楊琳，張謙，李君*

1.呼倫貝爾市第四人民醫(yī)院 藥劑科，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021000

2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110

巴特日七味丸收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（蒙藥分冊(cè)），由草烏葉、訶子、翻白草、茜草、黑云香、人工麝香、銀珠7 味藥材組成[1]。方中草烏葉殺黏、止痛，為君藥；翻白草、黑云香止痛消腫，人工麝香開竅殺黏，共為臣藥；茜草清熱、止血、止瀉，為佐藥；訶子可調(diào)元、解毒，銀朱起清熱、收斂、療傷之效，共為使藥；諸藥配伍共奏清瘟解毒、消“黏”、止痛、散瘀、止痢之功，蒙醫(yī)臨床常用于瘟疫盛熱、白喉、腦炎、赤白痢疾等癥[1-2]。該方劑在臨床應(yīng)用多年，療效已經(jīng)得到了充分確證[3-5]。近年來，針對(duì)巴特日七味丸的研究多關(guān)注質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建[6]、不良反應(yīng)評(píng)價(jià)[7]、臨床療效觀察[3-5]，而對(duì)其化學(xué)組成的研究鮮有報(bào)道。傳統(tǒng)復(fù)方中所含成分是其發(fā)揮功效的基礎(chǔ)，對(duì)其全面、精準(zhǔn)的辨識(shí)表征不僅有利于進(jìn)一步的藥效物質(zhì)挖掘、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升、作用機(jī)制探究，更有助于推動(dòng)其現(xiàn)代化、國際化進(jìn)程。高分辨液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)因具備高效的分離能力、強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)解析能力，在傳統(tǒng)復(fù)方定性鑒別過程中具備明顯優(yōu)勢[8-9]。因此，本研究采用高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（HPLC-Q-Exactive-MS）技術(shù)對(duì)巴特日七味丸中成分進(jìn)行快速、全面的定性分析，旨在為巴特日七味丸血清移行成分表征、作用機(jī)制闡明提供參考。

1 儀器與試藥

AP135W 型十萬分之一電子天平（日本島津公司）；HPLC-Q-Exactive 型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)儀[美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；BSA224S 萬分之一天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；LC-MS 8045 型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司）；DS-7510DTH 型數(shù)控超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）。

巴特日七味丸（規(guī)格2 g/10 粒，批號(hào)2212226）購自內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司。木犀草素（批號(hào)PS010346，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%）、原兒茶酸（批號(hào)PU0918-0025，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%）、柯里拉京（批號(hào)PS0265-0020，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）、新烏頭堿（批號(hào)PS0489-0020，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）、苯甲酰新烏頭原堿（批號(hào)PS1132-0020，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.5%）、苯甲酰次烏頭原堿（批號(hào)PS1134-0020，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）對(duì)照品均購自購自成都普思生物科技有限公司；烏頭堿（批號(hào)110720-202007，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.5%）、蘆?。ㄅ?hào)100080-202012，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.5%）、苯甲酰烏頭原堿（批號(hào)111794-202006，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.5%）、次烏頭堿（批號(hào)110798-202010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.2%）對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸、乙酸銨均為分析純[美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取原兒茶酸5.62 mg、烏頭堿5.66 mg、新烏頭堿4.97 mg、次烏頭堿5.01 mg、蘆丁6.12 mg、苯甲酰烏頭原堿4.99 mg、苯甲酰次烏頭原堿4.64 mg、木犀草素5.87 mg、苯甲酰新烏頭原堿4.78 mg、柯里拉京6.22 mg，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲，加至刻度，制備單一對(duì)照品貯備液，質(zhì)量濃度為562.00、566.00、497.00、501.00、612.00、499.00、464.00、587.00、478.00、622.00 μg/mL。分別精密量取上述各貯備液20 μL 于同一10 mL 量瓶中，得質(zhì)量濃度562.00、566.00、497.00、501.00、612.00、499.00、464.00、587.00、478.00、622.00 ng/mL 的混合對(duì)照品溶液，于4 ℃保存。

2.2 供試品溶液的制備

取巴特日七味丸，研磨，過篩，精密稱取2.0 g，置50 mL 錐形瓶中，加90%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量、封口，超聲提取30 min（功率200 W，頻率60 kHz），冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，90%甲醇補(bǔ)重，搖勻，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過，即得，于4 ℃保存。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-Aq 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：A 5%（0.0～5.00 min）→15%（10.00 min）→28%（14.00 min）→40%（19.00 min）→60%（21.00 min）→78%（25.00 min）→95%（30.00～40.00 min），體積流量為0.35 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），檢測方式：Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS 分辨率：70 000，dd-MS2分辨率：17 500，掃描范圍：m/z110～1 200。噴霧電壓：3.80 kV（+）、3.20 kV（-），碰撞能量：30 eV，離子傳輸管溫度：300 ℃（+）、400 ℃（-），輔助氣體積流量：30 L/min，輔助氣溫度：350 ℃。

2.4 數(shù)據(jù)庫建立與分析

使用PubMed、中國知網(wǎng)、萬方、TCMSP 數(shù)據(jù)庫對(duì)巴特日七味丸全方及各味藥材所含成分的名稱、分子式、離子化模式、多級(jí)質(zhì)譜碎片進(jìn)行收集整理，利用Thermo Xcalibur 3.0 軟件對(duì)巴特日七味丸供試品溶液和混合對(duì)照品溶液在正、負(fù)離子模式下獲得的總離子流數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以自建數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，以一級(jí)質(zhì)譜偏差在1×10-5以內(nèi)為原則對(duì)巴特日七味丸中成分進(jìn)行辨識(shí)分析，以各成分保留時(shí)間、元素組成、多級(jí)質(zhì)譜碎片信息、與部分對(duì)照品比對(duì)做進(jìn)一步確認(rèn)，最終闡明各化學(xué)成分。

2.5 化學(xué)成分鑒定

取供試品溶液，進(jìn)樣分析，獲得巴特日七味丸供試品溶液正、負(fù)離子模式下的總離子流圖，見圖1。按照以上分析方法對(duì)供試品中所含化學(xué)成分進(jìn)行辨識(shí)分析，結(jié)果在巴特日七味丸中共鑒定出81 個(gè)化學(xué)成分，包括29 個(gè)生物堿類成分、16 個(gè)黃酮類成分、12 個(gè)有機(jī)酸類成分、9 個(gè)沒食子酸酯類成分、5 個(gè)倍半萜類成分、3 個(gè)鞣質(zhì)類成分、4 個(gè)脂肪酸類成分、3 個(gè)氨基酸類成分，其中10 個(gè)成分經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)得到進(jìn)一步確證，見表1。

表1 巴特日七味丸中化學(xué)成分的HPLC-Q-Exactive-MS 鑒定Table 1 Identification of chemical compositions in Bateri Qiwei Pills by HPLC-Q-Exactive-MS

圖1 正、負(fù)離子模式下巴特日七味丸的總離子流圖Fig.1 Positive and negative total ion chromatogram of Bateri Qiwei Pills

2.6 黃酮類成分鑒定

在巴特日七味丸中鑒定出16 個(gè)黃酮類化合物，分別為22、41、44、46、48、49、55、58、64、65、67、68、70、72、74、78 號(hào)化合物，過程以槲皮素（化合物64）為例說明。槲皮素在ESI-模式下可見[M-H]-m/z301.036 87 準(zhǔn)分子離子峰，保留時(shí)間22.90 min，Xcalibur 軟件擬合其分子式為C15H9O7，偏差為8.607，準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)（RDA）產(chǎn)生m/z178.998 63 [M-H-RDA]-碎片離子峰，進(jìn)一步脫去CO 后產(chǎn)生m/z151.003 33[M-H-RDA-CO]-，或直接脫去CO 產(chǎn)生m/z273.042 27 [M-H-CO]-，結(jié)合化合物的元素組成、裂解規(guī)律、碎片離子信息[12,18-19]，確認(rèn)64 號(hào)化合物為槲皮素，其MS2質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑見圖2。

圖2 槲皮素的MS2圖和可能的裂解途徑Fig.2 MS2 spectra and possible fragmentation pathway of quercetin

2.7 生物堿類成分鑒定

在巴特日七味丸中鑒定出29 個(gè)生物堿類化合物，分別為15～19、21、24、26、29～32、36、38、50、51、53、54、56、57、59～63、66 號(hào)化合物，鑒定過程以新烏頭原堿（化合物16）為例說明。新烏頭原堿ESI+模式下可見[M+H]+m/z486.268 49準(zhǔn)分子離子峰，保留時(shí)間為12.33 min，Xcalibur 軟件擬合其分子式為C24H40NO9，偏差為-2.608，準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)高能碰撞，可產(chǎn)生m/z454.241.42 [M+H-CH4O]-、436.231.75 [M+H-CH4O-H2O]-、404.206 21 [M+H-2CH4O-H2O]-碎片離子峰，結(jié)合這些化合物的元素組成、裂解規(guī)律、碎片離子信息[10,15-16]，確認(rèn)16 號(hào)化合物為新烏頭原堿，其MS2質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑見圖3。

圖3 新烏頭原堿的MS2圖和可能的裂解途徑Fig.3 MS2 spectra and possible fragmentation pathway of mesaconine

2.8 有機(jī)酸類成分鑒定

在巴特日七味丸中鑒定出12 個(gè)有機(jī)酸類化合物，分別為1、5、6、8～10、12～13、23、25、28、40 號(hào)化合物，過程以莽草酸（化合物6）為例進(jìn)行說明。莽草酸在ESI-模式下可見[M-H]-m/z173.045 43準(zhǔn)分子離子峰，保留時(shí)間為1.34 min，Xcalibur軟件擬合其分子式為C7H9O5，偏差為4.913，準(zhǔn)分子離子峰丟失CO2、H2O，可產(chǎn)生m/z155.034 58 [M-H-H2O]-、137.023 94 [M-H-2H2O]-、111.044 39 [M-H-CO2]-、93.033 67 [MH-2H2O-CO2]-碎片離子峰，結(jié)合化合物的元素組成、裂解規(guī)律、碎片離子信息[10-11]，確認(rèn)6號(hào)化合物為莽草酸，其MS2質(zhì)譜圖和可能裂解途徑見圖4。

圖4 莽草酸的MS2圖和可能的裂解途徑Fig.4 MS2 spectra and possible fragmentation pathway of shikimic acid

2.9 沒食子酸酯類成分鑒定

在巴特日七味丸中鑒定出9個(gè)沒食子酸酯類化合物，分別為11、14、20、27、34、35、37、39、42號(hào)化合物，鑒定過程以沒食子酰葡萄糖（化合物11）為例說明。沒食子酰葡萄糖在ESI-模式下可見[M-H]-m/z331.068 66準(zhǔn)分子離子峰，保留時(shí)間為3.37 min，Xcalibur軟件擬合其分子式為C13H15O10，偏差為8.116，準(zhǔn)分子離子峰脫去H2O后產(chǎn)生m/z313.057 92 [M-H-H2O]-，或脫去葡萄糖基產(chǎn)生m/z 169.013 93 [M-H-Glc]-碎片離子峰，其進(jìn)一步脫去CO2產(chǎn)生m/z125.023 76 [M-H-Glc-CO2]-，結(jié)合化合物的元素組成、裂解規(guī)律、碎片離子信息[11,16]，確認(rèn)11號(hào)化合物為沒食子酰葡萄糖，其MS2質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑見圖5。

圖5 沒食子酰葡萄糖的MS2圖和可能的裂解途徑Fig.5 MS2 spectra and possible fragmentation pathway of galloyl glucose

2.10 鞣質(zhì)類成分鑒定

在巴特日七味丸中鑒定出3個(gè)鞣質(zhì)類化合物，分別為7、33、52號(hào)化合物，鑒定過程以柯里拉京（化合物33）為例進(jìn)行說明。柯里拉京在ESI-模式下可見[M-H]-m/z633.076 97準(zhǔn)分子離子峰，保留時(shí)間為15.12 min，Xcalibur軟件擬合其分子式為C27H21O18，偏差為7.471，準(zhǔn)分子離子峰脫去沒食子酸基后產(chǎn)生m/z463.054 50 [M-H-galloyl]-碎片離子峰，同時(shí)產(chǎn)生m/z169.014 02 [galloyl-H]-碎片離子峰，m/z463.054 50 [M-H-galloyl]-進(jìn)一步脫去葡萄糖基，產(chǎn)生了m/z301.000 61 [M-H-galloyl-Glu]-，結(jié)合該化合物的元素組成、裂解規(guī)律、碎片離子信息以及對(duì)照品的比對(duì)[11-12]，確認(rèn)33號(hào)化合物為柯里拉京，其MS2質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑見圖6。

圖6 柯里拉京的MS2圖和可能的裂解途徑Fig.6 MS2 spectra and possible fragmentation pathway of corilagin

2.11 倍半萜類成分鑒定

在巴特日七味丸中鑒定出倍半萜類化合物5個(gè)，分別為69、71、73、75、76號(hào)化合物，鑒定過程以去氫木香內(nèi)酯（化合物75）為例進(jìn)行說明。去氫木香內(nèi)酯在ESI+模式下可見[M+H]+m/z231.136 93準(zhǔn)分子離子峰，保留時(shí)間為29.12 min，Xcalibur軟件擬合其分子式為C15H19O2，偏差為-4.311，準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)高能碰撞連續(xù)丟失H2O、CO可產(chǎn)生m/z213.126 34 [M+H-H2O]-、195.116 06 [M+H-2H2O]-、185.131 85 [M+H-H2O-CO]-碎片離子峰，結(jié)合化合物的元素組成、裂解規(guī)律、碎片離子信息和對(duì)照品比對(duì)[20-21]，確認(rèn)75號(hào)化合物為去氫木香內(nèi)酯，其MS2質(zhì)譜圖及可能裂解途徑見圖7。

圖7 去氫木香內(nèi)酯的MS2圖和可能的裂解途徑Fig.7 MS2 spectra and possible fragmentation pathway of dehydrocostuslactone

2.12 氨基酸、脂肪酸類成分鑒定

在巴特日七味丸中鑒定出3個(gè)氨基酸類化合物，分別為2、3、4號(hào)化合物，鑒定過程以L-脯氨酸（化合物4）為例說明。L-脯氨酸ESI+模式下可見[M+H]+m/z116.070 43準(zhǔn)分子離子峰，保留時(shí)間為1.20 min，Xcalibur軟件擬合其分子式為C5H10NO2，偏差為-1.509，準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)高能碰撞丟失H2O、CO可產(chǎn)生m/z98.984 34 [M+HH2O]-、70.065 58 [M+H-H2O-CO]-碎片離子峰，結(jié)合化合物的元素組成、裂解規(guī)律、碎片離子信息[10]，確認(rèn)4號(hào)化合物為L-脯氨酸，其MS2質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑見圖8。

圖8 L-脯氨酸的MS2圖和可能的裂解途徑Fig.8 MS2 spectra and possible fragmentation pathway of L-proline

在巴特日七味丸中鑒定出4個(gè)脂肪酸類化合物，分別為77、79～81號(hào)化合物，鑒定過程以亞油酸（化合物79）為例進(jìn)行說明。亞油酸在ESI-模式下可見[M-H]-m/z279.234.53準(zhǔn)分子離子峰，保留時(shí)間為36.56 min，Xcalibur軟件擬合其分子式為C18H31O2，偏差為7.574，準(zhǔn)分子離子峰丟失H2O后產(chǎn)生m/z261.222 02 [M+H-H2O]-碎片離子峰，結(jié)合化合物元素組成、裂解規(guī)律、碎片離子信息[11-13]，確認(rèn)79號(hào)化合物為亞油酸，其MS2質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑見圖9。

圖9 亞油酸的MS2圖和可能的裂解途徑Fig.9 MS2 spectra and possible fragmentation pathway of linoleic acid

3 討論

傳統(tǒng)復(fù)方作為一個(gè)多成分共存的復(fù)雜體系，所含各成分理化性質(zhì)差異較大，在不同流動(dòng)相條件下色譜反應(yīng)不盡相同，因此對(duì)不同流動(dòng)相（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-5 mmol/L醋酸銨水溶液、甲醇-5 mmol/L醋酸銨水溶液）進(jìn)行考察，結(jié)果在甲醇-0.1%甲酸水溶液流動(dòng)相下色譜峰數(shù)量較多，各成分質(zhì)譜響應(yīng)信息更豐富；同時(shí)，因生物堿類化合物中的氮原子電負(fù)性優(yōu)于碳原子，使其更易捕獲1 個(gè)質(zhì)子，使其在正離子電離模式下的質(zhì)譜響應(yīng)較好，而鞣質(zhì)類、黃酮類、沒食子酸酯類成分在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)相對(duì)更優(yōu)，因此本研究采用正、負(fù)兩種離子模式對(duì)巴特日七味丸樣品進(jìn)行了測定分析。

對(duì)樣品處理方式、處理時(shí)間考察發(fā)現(xiàn)，加熱回流處理和超聲處理對(duì)色譜峰數(shù)量、質(zhì)譜響應(yīng)無明顯影響，基于人力、時(shí)間成本考慮，研究采用了超聲方式對(duì)樣品進(jìn)行處理，同時(shí)延長超聲時(shí)間并未使色譜峰數(shù)量增加、質(zhì)譜響應(yīng)提高，因此，研究確定樣品最優(yōu)處理?xiàng)l件為超聲處理30 min。

綜上所述，本研究采用HPLC-Q-Exactive-MS技術(shù)對(duì)蒙藥巴特日七味丸進(jìn)行了定性研究，共鑒別獲得81 個(gè)化學(xué)成分，包括29 個(gè)生物堿類成分、16個(gè)黃酮類成分、12 個(gè)有機(jī)酸類成分、9 個(gè)沒食子酸酯類成分、5 個(gè)倍半萜類成分、3 個(gè)鞣質(zhì)類成分、4個(gè)脂肪酸類成分、3 個(gè)氨基酸類成分，該研究可為巴特日七味丸物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供有力的數(shù)據(jù)支撐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突