廖雪霞, 彭 鑫, 符 鑫, 吳德建

(海南省儋州市人民醫(yī)院消化內(nèi)科, 海南 儋州 571799)

胃癌(Gastric Cancer,GC)是全球第五大常見惡性腫瘤之一[1-2]。盡管近年來GC的死亡率有所下降[3],但許多患者在晚期被診斷為淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,無特異性癥狀。Ⅲ期胃癌的5年生存率僅約為15%。然而,晚期GC的可用治療方法有限[4-6]。因此,發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)來控制GC的發(fā)展十分有必要。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是革蘭氏陰性、微需氧的細(xì)菌生存于胃部及十二指腸的各區(qū)域內(nèi)。.它會引起胃粘膜輕微的慢性胃炎,或?qū)е挛讣笆改c潰瘍與胃癌[7]。目前,Hp感染被認(rèn)為是GC發(fā)展的重要初始因素[8]。盡管Hp感染與GC的發(fā)展之間存在密切的因果關(guān)系,但這一過程中涉及的確切機(jī)制尚未完全明晰。miRNAs參與多細(xì)胞生物中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[9-10]。許多研究表明,miRNA在多種疾病(包括癌癥)的生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用[11-12]。最近的發(fā)現(xiàn)揭示了miRNA對Hp感染的反應(yīng)失調(diào),通過改變正常的生物學(xué)過程(如凋亡、增殖和宿主炎癥免疫反應(yīng)),在調(diào)節(jié)Hp感染的疾病中發(fā)揮了重要作用。其中,miR-125a-5p是參與癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵miRNA之一。高通量測序數(shù)據(jù)表明miR-125a-5p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌和膀胱癌中下調(diào),而在胃癌中上調(diào)表達(dá)。因此,miR-125a-5p在癌癥進(jìn)展中作用的存在爭議,本研究擬進(jìn)一步探究miR-125a-5p在GC進(jìn)展中的作用。EVA1A(又稱TMEM166/FAM176A,)是一種參與自噬和細(xì)胞凋亡的新蛋白,在一些人類原發(fā)性癌癥中起到抑癌作用。先前的研究表明,EVA1A通過誘導(dǎo)自噬和凋亡抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖;miR-103a-3p下調(diào)EVA1A促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和遷移。然而,EVA1A在GC中表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此,本研究擬通過體外細(xì)胞模型進(jìn)一步探討Hp感染對GC細(xì)胞增殖和侵襲的影響,以及Hp誘導(dǎo)的miR-125a-5p靶向EVA1A在GC發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1樣本收集:2021年1月至2022年12月,選取儋州市人民醫(yī)院20例Hp感染或未感染的患者接受了胃鏡檢查。收集20例患者的樣本,立即在液氮中快速冷凍,并在-80℃下保存,直到提取RNA。當(dāng)快速尿素酶試驗呈陽性時,樣品被鑒定為陽性。這些選定的患者也通過13C呼氣測試得到證實。這項研究得到了醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(倫審:2021003),每個患者均有書面知情同意書。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染:人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、SGC-7901購自ATCC(USA),在添加10%胎牛血清(Gibico)和青霉素(100U/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞在37℃、5%CO2的條件中培養(yǎng)。miR-125a-5p mimic、miR-125a-5p inhibitor、oe-EVA1A以及對應(yīng)的陰性對照購自于Ribobio (China)。使用 Lipofectamine 2000試劑盒(Thermo Fisher Scientific,USA),并根據(jù)試劑盒操作說明書將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到OSCC細(xì)胞中。

1.3細(xì)菌培養(yǎng):從ATCC購買NCTC11637(一株CagA陽性Hp菌株)。Hp細(xì)胞在37℃、含10%CO2、5%O2和8%N2的混合空氣中,置于補(bǔ)充5%羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂平板培養(yǎng)。

1.4Hp感染GC細(xì)胞:在用Hp感染GC細(xì)胞之前,將GC細(xì)胞洗滌并重新懸浮在新鮮的無抗生素培養(yǎng)基中。將細(xì)菌在含5%羊血的胰蛋白酶大豆肉湯中培養(yǎng)48h,并在37℃下攪拌均勻,在含有10%CO2、5%O2和8%N2的混合空氣中培養(yǎng)48h,收獲并重新懸浮在RPMI 1640培養(yǎng)基中。GC細(xì)胞用10% FBS保存在RPMI 1640中。生長至90%匯合的細(xì)胞以100/1的Hp/細(xì)胞比率感染Hp。將Hp加入到6孔板的細(xì)胞培養(yǎng)板中。在收獲前,將細(xì)胞與Hp在37℃的潮濕環(huán)境中共同培養(yǎng)。

1.5qRT-PCR:利用Trizol法提取總RNA,EVA1A和miR-125a-5p的定量檢測,RNA通過Qiagen One-Step RT-PCR kit(Qiagen Gmbh,Germany)一步逆轉(zhuǎn)錄法將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行qRT-PCR實驗。具體引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6CCK-8和克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖:對于細(xì)胞活力的檢測,將細(xì)胞以2×103個細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中,并孵育0h,24h,48h,72h。加入10μL CCK-8溶液(Sigma,USA),繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4h。用酶標(biāo)儀在450nm處檢測吸光度。對于細(xì)胞增殖的檢測,將1×103個不同處理的GC細(xì)胞接種于六孔板中,培養(yǎng)14天。細(xì)胞用多聚甲醛固定,并用0.5%(w/v)結(jié)晶紫染色。最后,對細(xì)胞集落進(jìn)行計數(shù)。

1.7Transwell:對于細(xì)胞遷移測定,將在無血清培養(yǎng)基中收獲的轉(zhuǎn)染細(xì)胞置于Boyden Transwell室(Corning,USA)的上室。對于細(xì)胞侵襲測定,將細(xì)胞接種在預(yù)涂有100%Matrigel(BD Biosciences)的上室中。在下腔室中含有10%FBS的完整培養(yǎng)基用作化學(xué)引誘劑。用棉簽輕輕去除殘留在上表面的細(xì)胞,固定位于下腔室的細(xì)胞,用結(jié)晶紫染色,并在光學(xué)顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.8雙熒光素酶實驗:使用starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-125a-5p與EVA1A的結(jié)合位點(diǎn)。野生型和突變型EVA1A (EVA1A -WT/MUT)報告載體由 General Biosystems (China)生產(chǎn)。使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen,USA) 用 miR-125a-5p mimic或 NC mimic和上述報告載體共轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 48h后,使用 Dual-Lucy Assay Kit (Solarbio,USA) 測量熒光素酶活性。

1.9免疫組化:將切片與3%H2O2孵育,然后用5%山羊血清(Zsbio,China)封閉15min。將抗EVA1A(Abcam,UK)抗體添加到切片中,并在4℃下孵育過夜。用PBS洗滌切片,將切片與山羊抗兔二抗(Abcam,UK)在37℃下孵育20min。使用DAB檢測試劑盒(Beyotime Biotechnology,China)對切片進(jìn)行可視化,然后在顯微鏡下觀察,Image-Pro Plus 6.0(MediaCybernetics,USA)用于定量分析。

1.10統(tǒng)計分析:本研究所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,并使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行分析并繪圖。 多組間差異均使用Anova檢驗差異顯著性,兩組間差異的比較均使用T檢驗差異的顯著性。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-125a-5p在Hp感染的陽性組織中顯著下調(diào):首先,我們通過qRT-PCR分析了Hp感染的陽性組織和正常組織中miR-125a-5p的表達(dá)。結(jié)果顯示,miR-125a-5p在Hp感染陽性組織中的表達(dá)減少(圖1A)。在Hp感染陽性組織中,我們發(fā)現(xiàn)CAG的miR-125a-5p表達(dá)低于CG(圖1B)。

圖1 miR-125a-5p在Hp感染的陽性組織表達(dá)

2.2miR-125a-5p抑制AGS細(xì)胞的遷移和侵襲:為進(jìn)一步探究miR-125a-5p在GC進(jìn)展中的作用。用miR-125a-5p mimic和miR-125a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染至Hp感染的GC細(xì)胞。首先,通過qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率(圖2A)。CCK-8和克隆形成實驗結(jié)果表明過表達(dá)miR-125a-5p可以抑制GC細(xì)胞活力和增殖能力,而敲低表達(dá)miR-125a-5p則明顯抑制GC細(xì)胞活力和增殖能力(圖2B-C)。Transwell實驗表明,miR-125a-5p的過度表達(dá)可以抑制GC細(xì)胞的遷移和侵襲,而其敲低則促進(jìn)細(xì)胞的遷移侵襲(圖2D)。上述結(jié)果表明,Hp感染誘導(dǎo)的miR-125a-5p下調(diào)可以抑制AGS細(xì)胞的遷移和侵襲

圖2 miR-125a-5p抑制AGS細(xì)胞的遷移和侵襲

2.3EVA1A是miR-125a-5p的下游靶點(diǎn):我們通過生信數(shù)據(jù)庫預(yù)測確定了miR-125a-5p的下游靶點(diǎn),以闡明miR-125a-5p抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的機(jī)制。starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測了數(shù)百個靶基因,本研究挑選EVA1A為研究對象(圖3A)。通過qRT-PCR和免疫組化實驗檢測結(jié)果顯示,EVA1A在Hp感染的陽性組織中顯著上調(diào)表達(dá),其在CAG中的表達(dá)也高于CG(圖3B-D)。雙熒光素酶實驗表明miR-125a-5p過表達(dá)可以下調(diào)野生型EVA1A的熒光素酶活性(圖3E)。最后,我們探究了miR-125a-5p異常表達(dá)對EVA1A表達(dá)的影響。qRT-PCR實驗測表明,miR-125a-5p的過度表達(dá)可以顯著下調(diào)EVA1A的表達(dá),而miR-125a-5p敲低的效果則相反(圖3F)。

圖3 EVA1A是miR-125a-5p的下游靶點(diǎn)

2.4miR-125a-5p靶向EVA1A抑制GC細(xì)胞增殖和遷移:為了進(jìn)一步確定miR-125a-5p/EVA1A軸在GC中的生物學(xué)功能及調(diào)控作用,我們進(jìn)行了一系列細(xì)胞功能實驗。qRT-PCR分析結(jié)果表明,過表達(dá)miR-125a-5p抑制了AGS細(xì)胞中EVAA的表達(dá),進(jìn)一步過表達(dá)EVA1A逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果(圖4A)。細(xì)胞功能實驗結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-125a-5p抑制了AGS細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,進(jìn)一步過表達(dá)EVA1A可以減弱過表達(dá)miR-125a-5p對這些細(xì)胞表型的影響(圖4B-D)。綜上。這些結(jié)果表明miR-125a-5p靶向EVA1A抑制GC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。

圖4 miR-125a-5p靶向EVA1A抑制GC細(xì)胞增殖和遷移

3 討 論

近年來,幽門螺桿菌感染率不斷上升,特別是在發(fā)展中國家。臨床研究表明,幽門螺桿菌與胃癌有關(guān),但其機(jī)制尚不清楚。最近的研究表明,miRNAs在調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。然而,它們與癌癥的關(guān)系尚未完全明晰。在本研究中,證實了miR-125a-5p在Hp感染陽性組織中顯著下調(diào)。最近研究報道,miR-125a-5p在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮抑癌基因的功能,如miR-125a-5p通過調(diào)節(jié)TAZ/EGFR信號通路抑制卵巢癌癥細(xì)胞的EMT。此外,研究表明,miR-125a-5p的表達(dá)譜是組織特異性的,它可能具有不同的功能,這取決于腫瘤組織或細(xì)胞類型。研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p在GC中高表達(dá),miR-125a-5p通過調(diào)節(jié)Hippo通路促進(jìn)GC細(xì)胞活性和侵襲。在本研究中,目前的結(jié)果表明,miR-125a-5p的過度表達(dá)抑制了胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲,這與既往的研究結(jié)果相一致。據(jù)此,本文猜測與Hp相關(guān)的miR-125a-5p表達(dá)降低是可能是GC發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制,提示可能miR-125a-5p是胃癌早期診斷的潛在標(biāo)志物。

為進(jìn)一步探究miR-125a-5p在GC進(jìn)展中的調(diào)控機(jī)制。通過生物信息學(xué)軟件及分子實驗證實:miR-125a-5p與EVA1A存在靶向結(jié)合關(guān)系。EVA1A是2007年高通量篩選的一種參與程序性細(xì)胞死亡的新蛋白。EVA1A在許多生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。最近研究表明,EVA1A的下調(diào)及其抑癌活性被證明是一個高度顯著的現(xiàn)象。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),EVA1A在人類腫瘤組織中顯著下調(diào),如肝癌癥、食管鱗癌、胃腺癌和胰腺腫瘤,表明它可能參與這些腫瘤的發(fā)生或發(fā)展。EVA1A的過度表達(dá)可通過誘導(dǎo)宮頸癌癥HeLa細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤SHG44、U87和U251細(xì)胞系的凋亡,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本研究的結(jié)果表明,EVA1A在Hp感染陽性的GC患者組織和細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)。值得注意的是,Hong Xie等研究報道EVA1A的過度表達(dá)通過上調(diào)TP53抑制肝細(xì)胞癌生長,這使得EVA1A可能成為肝細(xì)胞癌的潛在治療靶點(diǎn)。另一項研究表明,EVA1A是miR-125b的下游直接靶點(diǎn),MicroRNA-125b通過負(fù)調(diào)節(jié)EVA導(dǎo)的自噬來逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞癌中的奧沙利鉑耐藥性。然而,EVA1A在GC中表達(dá)和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究的數(shù)據(jù)表明,miR-125a-5p可以靶向抑制EVA1A的表達(dá),過表達(dá)EVA1A可以逆轉(zhuǎn)miR-125a-5p過表達(dá)對GC細(xì)胞遷移和侵襲的作用?？傊?這些數(shù)據(jù)闡明了miR-125a-5p/EVA1A軸抑制GC進(jìn)展的調(diào)節(jié)機(jī)制。

總之,本研究發(fā)現(xiàn)Hp可以通過調(diào)節(jié)miR-125a-5p/EVA1A軸影響GC的發(fā)生和發(fā)展。Hp-miR-125a-5p-EVA1A可能是一種新的信號級聯(lián),為闡明Hp的致癌機(jī)制提供了新的研究思路,也為探索miR-125a-5p在GC發(fā)生發(fā)展中的分子作用機(jī)制提供了實驗依據(jù)?？傊?本結(jié)果提示miR-125a-5p作為GC治療的診斷標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。