徐東婷，李美洲，余欣彤，黃森，林榮楷，段佳佳，張正

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

白茅根為禾本科植物白茅Imperata cylindricaBeauv.var.major(Nees) C.E.Hubb.的干燥根莖[1]，性寒、味甘，具有勞傷虛贏、補(bǔ)中益氣、除瘀血的功效，臨床常用于血閉寒熱、利小便等癥[2]。白茅根中化學(xué)成分主要為綠原酸、棕櫚酸等有機(jī)酸類成分[3-5]和多糖、葡萄糖、果糖和木糖等糖類成分[6]。現(xiàn)代藥理研究表明白茅根具有止血、利尿降壓、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血糖、調(diào)血脂等作用[7-11]。茅根炭收載于《中國(guó)藥典》2020 年版一部白茅根項(xiàng)下炮制品，白茅根經(jīng)炒制后在外觀性狀和功效方面均有明顯差異，但《中國(guó)藥典》2020 年版一部中對(duì)茅根炭飲片鑒別項(xiàng)下僅作了簡(jiǎn)單的外觀形狀描述，并沒(méi)有明確規(guī)定茅根炭的炮制終點(diǎn)，也沒(méi)有規(guī)定指標(biāo)成分的測(cè)定，易導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，療效難以保障，因此急需解決該飲片的炮制工藝主觀化、缺乏量化標(biāo)準(zhǔn)的問(wèn)題。

中藥炮制是一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過(guò)程。在炮制過(guò)程中，飲片外觀顏色和化學(xué)成分均會(huì)隨著炮制時(shí)間的不同而變化[12]。利用分光測(cè)色儀進(jìn)行色度值分析，將樣品顏色轉(zhuǎn)化為多參數(shù)（L*、a*、b*）進(jìn)行定量分析，使顏色的定性、定量描述更準(zhǔn)確[13]。隨著相關(guān)分析儀器的發(fā)展，色差分析技術(shù)已被應(yīng)用于紅芪、大黃、牛膝等中藥色度程度的判別[14-15]。中藥指紋圖譜是對(duì)中藥整體性化學(xué)成分表達(dá)和反映[16]。目前中藥指紋圖譜結(jié)合色度值測(cè)定已在中藥鑒別、質(zhì)量評(píng)價(jià)和炮制過(guò)程控制等方面應(yīng)用廣泛[17-18]?；诖?，本研究建立茅根炭炮制過(guò)程中的指紋圖譜，同時(shí)測(cè)定茅根炭飲片粉末的色度值，考察不同炒制時(shí)間茅根炭飲片指紋圖譜和色度值的動(dòng)態(tài)變化，為茅根炭炮制工藝的優(yōu)選提供參考。

1 材料

Waters H-Class 型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；XP26 型百萬(wàn)分之一天平、ME204E 型萬(wàn)分之一天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；Milli-Q Direct 型超純水系統(tǒng)（德國(guó)默克股份有限公司）；TS7600 型分光測(cè)色儀（深圳市三恩時(shí)科技有限公司）；ARB52B+型紅外測(cè)溫儀（東莞萬(wàn)創(chuàng)電子制品有限公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；111B 型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）。

10 批白茅根飲片產(chǎn)地見(jiàn)表1，經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為白茅Imperata cylindricaBeauv.var.major(Nees) C.E.Hubb.的干燥根，符合《中國(guó)藥典》2020 年版一部白茅根項(xiàng)下規(guī)定。新綠原酸（批號(hào)DSTDX001503，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.58%）、隱綠原酸（批號(hào)DST220104-035，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%）對(duì)照品均購(gòu)自德思特生物技術(shù)有限公司，綠原酸（批號(hào)110753-202119，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.3%）、咖啡酸（批號(hào)110885-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）、4-香豆酸（批號(hào)112037-202102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）、5-羥甲基糠醛（批號(hào)19060403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

表1 白茅根飲片產(chǎn)地信息Table 1 Origin information of Imperatae Rhizoma

2 方法與結(jié)果

2.1 茅根炭飲片樣品的制備

取白茅根段（編號(hào)B5），設(shè)置電陶爐加熱功率為1 000 W，鍋溫達(dá)到260～270 ℃，將其置熱鍋內(nèi)，從炮制0 min 起，每隔2 min 取樣1 次，放涼，即得不同炮制時(shí)間的茅根炭飲片，對(duì)應(yīng)的飲片編號(hào)依次為M1～M15。

2.2 UPLC 指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 Waters HSS T3 色譜柱（100 mm× 2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.2%醋酸（B），梯度洗脫（0～20 min，5%→8% A；20～50 min，8%→25% A；50～52 min，25%→100% A；52～54 min，100%→5% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm；體積流量：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取5-羥基甲基糠醛、新綠原酸、咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、4-香豆酸對(duì)照品適量，置于量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為12.55、38.98、21.14、39.91、21.36、51.74 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別取白茅根飲片、茅根炭飲片粉末（過(guò)二號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（300 W、40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用10%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液（編號(hào)M3），連續(xù)進(jìn)樣6 次，以7 號(hào)峰綠原酸為參照峰，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 值分別為0.29%～1.01%、1.55%～2.88%。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取供試品（編號(hào)M3）適量，平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以7號(hào)峰綠原酸為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 值分別為0.03%～0.06%、0.12%～2.71%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取供試品（編號(hào)M3）適量，制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，以7 號(hào)峰綠原酸為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 值分別為0.08%～0.15%、0.15%～2.95%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 UPLC 指紋圖譜的建立和色譜峰的指認(rèn) 取白茅根飲片（編號(hào)B1～B10）和不同炮制時(shí)間的茅根炭飲片（編號(hào)M1～M15），制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將色譜圖分別導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 年版）》，以編號(hào)B1、M1 樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，將時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 min，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行峰匹配，建立UPLC疊加指紋圖譜，見(jiàn)圖1、2。10 批白茅根飲片共標(biāo)定11 個(gè)共有峰，與對(duì)照品溶液色譜圖比對(duì)，共指認(rèn)5個(gè)色譜峰，分別為新綠原酸（4 號(hào)峰）、咖啡酸（6號(hào)峰）、綠原酸（7 號(hào)峰）、隱綠原酸（9 號(hào)峰）、4-香豆酸（10 號(hào)峰）。不同炮制時(shí)間的茅根炭飲片共標(biāo)定12 個(gè)共有峰，其中5-羥甲基糠醛（2 號(hào)峰）為經(jīng)炮制后被檢測(cè)到的，說(shuō)明其可能為茅根炭炒炭后的新增成分，可作為區(qū)分白茅根飲片與茅根炭飲片的關(guān)鍵指標(biāo)。當(dāng)茅根炭飲片炮制8 min 時(shí)，咖啡酸已無(wú)法檢出。

圖2 茅根炭飲片UPLC 疊加指紋圖譜Fig.2 Superimposed UPLC fingerprint of carbonized Imperatae Rhizoma

2.2.8 茅根炭制過(guò)程中圖譜動(dòng)態(tài)變化分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 年版）》對(duì)不同批次白茅根飲片（編號(hào)B1～B10）和不同炮制時(shí)間茅根炭飲片（編號(hào)M1～M15）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，以編號(hào)B1、M1 樣品圖譜為參照?qǐng)D譜，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1 min，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行色譜峰匹配，中位數(shù)法生成白茅根、茅根炭飲片的對(duì)照?qǐng)D譜，相似度結(jié)果見(jiàn)表2。10 批白茅根樣品的相似度均大于0.900，表明不同批次飲片中化學(xué)成分具有較好的一致性，批間差異較小。隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，茅根炭飲片與編號(hào)M1 樣品圖譜的相似度逐漸降低。當(dāng)炮制時(shí)間超過(guò)6 min，兩者相似度低于0.800，表明茅根炭經(jīng)炮制后化學(xué)成分發(fā)生了明顯變化。

表2 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Results of similarity evaluation

分別以各色譜峰單位峰面積為縱坐標(biāo)，以炮制時(shí)間為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表3。隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，峰1、5-HMF、峰11、4-香豆酸的單位峰面積呈先升后降，其余共有峰單位峰面積呈下降趨勢(shì)。

表3 單位峰面積隨炮制時(shí)間變化結(jié)果Table 3 Variation of unit peak area with processing time

2.3 茅根炭飲片粉末色度值測(cè)定

采用分光測(cè)色儀測(cè)量粉末顏色，選擇色彩空間CIE（L*、a*、b*），測(cè)量光源為D65，觀察角度10°，經(jīng)白板校正后，測(cè)得各樣品的L*、a*、b*；其中L*代表明亮度，L*越大，亮度越大；a*代表紅綠值，負(fù)值代表綠色，正值代表紅色；b*代表黃藍(lán)值，負(fù)值代表藍(lán)色，正值代表黃色[19]。每份樣品平行測(cè)定3 次，取平均值。以白茅根生品（B1）樣品粉末為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，以該粉末的L*、a*、b*為標(biāo)準(zhǔn)值，測(cè)定15 批炮制品樣品與標(biāo)準(zhǔn)值的色差值（ΔL*、Δa*、Δb*、ΔE*），見(jiàn)圖3，粉末色度值見(jiàn)表4。

圖3 不同炮制時(shí)間茅根炭的色彩圖像Fig.3 Color images of carbonized Imperatae Rhizoma at different processing times

表4 不同炮制時(shí)間對(duì)茅根炭飲片色度值的影響Table 4 Effects on different processing time on chromaticity values of carbonized Imperatae Rhizoma

在茅根炭炮制過(guò)程中，L*值從73.85 逐步下降到33.53，明度下降56.67%，呈逐漸降低趨勢(shì)，自炮制20 min（M10）后，L*下降較緩慢；a*值呈先升后降的趨勢(shì)，從B1 到M7 炮制品，a*值呈增加的趨勢(shì)，隨后在M8 到M15 炮制品，a*值呈降低趨勢(shì)；b*從24.92 逐步下降到16.59，黃藍(lán)值下降33.43%，呈降低趨勢(shì)。E*代表總色值，在炮制過(guò)程中，E*從78.00 下降到38.42，總色差值下降了50.75%，與明度值L*下降幅度較大有關(guān)，說(shuō)明樣品顏色由亮變暗。粉末總色差值△E*不斷升高，表明樣品的色差逐漸增大。當(dāng)△E*大于12.0 時(shí)，可明顯區(qū)別白茅根藥材生品與茅根炭炮制品[20]。

2.4 炮制過(guò)程中茅根炭顏色與成分動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析

2.4.1 相關(guān)性分析 利用SPSS 20.0 對(duì)峰面積與色度值L*、a*、b*、E*進(jìn)行相關(guān)分析（表5）。一般認(rèn)為，相關(guān)系數(shù)|r|≥0.8 時(shí)，高度相關(guān)；0.5≤|r|＜0.8時(shí)，中度相關(guān)；0.3≤|r|＜0.5 時(shí)，低度相關(guān)；|r|＜0.3時(shí)，基本不相關(guān)[21]。其中峰1、峰12 與L*、E*不相關(guān)；峰4、新綠原酸、峰6、綠原酸、隱綠原酸與a*不相關(guān)，與L*、b*、E*具有極顯著性（P＜0.01）；5-羥甲基糠醛、峰3、峰9 與色度值間具有極顯著性或顯著性（P＜0.05、0.01）；咖啡酸與色度值L*、a*、E*具有極顯著性（P＜0.01）；4-香豆酸峰面積的變化與色度值的變化無(wú)相關(guān)性，表明隨著炮制程度加深，茅根炭中大部分成分都發(fā)生了變化。

2.4.2 主成分分析 將不同炮制時(shí)間茅根炭飲片的單位色譜峰峰面積和色度值數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 20.0軟件進(jìn)行因子分析，結(jié)果見(jiàn)表6。以指紋值大于1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到前2 個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為88.870%，基本上可以用于表征茅根炭飲片色度值和指紋圖譜的大部分信息。第1 主成分主要反映峰3～峰6、綠原酸、峰9、隱綠原酸的信息；第2主成分主要反映峰1、4-香豆酸、峰12 的信息。

表6 指紋值和方差貢獻(xiàn)率Table 6 Characteristic value and variance contribution rate

2.4.3 聚類分析 采用SPSS 20.0 軟件對(duì)色譜峰單位峰面積和色度值進(jìn)行聚類分析，采用組間連接法，以歐式平方距離為測(cè)度，結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)歐式距離取5 時(shí)，15 批樣品可分為3 類，炮制時(shí)間2～6 min 聚為第1 類，炮制時(shí)間8～16 min 聚為第2類，炮制時(shí)間18～30 min 聚為第3 類。

圖5 不同炮制時(shí)間茅根炭樣品聚類分析Fig.5 Cluster analysis of carbonized Imperatae Rhizoma at different processing times

2.4.4 正交偏最小二乘法判別分析 為了進(jìn)一步區(qū)分不同炮制程度茅根炭樣品之間的差異，采用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行OPLS-DA 分析，得到OPLSDA 得分圖、變量重要性投影（VIP）值圖和Permutation 圖，以區(qū)分不同組間樣品的差異成分，為茅根炭炮制過(guò)程控制提供參考依據(jù)。建立的OPLS-DA 模型參數(shù)R2X＝0.946，R2Y＝0.899，Q2＝0.772，均大于0.500，證明建立的模型具有較好的數(shù)據(jù)解析能力和預(yù)測(cè)能力，能夠用于15 批樣品的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析[22-23]。為進(jìn)一步驗(yàn)證所建立模型的合理性，采用外部模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)，以驗(yàn)證模型的有限性[24]。設(shè)置檢驗(yàn)次數(shù)為200 次，得到的置換檢驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證圖如圖6。圖中的R2、Q2均高于左邊所有的點(diǎn)，且大于0.5，并且R2、Q2的回歸線斜率均大于1，證明所建立的模型合理有效，無(wú)過(guò)擬合現(xiàn)象。

圖6 置換檢驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證圖Fig.6 Permutation test

以上述模型為基礎(chǔ)，建立OPLS-DA 得分圖，結(jié)果見(jiàn)圖7?？梢钥闯觯?5 批樣品依然被分為3 類，結(jié)果與聚類分析一致，證明3 組樣品的差異明顯，分類結(jié)果科學(xué)可靠。VIP 圖見(jiàn)圖8。在95%的置信區(qū)間內(nèi)，一般選擇VIP 值＞1 作為篩選差異性成分的指標(biāo)，提取了8 個(gè)VIP（VIP 均大于1），分別是峰1（1.240 7）、a*（1.236 1）、b*（1.051 1）、峰3（1.048 3）、L*（1.039 9）、峰12（1.038 4）、E*（1.027 1）、5-羥甲基糠醛（1.005 6），推測(cè)上述成分為茅根炭炮制過(guò)程中的差異成分，具有區(qū)分茅根炭炮制終點(diǎn)的潛力。

圖7 不同炮制時(shí)間茅根炭飲片的OPLS-DA 得分散點(diǎn)圖Fig.7 Score scatter plot of OPLS-DA of carbonized Imperatae Rhizoma at different processing times

圖8 各色譜峰峰面積和色度值的VIP 得分圖Fig.8 VIP score plot for peak area and chromaticity value

3 討論

本研究基于色度值和色譜峰單位峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別采用各類分析方法對(duì)指紋圖譜與色度值的相關(guān)性結(jié)果進(jìn)行分析。通過(guò)相關(guān)分析可以看出各色譜峰單位峰面積與色度值的相關(guān)程度及其顯著程度，結(jié)果表明5-羥甲基糠醛、峰3、峰9 均與色度值間具有極顯著或顯著（P＜0.01、0.05）。結(jié)合主成分分析、聚類分析和OPLS-DA，不同炮制時(shí)間的茅根炭飲片可以區(qū)分開(kāi)來(lái)，同時(shí)進(jìn)一步補(bǔ)充說(shuō)明茅根炭飲片質(zhì)量的差異標(biāo)志物。上述相關(guān)分析方法在一定程度上相互印證、相互補(bǔ)充，較好地建立了茅根炭飲片外觀與內(nèi)在質(zhì)量的關(guān)系。

茅根炭在炮制過(guò)程中產(chǎn)生了5-羥甲基糠醛，是炮制后峰面積明顯增大的成分，可作為生品和炮制品的區(qū)分。5-羥甲基糠醛作為糖的脫水產(chǎn)物，廣泛存在于含糖類物質(zhì)的植物和食品中，炮制或加熱過(guò)程中，往往伴隨含量的變化[25]。文獻(xiàn)報(bào)道，茅根炭的止血作用主要通過(guò)縮短止血凝血時(shí)間、縮短血漿復(fù)鈣時(shí)間從而達(dá)到增強(qiáng)止血作用[26-27]。白茅根炒炭后，5-羥甲基糠醛雖有顯著增加，但目前尚無(wú)研究報(bào)道5-羥甲基糠醛與其止血作用具有一定聯(lián)系。但因5-羥甲基糠醛具有雙向藥理作用，既有抗氧、保肝、改善血液微循環(huán)等藥理作用[28]，又具有一定的遺傳毒性、生殖毒性和致癌性[29]，因此在炮制過(guò)程中不宜加熱過(guò)久，以免5-羥甲基糠醛毒性的積累。隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，酚酸類成分（新綠原酸、咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、4-香豆酸）的峰面積都出現(xiàn)了不同程度的下降，這與加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、成分出現(xiàn)降解有關(guān)。

白茅根中化學(xué)成分眾多，主要含有三萜類、糖類、內(nèi)酯類、有機(jī)酸和香豆素類等成分，但有效成分含量均較低，從指紋圖譜可看出，色譜峰峰型較高、響應(yīng)較好的均為酚酸類成分。雖然亦可采用紫外檢測(cè)器測(cè)定其多糖含量，但該方法測(cè)定結(jié)果專屬性較差、重復(fù)性一般。因此，白茅根、茅根炭中指標(biāo)成分的選擇上，可對(duì)酚酸類成分進(jìn)行優(yōu)先測(cè)定。酚酸類成分具有一定的不穩(wěn)定性，在一定程度上存在相互轉(zhuǎn)化[30]，故在對(duì)白茅根或茅根炭進(jìn)行定量分析時(shí)，不能僅僅測(cè)定某一個(gè)成分，應(yīng)以酚酸類成分的總量進(jìn)行對(duì)比研究為佳。茅根炭中的5-羥甲基糠醛作為生品和炮制品的區(qū)分，亦應(yīng)當(dāng)對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，嚴(yán)格控制5-羥甲基糠醛的含量，保證臨床用藥安全性和有效性。本研究在指紋圖譜建立過(guò)程中，分別對(duì)提取溶劑（10%甲醇、50%甲醇、甲醇、10%乙醇、50%乙醇、乙醇）、提取方式（回流、超聲）、提取時(shí)間（15、30、45min）進(jìn)行考察，并以色譜峰峰型、分離度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定了供試品溶液的制備方法。

顏色是中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的發(fā)展應(yīng)用，辨色論有豐富的理論，但主觀性強(qiáng)，缺乏客觀標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過(guò)測(cè)定粉末的色度值，量化樣品顏色的變化，將色度值與指紋圖譜相結(jié)合，考察茅根炭在炮制過(guò)程中顏色與成分動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析，其中5-羥甲基糠醛、峰3、峰9 峰面積與色度值間具有極顯著性或顯著性，主成分分析提取出2 個(gè)主成分，聚類分析聚為3 類，與OPLS-DA 的分析結(jié)果一致。因此本研究建立的茅根炭UPLC 指紋圖譜結(jié)合色度值、化學(xué)模式識(shí)別分析，將外觀顏色與內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行聯(lián)系，明確茅根炭的質(zhì)量差異指標(biāo)，可為茅根炭的在線炮制生產(chǎn)提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突