常 暢, 高 靜, 李志強

(河北北方學院附屬第二醫(yī)院病理科, 河北 張家口 075100)

宮頸癌(Cervical cancer,CC)是一種起源于子宮頸細胞的惡性腫瘤[1]。子宮頸由兩部分組成,上面覆蓋著兩種不同類型的細胞,宮頸管靠近子宮的部分,由腺細胞組成,宮頸管靠近陰道的部分,由鱗狀細胞組成。盡管在診斷和治療策略方面取得了進展,但宮頸癌仍然是女性癌癥死亡的主要原因。因此尋找與CC相關(guān)的生物靶基因,對于CC早期診斷和預(yù)后具有重要價值。角蛋白17(Keratin17,KRT17)屬于I型角蛋白,它大量存在于上皮基底細胞中,作為一種細胞骨架蛋白,KRT17可以調(diào)節(jié)許多生物過程,研究發(fā)現(xiàn)KRT17在CC癌病變和惡性鱗狀細胞病變中高度表達。Kruppel樣因子4(Kruppel-Like Factor 4,KLF4)在細胞增殖、分化、重編程以及細胞對致癌信號和電離輻射的反應(yīng)中起重要作用[2]。KLF4可以在不同的細胞環(huán)境中充當腫瘤抑制基因[3]。KRT17和KLF4都與CC有關(guān),但二者共同在CC中的研究甚少。因此,本研究通過探究KRT17和KLF4在CC患者組織中的表達以及與臨床病理特征的關(guān)系,研究其在預(yù)后中的價值,旨在為CC患者預(yù)后評估提供具有說服力的診斷性生物標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2015年4月至2019年4月在我院婦產(chǎn)科確診為CC的86例患者為研究對象,均同意術(shù)中取其癌組織和癌旁組織(癌灶周3cm以外的正常組織),即為CC組和癌旁組,年齡為30～60歲,平均年齡為(45.50±5.50)歲,腫瘤大小<4cm的有45例,≥4cm的有41例;組織學類型為鱗癌的有44例,其他類型42例;肌層浸潤深度<1/2的有40例,≥1/2的有46例;淋巴結(jié)狀態(tài)來分:27例N0,29例N1,30例N2;按分化程度來分,低分化31例,中分化28例,高分化27例。本次研究本院倫理委員會已通過審批,所有患者均自愿簽署研究知情同意書。CC患者的納入標準:①患者符合《子宮頸癌診斷與治療指南(2021年版)》[4]中有關(guān)CC的診斷標準,并術(shù)后經(jīng)組織病理學證實;②完整的臨床資料的患者;③均為初次確診的患者。排除標準:①心、肝功能不全的患者;②患有自身免疫性疾病的患者;③合并其他惡性腫瘤或者其他傳染病的患者;④處于妊娠期或者哺乳期的患者。

1.2方 法

1.2.1KRT17、KLF4蛋白水平檢測:收集CC患者癌組織和癌旁組織并浸泡于10%中性福爾馬林固定液中,常規(guī)脫水,石蠟包埋,保存?zhèn)溆?。采用免疫組化法進行組織蛋白水平的測定,各組織樣品分別切片,常規(guī)脫蠟至水,用3%H2O2室溫處理8min后用蒸餾水洗3遍,滴加封閉液室溫下20min。用稀釋液將一抗加入,4℃孵育過夜,沖洗;加入二抗(山羊抗兔lgG)37℃30min;DAB顯色,蘇木素復染,最后分化,封片進行鏡檢。使用試劑盒為免疫組化SP法檢測試劑盒(山羊IgG),貨號為EY-24704,購自于上海一研生物科技有限公司。

1.2.2判定結(jié)果:判定方法為半定量評分法,當KRT17、KLF4表現(xiàn)棕黃色則為陽性表達。染色指數(shù)(staining index,SI)為陽性細胞×染色強度比例。陽性細胞比例:<25%記0分,25%～50%記1分,51%～75%記2分,>75%記3分;染色強度:無染色記0分,弱染色(淺黃色)記1分,中染色(黃褐色)記2分,強染色(棕褐色)記3分。3名專業(yè)人員對結(jié)果進行評分,SI≤3分為陰性,SI>3分為陽性,總分為0～9分。

1.2.3隨訪:所有患者在術(shù)后每三個月進行門診復診或者電話統(tǒng)計患者術(shù)后3年生存情況,統(tǒng)計終止日期為2022年3月或患者死亡。

1.3統(tǒng)計學分析:采用SPSS25.0進行統(tǒng)計學分析。以n(%)表示計數(shù)資料,行χ2檢驗;采用Kaplan-Meier生存曲線,Log-rank檢驗分析KRT17和KLF4表達水平與CC患者術(shù)后3年生存情況的關(guān)系;CC患者術(shù)后3年預(yù)后不良的危險因素采用Cox回歸分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1KRT17和KLF4在兩組中陽性表達情況:與癌旁組相比,CC組KRT17的陽性表達率顯著升高,KLF4陽性表達率顯著降低(P<0.05)。其陽性表達率分別為45.35%、48.84%。見表1、圖1。

圖1 KRT17和KLF4在組織中的表達(標尺:100μm)

表1 KRT17和KLF4在兩組中陽性表達情況n(%)

2.2KRT17和KLF4與CC患者臨床病理特征的關(guān)系:在86例CC患者中,KRT17和KLF4陽性表達在肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度中比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);KRT17和KLF4均與CC患者的年齡、腫瘤大小、組織學類型無關(guān)(P>0.05),見表2。

表2 KRT17和KLF4與CC患者臨床病理特征的關(guān)系n(%)

2.3KRT17和KLF4表達與CC患者預(yù)后的關(guān)系:截止到2022年3月,未發(fā)現(xiàn)失訪病例,存活患者55例,存活率為63.95%。其中,KRT17陽、陰性組存活數(shù)分別為13例(33.33%)和42例(89.36%);KLF4陽、陰性組存活數(shù)分別為40例(95.23%)和15例(34.09%)。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示,KRT17陽性表達患者3年累積生存率25.64%(10/39)顯著低于陰性表達者87.23%(41/47),差異有統(tǒng)計學意義(Log rank χ2=19.940,P<0.001);KLF4陽性表達者3年累積生存率85.71%(36/42)顯著高于陰性表達者22.72%(10/44),差異具有統(tǒng)計學義(Log rank χ2=23.728,P<0.001) (見圖2、3)。

圖2 KRT17表達與CC患者生存率的關(guān)系

圖3 KLF4表達與CC患者生存率的關(guān)系

2.4COX回歸分析影響CC患者預(yù)后的危險因素:采用COX單因素回歸分析年齡、腫瘤大小、組織學類型、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、KRT17和KLF4對CC患者預(yù)后的影響,結(jié)果顯示,肌層浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、KRT17和KLF4分別是CC患者預(yù)后的影響因素(P<0.05);在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上,以生存時間為時間變量,生存狀態(tài)為因變量,肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、KRT17和KLF4為自變量進行COX多因素回歸分析(具體賦值見表3),結(jié)果顯示,肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、KRT17和KLF4表達是影響CC患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)。(見表4)。

表3 COX回歸分析的賦值

表4 COX回歸分析影響CC患者預(yù)后的危險因素

3 討 論

宮頸癌被稱為全球第四大常見癌癥,也是全球女性癌癥死亡的第四大主要原因[5]。CC的發(fā)展涉及一系列遺傳和轉(zhuǎn)錄變化的生物學過程[6]。對于中國女性來說,CC患者的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢[7]。早期的CC有可能通過手術(shù)、放療或化療的綜合治療得到治愈,而晚期患者的預(yù)后較差[8]。因此,早期預(yù)測宮頸癌預(yù)后可以進行有效治療并顯著改善預(yù)后。

KRT17被認為是復雜上皮細胞中基底細胞分化的標志物[9]。KRT17在癌組織中被再生并高度表達,KRT17也被發(fā)現(xiàn)在胃癌、宮頸惡性腫瘤、乳腺癌、口腔鱗狀細胞癌和胰腺癌中表達,并且與宮頸癌、胃癌和口腔鱗狀細胞癌的不良預(yù)后有關(guān)。MIR205HG通過調(diào)控KRT17影響宮頸癌細胞的生物行為,KRT17在宮頸癌細胞中陽性表達,沉默KRT17抑制了宮頸癌細胞的增殖和遷移能力,促進了宮頸癌細胞凋亡能力。本次研究發(fā)現(xiàn),與癌旁組相比,CC組KRT17的陽性表達率顯著升高,與前人研究一致,并且KRT17表達水平與肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān),提示KRT17參與CC的發(fā)生發(fā)展。Kaplan-Meier法分析結(jié)果表明,KRT17陽性表達組患者3年內(nèi)累積生存率低于陰性表達組,多因素COX回歸分析結(jié)果顯示,肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、KRT17表達是影響CC患者預(yù)后的危險因素,表明KRT17在CC的發(fā)展過程中具有促癌作用,也說明KRT17與CC患者的預(yù)后存在密切關(guān)系,在臨床上KRT17可作為預(yù)后的監(jiān)測性指標。

KLF4是一種鋅指型轉(zhuǎn)錄因子,是進化上保守的特異性蛋白(Sp)/KLF蛋白家族的成員,其特征是在其C端存在鋅指基序域[10]。KLF4不僅在細胞生理過程中發(fā)揮重要作用,而且作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用,在癌癥中表達降低[11]。與正常宮頸組織相比,癌組織和細胞中的KLF4表達降低,并作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用[5]。本次研究發(fā)現(xiàn),與癌旁組相比,CC組KLF4陽性表達率顯著降低,KLF4表達水平與肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān),提示KLF4的表達與CC患者的臨床病理特征有關(guān)。Kaplan-Meier法分析結(jié)果表明,KLF4陽性表達組患者3年內(nèi)累積生存率高于陰性表達組,多因素COX回歸分析結(jié)果顯示,KLF4表達是影響CC患者預(yù)后的危險因素,也說明KLF4表達水平與CC患者預(yù)后存在緊密聯(lián)系,表明KLF4有望成為CC預(yù)后新的生物標志物。

綜上所述,與癌旁組相比,CC組KRT17的陽性表達率顯著升高,KLF4陽性表達率顯著降低,二者與CC患者臨床病理特征有關(guān),對患者的預(yù)后評估存在一定的價值。本研究樣本量有限,存在一定的偏差,接下來將擴大樣本量,為研究結(jié)果進一步補充和完善。