指因病原菌感染導(dǎo)致宿主硬腦膜、蛛網(wǎng)膜、軟腦膜發(fā)生炎癥的感染性疾病，是兒童中樞系統(tǒng)中最常見(jiàn)的感染性疾病。臨床常見(jiàn)表現(xiàn)為發(fā)熱、頸強(qiáng)直、癲癇發(fā)作、譫妄、嗜睡、昏迷等[1]。肺炎鏈球菌是最常見(jiàn)的致病菌之一[1-4]，在現(xiàn)有的預(yù)防治療措施下，仍具有高致死致殘率[2,3][5]。據(jù)研究，細(xì)菌性腦膜炎致死率在兒童感染性疾病中排行前十[2]，25-50%的幸存患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的認(rèn)識(shí)障礙、繼發(fā)性腦水腫、神經(jīng)組織形成壞死性病灶等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[4]。細(xì)菌性腦膜炎的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前認(rèn)為病原菌可以直接侵犯或間接通過(guò)引起各類(lèi)炎性因子的釋放來(lái)破壞血腦屏障的完整性或改變其通透性，從而最終入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起嚴(yán)重的神經(jīng)損害甚至死亡[5]。

現(xiàn)已有多種成年動(dòng)物模型用于研究細(xì)菌性腦膜炎。例如，通過(guò)鼻腔滴注或腹腔注射菌懸液建立的血源性感染模型多用于研究致病機(jī)理和疫苗開(kāi)發(fā)，但其造模成功率僅在50%左右[6,7]。為了更高效的建立動(dòng)物模型，目前的普遍方法是將菌懸液直接注射入腦室系統(tǒng)，注射方式包括側(cè)腦室注射（Intracerebroventricular injection，ICV）[8]和小腦延髓池注射[9]等。其中，側(cè)腦室注射技術(shù)成熟、成功率高，是較為常用的造模方法。既往研究發(fā)現(xiàn)，哺乳期大鼠細(xì)菌性腦膜炎模型與成年模型相比具有特殊性，海馬和皮質(zhì)的損傷表現(xiàn)不同[10,11]。因此，為了更好的探究?jī)和?xì)菌性腦膜炎的致病機(jī)理和診療靶點(diǎn)，建立幼齡小鼠模型十分重要，但目前尚無(wú)研究確定幼齡小鼠側(cè)腦室注射坐標(biāo)。本文擬通過(guò)側(cè)腦室注射伊文思藍(lán)確認(rèn)4 周齡小鼠ICV 坐標(biāo)，并以此為基礎(chǔ)注射肺炎鏈球菌懸液初步評(píng)估腦膜炎模型建立情況，以期為后期研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及菌株

4 周齡SPF 級(jí)C57BL/6 雄性小鼠，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（中國(guó)，成都），飼養(yǎng)于獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具中，光暗循環(huán)12:12，溫度22°C、濕度55%。

肺炎鏈球菌D39 菌株（血清型2 型），由四川大學(xué)華西第二醫(yī)院保種。

1.1.2 試劑

THB 培養(yǎng)基（海博生物，中國(guó)青島），酵母提取物（北京索萊寶科技有限公司，中國(guó)北京），哥倫比亞血平板（環(huán)凱微生物科技有限公司，中國(guó)廣東），PBS 緩沖液（武漢賽維爾生物科技有限公司，中國(guó)武漢）伊文思藍(lán)染色液（北京索萊寶科技有限公司，中國(guó)北京），戊巴比妥鈉（由機(jī)能實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.2 方法

1.2.1 肺炎鏈球菌培養(yǎng)及懸液制備

肺炎鏈球菌D39 菌株培養(yǎng)于哥倫比亞血平板上，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中。挑取菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中（含0.5%酵母提取物），置于恒溫?fù)u床中過(guò)夜(搖床溫度37°C，振速260 r·min-1）。將1 體積的過(guò)夜培養(yǎng)基（5 mL）加入20 體積的新鮮肉湯中，并孵育至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，收菌。收菌后9000 rpm 低溫離心4 min，PBS 重懸稀釋?zhuān)鶆蛲块_(kāi)分布于血瓊脂平板上，放入培養(yǎng)箱過(guò)夜。

制作菌懸液時(shí)用生理鹽水潤(rùn)洗平板3 次，9000 rpm 低溫離心4 min，棄去上清，獲得菌體沉淀。生理鹽水重懸，調(diào)整菌懸液濃度至1×109CFU·mL-1（OD600=1），后根據(jù)注射所需濃度進(jìn)行稀釋。

1.2.2 4 周齡小鼠右側(cè)腦室注射

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，稱(chēng)重，腹腔注射給予戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）麻醉。后將小鼠固定于立體定位儀（瑞沃德生命科技有限公司，中國(guó)廣東）上，備皮，于兩耳平齊位置沿中線剪開(kāi)頭頂皮膚。根據(jù)成年小鼠ICV 坐標(biāo)（ML：-1.5 mm，AP：-0.6 mm，DV：-1.7 mm）及發(fā)育期小鼠腦成像[12]摸索4 周齡小鼠右側(cè)腦室坐標(biāo)。確定試驗(yàn)坐標(biāo)后用顱骨鉆鉆孔，使用玻璃微針注射器（瑞沃德生命科技有限公司，中國(guó)廣東）以0.5 μL·min-1的速度緩慢注射2 μL 伊文思藍(lán)。留針觀察15 min 后處死小鼠，剪開(kāi)顱骨觀察染液擴(kuò)散分布。

1.2.3 4 周齡小鼠肺炎鏈球菌腦膜炎模型的構(gòu)建

確認(rèn)4 周齡小鼠注射坐標(biāo)為ML：-1.3 mm，AP：-0.5 mm，DV：-1.6 mm，采用上述方法向小鼠右側(cè)腦室注射2 μL 含3.5×105CFU 肺炎鏈球菌懸液，留針15 min 后縫合，術(shù)后復(fù)溫。對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1.2.4 Loeffler 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

術(shù)后20 h 分別對(duì)模型組及對(duì)照組小鼠進(jìn)行Loeffler 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：5 分-抓住背部時(shí)能正常運(yùn)動(dòng)，在5 秒內(nèi)翻身；4 分-自主運(yùn)動(dòng)減少；3分-翻身＞5 s；2 分-不能翻身；1 分-不能運(yùn)動(dòng)；0 分-死亡。

1.2.4 病理評(píng)價(jià)

術(shù)后20 h 仍存活的動(dòng)物，進(jìn)行Loeffler 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后斷頸處死。立即用無(wú)菌手術(shù)剪沿后囟剪開(kāi)顱骨，取出腦組織置于4%多聚甲醛4°C 固定，石蠟包埋后切片，HE 染色。每張切片在100 倍鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野觀察軟腦膜、蛛網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)形態(tài)及鄰近皮層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)通過(guò)GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，采用one-way ANOVA 方差分析檢驗(yàn)，其中P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 ICV 注射坐標(biāo)

定位小鼠右側(cè)腦室（中線右旁開(kāi)1.3 mm，前囟后0.5 mm，垂直深度1.6 mm，即ML：-1.3 mm，AP：-0.5 mm，DV：-1.6 mm），以0.5 μL·min-1 的速度緩慢注射2 μL 伊文思藍(lán)。如圖1 所示，背面觀注射創(chuàng)傷小，15 min 后染液由右側(cè)腦室隨腦脊液循環(huán)分布至雙側(cè)側(cè)腦室、顱底窩等。

圖1 經(jīng)側(cè)腦室向4 周齡小鼠注射伊文思藍(lán)后頭顱解剖示意圖

2.2 4 周齡小鼠肺炎鏈球菌腦膜炎模型初步建立成功

以2 μL 生理鹽水或等體積3.5×105CFU 肺炎鏈球菌懸液分別側(cè)腦室注射，于20 h 后進(jìn)行Loeffler 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。對(duì)照組小鼠進(jìn)食飲水正常，活動(dòng)良好；模型組有一只小鼠死亡，其余小鼠均出現(xiàn)不同程度的活動(dòng)能力喪失，伴隨呼吸明顯加快和震顫。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示模型組Loeffler 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 Loeffler 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分評(píng)估造模效果（±SD，n=6）

表1 Loeffler 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分評(píng)估造模效果（±SD，n=6）

注：與對(duì)照組相比，**P＜0.01。

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2.3 4 周齡小鼠肺炎鏈球菌腦膜炎模型的病理改變

鏡下觀察小鼠腦組織切片HE 染色結(jié)果，肺炎鏈球菌懸液感染20 h 后，模型組小鼠蛛網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)被破壞，軟腦膜充血，出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而對(duì)照組小鼠腦膜結(jié)構(gòu)正常，見(jiàn)圖2。

圖2 HE 染色觀察小鼠腦膜結(jié)構(gòu)變化（100×）

3 討論

細(xì)菌性腦膜炎是兒童高發(fā)的感染性疾病，現(xiàn)認(rèn)為病原菌可直接或間接引起中樞損傷，造成嚴(yán)重腦功能障礙，甚至導(dǎo)致患兒死亡。過(guò)去的研究多使用成年動(dòng)物疾病模型，但已知幼齡嚙齒類(lèi)腦膜炎動(dòng)物模型的腦損傷具有特殊性[10,11]。故為了有針對(duì)性的探究?jī)和?xì)菌性腦膜炎的致病機(jī)理，建立更高效穩(wěn)定的幼齡動(dòng)物模型十分必要。在小鼠中，側(cè)腦室注射菌懸液是常用的肺炎鏈球菌腦膜炎模型的建立方法。但因幼齡小鼠仍處發(fā)育期，尚無(wú)研究給出詳細(xì)的側(cè)腦室注射坐標(biāo)、造模方法及模型評(píng)價(jià)結(jié)果。

本研究使用4 周齡C57BL/6 雄性小鼠，以成年小鼠右側(cè)腦室坐標(biāo)及小鼠發(fā)育階段腦成像為依據(jù)，定位注射伊文思藍(lán)染液，后處死小鼠并剪去顱骨，從腦整體及矢狀切面可觀察到藍(lán)色染液沿腦脊液循環(huán)分布至腦室系統(tǒng)、蛛網(wǎng)膜下腔等處。故確定該年齡段小鼠側(cè)腦室注射的可行坐標(biāo)為ML：-1.3 mm，AP：-0.5 mm，DV：-1.6 mm。除此之外，本研究使用的玻璃微針注射器造成的創(chuàng)傷較小，有效的提升了注射安全性和小鼠存活率，有助于模型的穩(wěn)定建立。前人研究發(fā)現(xiàn)，血源性感染造模的成功率較低，直接向小鼠的側(cè)腦室注射菌懸液可以同時(shí)提高造模成功率和模型動(dòng)物生存率[8]。本文確定了4 周齡小鼠側(cè)腦室定位后，進(jìn)行了肺炎鏈球菌（D39 菌株）懸液ICV 造模。20 h 后觀察，模型組小鼠出現(xiàn)明顯的腦膜炎癥狀，包括呼吸急促、震顫、活動(dòng)能力顯著減弱甚至死亡。病理切片顯示模型組小鼠出現(xiàn)明顯的腦膜結(jié)構(gòu)破壞及炎癥浸潤(rùn)，故說(shuō)明該模型基本建立成功。綜上所述，本文確定了4 周齡C57BL/6 雄性小鼠右側(cè)腦室注射坐標(biāo)，可用于建立穩(wěn)定高效的幼齡小鼠細(xì)菌性腦膜炎模型，有助于推進(jìn)兒童細(xì)菌性腦膜炎相關(guān)基礎(chǔ)研究。