宋維維，袁冬蘭，朱丹丹，吳玉婷

南京醫(yī)科大學附屬泰州人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300

人乳頭瘤病毒（HPV）是一種無包膜的二十面體雙鏈DNA 病毒，在大多數(shù)情況下，感染HPV 的女性常無明顯臨床表現(xiàn)，同時在相對較短的時間（6～12 個月）內(nèi)可以通過免疫系統(tǒng)將病毒清除。但持續(xù)高危型HPV 感染與宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有研究表明在宮頸癌患者中HPV 陽性率超過80%[1-2]。早期篩查并積極治療HPV 感染對宮頸癌防治意義重大，但目前尚無針對HPV 感染的有效特異性藥物。

宮頸HPV 感染可歸入中醫(yī)“帶下病”“赤白帶”等范疇，大多醫(yī)家認為本病的致病因素與濕邪、熱邪、毒邪有關(guān)[3]。中藥二妙散記載于《丹溪心法》中，常用于治療濕熱下注之帶下病，方中黃柏苦寒燥濕，善清下焦?jié)駸?；蒼術(shù)苦溫燥濕，兼有健脾之功，兩者配伍使用寒溫協(xié)調(diào)，共奏清熱燥濕之效[4]。本研究擬通過網(wǎng)絡藥理學的方法和分子對接的技術(shù)對二妙散治療宮頸HPV 感染的有效成分、靶點及機制進行預測，為后續(xù)臨床和實驗研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 資料和方法

1.1 二妙散有效成分及作用靶點篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺[5-6]檢索二妙散中藥物“黃柏”“蒼術(shù)”全部化學成分?；诳诜锢枚龋∣B）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 篩選藥物的有效成分，獲取TCMSP 中有效成分對應的作用靶點。利用UniProt 數(shù)據(jù)庫[7]將得到的蛋白作用靶點轉(zhuǎn)換成對應的人類基因名。

1.2 宮頸HPV 感染相關(guān)靶點獲取

以“cervical HPV infection”“cervical human papilloma-virus infection”“cervical human papilloma virus infection”為關(guān)鍵詞在GeneCards[8]、OMIM 數(shù)據(jù)庫中進行檢索，以“score＞5”為標準，對靶點進行篩選并去除重復項，得到宮頸HPV 感染相關(guān)疾病靶點。

1.3 二妙散治療宮頸HPV 感染作用靶點預測及藥物-成分-疾病靶點網(wǎng)絡構(gòu)建

利用R 4.2.1 軟件獲取二妙散中藥物有效成分作用靶點與疾病相關(guān)靶點的交集，作為二妙散治療宮頸HPV 感染的潛在作用靶點，并用ggplot2 包和Venn Diagram 包對結(jié)果進行可視化，得到“藥物靶點-疾病靶點”韋恩圖。利用Cytoscape 3.8.2 軟件進一步分析“藥物-成分-疾病靶點”間的關(guān)系，并繪制網(wǎng)絡圖。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構(gòu)建和分析

將二妙散治療宮頸HPV 感染的潛在作用靶點輸入 STRING 數(shù)據(jù)庫[9]，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，置信度設(shè)置為≥0.4，并去除游離節(jié)點，其他設(shè)置為默認值，生成PPI 網(wǎng)絡，結(jié)果導出為“tsv”格式。利用Cytoscape 軟件v3.8.2 對從STRING 數(shù)據(jù)庫獲得的結(jié)果進行進一步分析，利用Centiscape 2.2 插件分析PPI 的拓撲參數(shù)，根據(jù)計算結(jié)果以度（degree）≥49.35 為條件篩選PPI 中發(fā)揮重要作用的蛋白，再以 degree ≥74.03、中介中心性（betweenness）≥59.98 和接近中心性（closeness）≥0.06 為條件，選取核心靶點。

1.5 基因本體功能（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集

將二妙散治療宮頸HPV 感染的潛在作用靶點導入DAVID 數(shù)據(jù)庫[10]中，選擇物種為“ Homo sapiens”，對GO 和KEGG 通路進行富集分析。以P＜0.05 為標準篩選生物學過程（BP）、細胞組成（CC）、分子功能（MF）的分析結(jié)果，各選取P值最小的10 條結(jié)果導入微生信平臺將結(jié)果進行可視化。以P＜0.05，基因數(shù)≥15 為標準，選取KEGG通路結(jié)果，并剔除與宮頸HPV 感染無關(guān)通路，選擇P值較小的前16 條通路利用微生信平臺將結(jié)果以條形圖的形式展示。

1.6 分子對接

從RCSB 數(shù)據(jù)庫[11]獲得核心靶點蛋白結(jié)構(gòu)，在Pymol 軟件中對其進行去除溶劑分子和配體處理。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫及PubChem 數(shù)據(jù)庫[12]下載核心靶點對應有效成分二維結(jié)構(gòu)的SDF 格式文件，使用Chem3D 軟件將其轉(zhuǎn)換為三維mol2 格式文件。然后使用AutoDock Tools 1.5.7 軟件對靶點蛋白進行添加氫、計算電荷及分配原子類型處理，對有效成分進行加氫、計算電荷、確定扭轉(zhuǎn)中心、選擇可扭轉(zhuǎn)的鍵及分配原子類型等處理。隨后利用AutoDock 進行分子對接，計算結(jié)合能。最后使用Pymol 軟件對結(jié)合較穩(wěn)定的5 對受體與配體進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 二妙散有效成分及作用靶點篩選

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選出蒼術(shù)4 個活性成分，黃柏24 個活性成分，見表1。獲得蒼術(shù)有效成分對應靶點59 個，黃柏對應靶點509 個，經(jīng)去重處理后，共獲得藥物作用靶點221 個。

表1 二妙散有效成分Table 1 Active ingredients of Ermiao Powder

2.2 宮頸HPV 感染相關(guān)靶點獲取

通過OMIM、GeneCard 疾病基因數(shù)據(jù)庫檢索，分別得到165、2 039 個宮頸HPV 感染相關(guān)靶點，去除重復項后共得到2 178 個疾病靶點。

2.3 二妙散治療宮頸HPV 感染作用靶點預測及構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡

利用R 4.2.1 軟件將二妙散中藥物有效成分作用靶點與疾病相關(guān)靶點取交集，共得到潛在作用靶點110 個，如圖1。使用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡圖，見圖2。網(wǎng)絡圖共有143 個節(jié)點，273 條邊，根據(jù)圖2 分析得到，二妙散中較重要的有效成分有槲皮素、漢黃芩素、吳茱萸次堿、β-谷甾醇、巴馬汀等。與有效成分關(guān)聯(lián)較多的潛在作用靶點有雄激素受體（AR）、雌激素受體α（ESR1）、一氧化氮合酶2（NOS2）、磷酸化糖皮質(zhì)激素受體（PGR）、cAMP 依賴性蛋白激酶α 催化亞基（PRKACA）、環(huán)加氧酶1（PTGS1）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、視黃酸受體α（RXRA）、一氧化氮合酶3（NOS3）、DNA 拓撲異構(gòu)酶2（TOP2A）、磷酯酰肌醇-3 激酶催化亞基γ（PIK3CG）等。

圖1 藥物-疾病靶點韋恩圖Fig.1 Drug -disease target Venn diagram

圖2 “藥物-成分-疾病靶點”網(wǎng)絡圖Fig.2 Network diagram of “drug -ingredient -disease target”

2.4 PPI 的構(gòu)建和分析

將藥物治療宮頸HPV 感染的潛在作用靶點輸入STRING 12.0 數(shù)據(jù)庫，物種選擇為人類，調(diào)整中等置信度為0.4，去除游離節(jié)點后構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡。該網(wǎng)絡包含110 個節(jié)點，2 714 條邊，平均 degree 值為49.3，通過Export 導出分析結(jié)果。將結(jié)果導入Cytoscape 3.8.2 中，生成PPI 網(wǎng)絡圖，利用Centiscape 2.2 插件分析該PPI 網(wǎng)絡，得到網(wǎng)絡 degree、betweenness、closeness 的中位值分別為49.35、59.98、0.006。首先以degree≥49.35 篩選得到60 個候選靶點，再以degree≥74.03、betweenness≥59.98和closeness≥0.06 為條件，篩選出20 個核心靶點，見圖3。根據(jù)degree 值選取最核心靶點5 個，包括蛋白激酶B1（Akt1）、腫瘤蛋白p53（TP53）、ESR1、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）。

圖3 PPI 拓撲分析Fig.3 PPI topology analysis

2.5 GO 富集分析

將藥物潛在作用靶點輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 富集分析，以P＜0.05 為條件進行篩選，獲得BP 567 個條目，CC 56 個條目，MF 116 個條目，將BP、CC、MF 結(jié)果按P值大小升序排列，選取前10條，導入微生信平臺進行可視化，見圖4。結(jié)果顯示，藥物作用靶點與細胞增殖的正向調(diào)節(jié)、細胞凋亡過程的負調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、RNA 聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等BP 有關(guān)；與細胞外空間、核、細胞質(zhì)、核質(zhì)等CC 相關(guān)；與MF 有關(guān)的是酶結(jié)合、蛋白激酶活性、蛋白激酶結(jié)合、細胞因子活性等。

圖4 GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

2.6 KEGG 富集分析

為了揭示二妙散治療宮頸HPV 感染的潛在機制，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對潛在作用靶點進行KEGG富集分析，以P＜0.05，基因數(shù)≥15 為條件篩選，獲得71 條通路，排除與宮頸HPV 感染無關(guān)的通路，如前列腺癌、恰加斯病、膽囊癌、麻疹、胰腺癌等，選擇P值較小的前16 條通路進行可視化，包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信號通路、白細胞介素-17（IL-17）信號通路、細胞衰老、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路等，見圖5。其中細胞凋亡通路中含最核心靶點Akt1、TP53、JUN、CASP3（圖6）。

圖5 KEGG 富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

圖6 細胞凋亡通路圖Fig.6 Diagram of apoptosis pathway

2.7 分子對接

基于有效成分與潛在作用靶點的對應關(guān)系，將核心靶點蛋白與藥物活性成分進行分子對接，結(jié)合能越低提示受體與配體結(jié)合性越好，分子對接結(jié)果見表2。結(jié)果提示ESR1-黃連堿、ESR1-小檗堿、ESR1-巴馬汀、ESR1-去氫丹參酮IIA、TP53-槲皮素具有較穩(wěn)定的結(jié)合能力，使用Pymol 軟件對其進行可視化，見圖7。

圖7 分子對接Fig.7 Molecular docking

表2 核心靶點與藥物活性成分分子對接結(jié)果Table 2 Results of molecular docking between the core target and the active ingredient

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法和分子對接的技術(shù)預測中藥二妙散治療宮頸HPV 感染的有效成分、靶點及機制。通過數(shù)據(jù)庫檢索篩選獲得二妙散有28 個有效成分、221 個作用靶點，有效成分包括槲皮素、漢黃芩素、β-谷甾醇、黃連素、巴馬汀、黃連堿、脫氫丹參酮IIA等。槲皮素是一種具有多種生物活性的類黃酮，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、清除自由基和免疫調(diào)節(jié)的作用[13]。Yuan 等[14]報道槲皮素可通過抑制HPV 病毒中GST-E6 蛋白和半胱天冬酶8 的結(jié)合，達到促進細胞凋亡的目的。小檗堿是中藥黃柏中的有效成分，具有抗氧化、抗炎、降糖和抗菌等多種生物活性，其能夠抑制乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌等腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移，誘導細胞凋亡[15]。有實驗研究表明，小檗堿可上調(diào)宮頸癌HeLa 細胞中p53 表達，抑制HPV18 中E6/E7癌蛋白的表達，促進宮頸癌細胞凋亡。β-谷甾醇的結(jié)構(gòu)與膽固醇相似，它可以抑制膽固醇的合成，同時具有顯著的抗腫瘤作用[16]。有文獻報道，β-谷甾醇處理Caski 和HeLa 細胞后，可抑制細胞中DNA合成，減弱HPV E6 病毒癌基因的表達并增加p53表達，發(fā)揮抗腫瘤及抗病毒活性[17]。

通過PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建分析，結(jié)果顯示二妙散治療HPV 感染的核心靶點為Akt1、TP53、ESR1、JUN、CASP3。TP53 是一種抑癌基因，其編碼的蛋白質(zhì)可誘導細胞周期停滯、促進細胞凋亡衰老和DNA 修復等。目前研究已證明，高危型HPV E6 蛋白與p53結(jié)合后通過泛素化途徑將p53 降解，促進宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展，而低危型HPV E6 蛋白盡管可以結(jié)合p53，但不能通過泛素化降解p53。此外，E6 還可以通過直接與p53 的C 端結(jié)合或與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子p300/CBP 結(jié)合改變p53 的轉(zhuǎn)錄活性[18]。實驗表明，TP53 是miR-92a-1-5p 下游靶基因，下調(diào)miR-92a-1-5p 表達，增加TP53 的表達，可抑制宮頸癌HeLa細胞增殖，阻斷細胞周期，促進細胞凋亡，抑制遷移[19]。Akt1是一種已知的癌基因，在PI3K/Akt 信號通路中的發(fā)揮重要作用。在缺氧條件下，HPV 陽性宮頸癌細胞通過激活PI3K/mTORC2/Akt 通路抑制E6/E7 癌基因表達，引起腫瘤耐藥、免疫逃避和復氧后腫瘤復發(fā)[20]。僅僅存在HPV 感染不足以引起宮頸癌，HPV 病毒需要某些輔助因子的協(xié)助作用才能引起宮頸病變。長期以來，雌二醇一直被認為是宮頸癌發(fā)生的輔助因素，它與雌激素受體結(jié)合后形成激素受體復合物，復合物可轉(zhuǎn)移到細胞核進一步與目標基因啟動子上的雌激素反應元件（EREs）相互作用，激發(fā)下游基因的激活和表觀遺傳修飾，調(diào)控腫瘤細胞的存活和增殖，促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[21]。

KEGG 分析顯示藥物作用靶點涉及通路包括PI3K/Akt 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路、P53 信號通路等。在HPV 感染的宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中IL-17 起到免疫抑制作用，對于持續(xù)的病毒感染阻斷IL-17 可促進抗病毒免疫并阻止癌癥的發(fā)展[20]。有研究表明，IL-17 通過激活JAK2/STAT3和PI3K/Akt/NF-κB 信號通路促進宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，在宮頸癌發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[22]。也有研究報道，IL-17A 可通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2 和MMP9 表達，下調(diào)金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP）-2 和TIMP-38 表達，促進宮頸癌細胞的遷移和侵襲[23]。有研究報道，在宮頸癌患者腫瘤組織中E6 和E7 表達急劇上調(diào)，TNF-α 表達下降，E6 和E7 的表達與TNF-α 呈強負相關(guān)[24]。有研究提示，TNF-α 啟動子區(qū)域的多態(tài)性與宮頸癌的遺傳易感性相關(guān)，rs361525 A 基因型是宮頸鱗狀細胞癌的危險因素，rs361525 基因型在宮頸癌I 期和II 期之間有差異[25]。

本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法和分子對接技術(shù)預測了中藥二妙散治療宮頸HPV 感染的有效成分、靶點及機制，結(jié)果提示二妙散具有多種活性成分，通過多靶點、多途徑干預宮頸HPV 感染，發(fā)揮治療作用，為后續(xù)臨床和實驗研究提供數(shù)據(jù)參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突