張 慶, 方昊天, 李青山, 徐 繁

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科, 河北 承德 067000)

乳腺癌是全球威脅女性健康最嚴(yán)重的惡性腫瘤,在中國就有約12萬中國女性死于乳腺癌[1-2],發(fā)現(xiàn)新的更敏感的生物標(biāo)志物對乳腺癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。C1q類似蛋白4(C1q-like protein 4,C1ql4),是C1q和腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)蛋白(CTRPs) 家族的主要成員之一,也是脂肪來源的分泌蛋白,在睪丸和脂肪組織中高度表達。Clq14在促進血管生成、抑制脂肪生成、拮抗肌母細(xì)胞融合、促進睪酮合成和分泌等方面發(fā)揮著十分重要的作用[3-4]。血管生成在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著極其重要的作用[5]。因此,抗血管生成可以破壞預(yù)先存在的血管并避免新血管形成,使腫瘤血管系統(tǒng)正?；?減少腫瘤細(xì)胞氧氣供應(yīng)和營養(yǎng)支持,進而抑制腫瘤生長。目前尚無C1ql4在乳腺癌中表達情況的相關(guān)研究。本研究檢測乳腺癌組織中C1ql4的表達情況,并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2016年1月至2017年7月術(shù)后病理明確診斷為乳腺癌的143例患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者均于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進行改良根治術(shù)或乳腺區(qū)段切除術(shù);②經(jīng)術(shù)后病理確診,有完整的病理學(xué)資料;③術(shù)前均未行放、化療或內(nèi)分泌治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①伴有第二原發(fā)惡性腫瘤疾病;②伴有嚴(yán)重免疫缺陷疾病;③伴有心、腦、肺、腎等臟器的重大疾病;④伴有嚴(yán)重代謝性疾病?；颊咂骄挲g51.94±9.81歲,中位年齡51歲(26-81歲)?？偵嫫谟嬎銥槭中g(shù)日期至患者死亡或最后一次隨訪日期。末次隨訪時間為2022年6月。其中死亡27例。采集患者臨床資料,包括患者年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分子分型和生存期等。同時收集明確診斷為乳腺纖維腺瘤患者的手術(shù)后組織標(biāo)本20例作為對照組?；贏JCC2017版本標(biāo)準(zhǔn)進行TNM分期。本研究均取得患者知情同意。研究方案經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批號:LL2021048)。

1.2免疫組織化學(xué)染色檢測組織C1ql4表達水平:切片60℃烤箱烘片2h后取出,二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸泡10min。水化,PBS 3min×3次。微波爐高溫檸檬酸鹽抗原修復(fù),PBS漂洗5min×3次。按照通用SP試劑盒說明進行操作。一抗(稀釋比例1∶200),4℃孵育過夜。二抗37℃孵育30min,根據(jù)DAB顯色試劑盒說明顯色,蘇木精染液復(fù)染,1%鹽酸酒精分化液分化,脫水、透明、封片,鏡檢拍照留存。結(jié)果判定:C1ql4陽性染色主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,在細(xì)胞核中表達較少。參考以往研究中所應(yīng)用的免疫組化評分系統(tǒng),采用半定量積分法評估結(jié)果,每張切片隨機選取5個高倍視野,按照陽性細(xì)胞百分比及染色強度進行評分,具體如下:①陽性細(xì)胞百分比:0分(<5%),1分(5%～25%),2分(26%～50%),3分(51%～75%),4分(76%～100%);②染色強度:0分(陰性),1分(弱陽性,淡黃色),2分(中等陽性,黃色),3分(強陽性,棕褐色),兩項分?jǐn)?shù)相乘得到最終評分,0分為陰性(-),1～4分為弱陽性(+),5～8分為陽性(++),9～12分為強陽性(+++)。1分及以上均為陽性,其中1～8分為低表達,>8分為高表達[6]。

2 結(jié) 果

2.1C1ql4在乳腺癌和乳腺纖維腺瘤中的表達:免疫組化結(jié)果顯示C1ql4的免疫陽性反應(yīng)主要位于乳腺癌組織的細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核中有少量分布。根據(jù)半定量評分標(biāo)準(zhǔn),將C1ql4在組織中的表達劃分為高表達組和低表達組。在乳腺纖維腺瘤中,C1ql4蛋白陽性表達率為15%(3/20),且均為低表達(見圖1);而在乳腺癌組織中C1ql4蛋白陽性率為98.6%(141/143)(見圖2)。與乳腺纖維腺瘤相比,C1ql4在癌組織中的表達明顯增強(P<0.001),見圖3。

圖1 C1ql4在乳腺纖維腺瘤組織中的表達情況(放大倍數(shù)200)

圖2 C1ql4在乳腺癌組織中的表達情況(放大倍數(shù)200)

2.2不同病理特征乳腺癌患者的C1ql4表達水平比較:分析結(jié)果顯示,C1ql4高表達與瘤體直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分子分型相關(guān),而與年齡、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、Her-2狀態(tài)、Ki67無明顯相關(guān)性(見表1)。

表1 乳腺癌組織中C1ql4表達與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系n(%)

2.3C1ql4蛋白表達與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系:在本研究中,27例患者(18.9%)在隨訪期間死于乳腺癌惡化,死亡患者的中位生存時間僅為43.0個月,生存期范圍為10.0-58.0個月。生存分析顯示,1、3、5年生存率分別為99.3%、94.4%、81.1%。C1ql4高表達組的生存預(yù)后相比低表達組患者較差(log-rank檢驗χ2=11.953,P=0.001),見圖4。

圖4 C1ql4表達與乳腺癌患者的預(yù)后

2.4影響乳腺癌患者OS的單因素及多因素分析:單因素分析顯示,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、分子分型以及C1ql4的表達量與乳腺癌患者的總生存相關(guān)(見表2)。多因素Cox回歸分析顯示,腫瘤的TNM分期、分子分型以及C1ql4的表達量是乳腺癌患者總生存的獨立預(yù)后因素(見表3)。

表2 賦值情況

表3 影響乳腺癌患者OS的單因素和多因素COX回歸分析

3 討 論

乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后治療效果欠佳,耐藥及治療副反應(yīng)嚴(yán)重影響患者的預(yù)后,威脅患者的生命[7]。因此,尋找新的治療靶點對乳腺癌的診治至關(guān)重要。腫瘤的生長與血管生成密切相關(guān),乳腺癌的異常增殖和轉(zhuǎn)移依賴于新血管的不斷生成[8]。C1ql4通過激活ERK1/2信號通路刺激血管新生。C1ql4的促血管生成作用將可能為缺血性損傷的血管修復(fù)、組織器官再生及傷口愈合提供一種新的治療思路;同時也可能為腫瘤的抗血管生成治療提供新的干擾靶點。本研究結(jié)果表明C1ql4蛋白表達在乳腺癌惡性發(fā)展的過程中呈上升趨勢,提示高表達的C1ql4蛋白可能在乳腺癌的發(fā)展過程中發(fā)揮促進作用。通過對C1ql4和臨床病理資料的分析,我們發(fā)現(xiàn)發(fā)病年齡<40歲、腫瘤直徑>2cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、病理分級Ⅱ～Ⅲ級、TNM分期Ⅲ期～Ⅳ期和三陰型患者中,C1ql4蛋白高表達患者比例均超過50%,其中,C1ql4的表達與乳腺癌患者的腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及分子分型之間相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義。上述臨床病理指標(biāo)是與乳腺癌預(yù)后不良相關(guān)的重要臨床指標(biāo),提示C1ql4可能與乳腺癌的高危復(fù)發(fā)因素和惡性程度存在相關(guān)性,由此我們推測C1ql4可能促進了乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的進展。生存分析表明,C1ql4高表達的乳腺癌患者,其生存時間明顯短于C1ql4蛋白低表達的患者,表明C1ql4高表達對乳腺癌具有促進作用。

目前關(guān)于C1ql4及其相關(guān)作用機制在腫瘤,特別是在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。C1ql4可能通過調(diào)節(jié)血管新生、腫瘤微環(huán)境、雌激素水平和脂肪代謝進而影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。但有關(guān)此方面的研究較少,其具體機制有待深入研究。綜上,本研究檢測了C1ql4在乳腺癌組織中的表達情況并分析了C1ql4的表達量與乳腺癌患者生存預(yù)后的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)C1ql4在乳腺癌中表達水平升高,C1ql4高表達與患者預(yù)后不良相關(guān),可能成為乳腺癌的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點。未來需要開展更多的基礎(chǔ)研究和臨床研究,進一步探討C1ql4在乳腺癌中的作用及機制。