吳博，楊帆，曹福麟，李柳柳，黃建萍，韓會利，顏永剛*

1.陜西關(guān)愛制藥有限公司，陜西 咸陽 712046

2.西安市碑林區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710000

3.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心/“秦藥”研發(fā)重點實驗室，陜西 咸陽 712046

瘙癢癥是目前臨床上較常見的一種無原發(fā)性皮損的疾病，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，皮膚的主要表現(xiàn)是出現(xiàn)嚴(yán)重的瘙癢感，因此患者會長期反復(fù)搔抓致使皮膚出現(xiàn)紅腫、破損，嚴(yán)重者則會導(dǎo)致潰爛感染[1]。在長期感受瘙癢感后，患者會產(chǎn)生煩躁、焦慮等負(fù)性情緒，對患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[2]。瘙癢癥發(fā)病機(jī)制可能與皮膚較為干燥有關(guān)，生活習(xí)慣、精神狀態(tài)以及居住環(huán)境等因素也與發(fā)病有著一定的關(guān)聯(lián)性[3]。臨床治療瘙癢癥目前主要是著眼于對引發(fā)瘙癢疾病因素的治療和對皮膚的干預(yù)，瘙癢的局部治療藥物包括糖皮質(zhì)激素、局麻藥、抗組胺藥物等，但均存在一定的潛在不良反應(yīng)，同時部分患者在使用過程中存在藥物禁忌[4]。膽汁淤積性瘙癢等不依賴組胺介導(dǎo)的瘙癢癥不能被臨床傳統(tǒng)的藥物緩解或治愈[5]。中藥肝腎毒性較低且經(jīng)皮吸收能夠避免肝臟首過效應(yīng)及胃腸道刺激，同時可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、改善體質(zhì)，療效較高且不良反應(yīng)較低，是臨床上重要的給藥方式[6]。中藥洗劑被認(rèn)為是治療皮膚瘙癢癥的新思路、新方法、新方向。

膚疾洗劑由苦參、百部、花椒、白鮮皮、硼砂、雄黃6 味中藥組方，具有解毒殺蟲、止癢收斂、活血祛瘀的功效，其中苦參清熱燥濕、殺蟲止癢；百部殺蟲滅虱；白鮮皮清熱燥濕、祛風(fēng)解毒；花椒殺蟲止癢；雄黃解毒殺蟲。硼砂清熱解毒、解毒防腐，但由于硼砂屬于礦物藥，在系統(tǒng)里沒有靶點，故后續(xù)內(nèi)容不再涉及。中醫(yī)理論將皮膚瘙癢癥分為風(fēng)癢、濕癢和熱癢、蟲毒致癢等分型，膚疾洗劑組方符合皮膚瘙癢證病機(jī)，能夠抑制局部皮膚致病菌群定殖，但其作用的分子機(jī)制目前尚未清晰。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠揭示中藥復(fù)方多成分、多靶點、多途徑作用的機(jī)制，有助于豐富中藥復(fù)方膚疾洗劑的科學(xué)內(nèi)涵[7]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對接技術(shù)，以膚疾洗劑經(jīng)皮吸收多成分多靶點為切入點，揭示膚疾洗劑治療皮膚瘙癢癥的作用靶點和通路，為其進(jìn)一步深入研究與臨床應(yīng)用提供參考和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 膚疾洗劑的活性成分及靶點收集

利用中醫(yī)系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）進(jìn)行查詢?；诮?jīng)皮給藥系統(tǒng)藥物的特點，一般認(rèn)為經(jīng)皮吸收活性成分屬性值的篩選條件以類藥性（DL）≥0.18、AlgP＞5、相對分子質(zhì)量≤500 為臨界值[8-10]。以膚疾洗劑組方能夠抑制皮膚致病菌群定殖為特點，篩選苦參、百部、花椒、白鮮皮4 味中藥的活性成分，將篩選出的成分導(dǎo)入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://swisstarget prediction.ch/），以possibility＞0 為篩選條件，獲得藥物相關(guān)靶點，以 BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）獲取雄黃作用靶點。

1.2 疾病靶點及交集靶點的獲取

在GeneCards（https://www.genecards.org）中，以“pruritus”和“itching”為檢索詞，收集相關(guān)性值大于平均值的靶點作為疾病靶點。在Venny 2.1.0制圖平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制瘙癢癥與膚疾洗劑的交集靶點。

1.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了進(jìn)一步更好理解中藥、成分與其相應(yīng)靶點之間的相互作用關(guān)系，選擇degree 值高的靶點導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.1 軟件，模式設(shè)置為“多種蛋白”，物種限定為“Homo sapiens”。構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行可視化分析。

1.4 基因本體（GO）功能及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將交集靶點的official gene symbol 輸入DAVID數(shù)據(jù)庫（https://DAVID.ncifcrf.gov/），Select Identifier選擇“official gene symbol”，物種選擇“homo sapiens”，對作用靶點進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，使用微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO 和KEGG 富集分析氣泡圖。

1.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

為了進(jìn)一步更好理解中藥、成分與其相應(yīng)靶點之間的相互作用關(guān)系，根據(jù)富集的KEGG 通路及作用靶點，構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。選擇degree值高的成分作為主要活性成分，將活性成分、靶點、通路經(jīng)Excel 處理后，導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行可視化分析。

1.6 分子對接

選擇核心活性成分和核心靶點進(jìn)行分子對接驗證利用RCSB PDB（https://www.RCSB PDBus.org/），PubChem 數(shù)據(jù)庫及Autodocktool 1.5.6 軟件獲取分子對接所需相關(guān)文件格式。借助Autodocking vina1.2.0 分子對接。選取結(jié)合自由能小的構(gòu)象用Pymol 進(jìn)行可視化及結(jié)果分析。選擇degree＞2 的化合物進(jìn)行對接。

2 結(jié)果

2.1 膚疾洗劑活性成分、靶點篩選

篩選到61 個化合物（表1），藥物靶點1 049個，檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫得到疾病靶點1 621 個。經(jīng)過用Venn 2.1.0 得到213 個膚疾洗劑與瘙癢癥的交集靶點（圖1），這213 個交集靶點為膚疾洗劑治療瘙癢癥的潛在靶點。

圖1 膚疾洗劑與瘙癢癥靶點Venn 圖Fig.1 Venn diagram of Fuji Fuji lotion and pruritus target

表1 膚疾洗劑藥效成分Table 1 Pharmacodynamic components of Fuji lotion

2.2 膚疾洗劑-瘙癢癥靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)膚疾洗劑-瘙癢癥共有的靶標(biāo)逆向篩選中藥復(fù)方活性成分，刪除重復(fù)項共獲得活性成分149 個，將213 個膚疾洗劑與瘙癢癥交集靶點輸入STRING 平臺，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2），共獲得146個節(jié)點和1 722 條節(jié)點之間的連線。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network diagram

2.3 GO 功能和KEGG 通路富集分析

利用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫的Functional Annotation功能對上述核心靶點進(jìn)行了GO 富集分析，得到生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組成（CC）共801 條GO 條目（P＜0.01）。其中BP 相關(guān)條目603 條，包括炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、胞漿鈣離子濃度的正調(diào)控（positive regulation of cytosolic calcium ion concentration）。MF 相關(guān)條目122 條，包括蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）等。CC 相關(guān)條目 76 條，包括質(zhì)膜（plasma membrane）、質(zhì)膜的組成部分（integral component of plasma membrane）等。根據(jù)lgP值升序排列選取前30 條繪制圖3。

圖3 GO 功能和KEGG 通路富集分析氣泡圖Fig.3 GO function and KEGG pathway enrichment analysis Bubble pattern

利用KOBAS 3.0 在線工具對通路富集分析中得到146 條信號通路（P＜0.01），選取前30 條繪制，見圖3，包括癌癥通路、腫瘤壞死因子（TNF）、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）等信號通路。

2.4 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)

通過Cytoscape 3.7.2 可視化“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)（圖4），包含97 個節(jié)點和234 個連接。橢圓節(jié)點表示靶點，菱形節(jié)點表示活性成分，菱形節(jié)點表示通路，灰色線表示節(jié)點間相互作用。

圖4 成分-靶點通路圖Fig.4 Component target pathway diagram

2.5 分子對接

對接分?jǐn)?shù)值小于-4.25 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）表示兩者間有一定的結(jié)合活性，小于-5.0 kcal/mol表示有較好的結(jié)合活性，小于-7.0 kcal/mol 表示有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[11]。分子對接結(jié)果顯示，原百部堿、黃柏內(nèi)酯、大豆素、百部生物堿、異原百部堿等化學(xué)成分與表皮生長因子受體（EGFR）、CXC 趨化因子配體8（CXCL8）、Toll 樣受體4（TLR4）等靶點對接結(jié)合能均＜-7.0 kcal/mol，說明蛋白與分子之間能穩(wěn)定的結(jié)合。異原百部堿與CXCL8 在ARG-26、GLN-8 處形成氫鍵，黃柏內(nèi)酯與CXCL8 在ARG-26、LYS-42、TYR-13 處形成氫鍵。原百部堿與CXCL8 在LEU-51、ARG-26 處形成氫鍵。大豆素與EGFR 在ARG-269 處形成氫鍵，異原百部堿與EGFR 在ARG-161、ARG-62、CYS-145、TYR-144 處形成氫鍵。黃柏內(nèi)酯與EGFR 在HIS-235 處形成氫鍵。原百部堿與EGFR 在TYR-261、ASN-316、TYR-309 處形成氫鍵。大豆素與TLR4 在GLN-578、AGR-606 處形成氫鍵。大豆素與TLR4 在GLN-578、AGR-606 處形成氫鍵。百部生物堿與TLR4 在MET-618 處形成氫鍵，見圖5。將對接的數(shù)據(jù)采用熱圖進(jìn)行分析，見圖6，結(jié)合能的絕對值越大，結(jié)合作用越強(qiáng)。

圖5 活性成分-關(guān)鍵靶點分子對接圖Fig.5 Active ingredient -key target macromolecular docking diagram

圖6 膚疾洗劑活性成分與靶點相互作用的分子對接分?jǐn)?shù)熱圖Fig.6 Molecular docking fraction heat map of interaction between Fuji lotion active ingredients and target

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為瘙癢癥的主要發(fā)病機(jī)制與濕熱內(nèi)蘊(yùn)、蟲毒所致有關(guān)，膚疾洗劑具有解毒殺蟲、止癢收斂、活血祛瘀功效。本研究篩選得到該方具有潛在生物活性的61 個化合物，并對213 個潛在靶點進(jìn)行功能富集分析，揭示這些靶點與炎癥和免疫相關(guān)的生物學(xué)過程密切相關(guān)。進(jìn)一步構(gòu)建了分子基因網(wǎng)絡(luò)、拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)、通路與基因網(wǎng)絡(luò)，分析結(jié)果提示膚疾洗劑通過多成分、多途徑協(xié)同作用，以免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用共同實現(xiàn)對瘙癢癥的治療作用。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究揭示了膚疾洗劑的活性成分有百部堿、黃柏內(nèi)酯、大豆素、百部生物堿、異原百部堿等。通過PPI 網(wǎng)絡(luò)和活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出膚疾洗劑抗炎、免疫調(diào)控作用的共同核心靶點為蛋白激酶B1（Akt1）、CXCL8、CTNNB1、EGFR、TNF 等。其中Akt1 是一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)激酶，是PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的主要因子，在信號通路中起到承上啟下的作用，是PI3K 控制細(xì)胞增殖、存活和細(xì)胞周期的主要下游靶蛋白，磷酸化的Akt1 還可調(diào)控下游因子介導(dǎo)炎性反應(yīng)[12]。Akt 參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，也有研究表明，Akt 磷酸化的激活可以抑制炎癥因子的表達(dá)和分泌，從而表現(xiàn)抗炎作用[13-14]。

GO 富集中生物過程主要涉及到炎癥反應(yīng)、ERK1 和ERK2 的正向調(diào)節(jié)、胞漿鈣離子濃度的正調(diào)控、MAPK 級聯(lián)的正調(diào)控等方面。KEGG 富集結(jié)果顯示其作用通路可能是pathways in cancer、TNF、HIF-1 等。PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，膚疾洗劑的活性成分主要作用于Akt1、VEGFA、TNF、CTNNB1、EGFR、TLR4、CXCL8 等靶點發(fā)揮治療瘙癢癥作用。

分子對接結(jié)果顯示，原百部堿、黃柏內(nèi)酯、大豆素、百部生物堿、異原百部堿等化學(xué)成分與EGFR、CXCL8、TLR4 等靶點有較好的結(jié)合活性。有研究表明黃柏內(nèi)酯通過抗炎發(fā)揮治療作用，對炎性因子的表達(dá)有直接抑制作用[15-17]。此外，百部生物堿、原百部堿能與EGFR、CXCL8、TLR4 等靶點較好結(jié)合，有研究表明百部煎液或浸液中生物堿類成分對多種致病菌及皮膚真菌有抑制作用，如金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、變形桿菌、白喉桿菌、鼠疫桿菌、炭疽桿菌、綠膿桿菌等均有不同程度的抗菌作用[18-19]。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)對膚疾洗劑的主要活性成分及其治療瘙癢癥的作用機(jī)制進(jìn)行了初步的篩選和分析，為進(jìn)一步深入研究膚疾洗劑發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供了思路和方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突