曲彤，劉小妹，李寧，任慧，魯文靜，崔小敏，胡靜，陳志永*

1.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003

2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院 藥劑科，甘肅 蘭州 730050

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性、以炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性疾病[1]。其以手、足小關(guān)節(jié)的多關(guān)節(jié)、對(duì)稱性、侵襲性關(guān)節(jié)炎癥為特征，常伴有關(guān)節(jié)畸形及功能喪失。Yamamoto 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體的免疫網(wǎng)絡(luò)失衡，成纖維樣滑膜細(xì)胞的類腫瘤樣增殖和細(xì)胞內(nèi)大量分泌金屬蛋白酶和促炎性細(xì)胞因子等，是造成類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)內(nèi)炎性細(xì)胞聚集，滑膜組織增生，骨及軟骨降解和破壞的主要因素。目前用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物從整體上可以劃分為中藥和西藥2 種類型。西藥主要有非甾體抗炎藥（NSAIDs）、慢作用抗風(fēng)濕藥物（SAARDs）、糖皮質(zhì)激素、生物制劑[3]。隨著藥物研究的快速發(fā)展與提升，部分臨床用藥在療效顯著提升的同時(shí)，不良反應(yīng)也逐漸暴露，臨床用藥的安全性受到一定影響。而中醫(yī)藥治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，具有辯證分型、整體調(diào)節(jié)、不良反應(yīng)小的特點(diǎn)，近年來(lái)越來(lái)越受到人們的重視，成為臨床研究的熱點(diǎn)。

《中國(guó)藥典》2020 年版收載的馮了性風(fēng)濕跌打藥酒由丁公藤、麻黃、桂枝等27 味中藥組成。丁公藤祛風(fēng)濕為方中主藥，配以桂枝、麻黃、羌活、蠶沙、白芷發(fā)散風(fēng)寒、祛風(fēng)濕、舒筋絡(luò)，香附、木香、厚樸、枳殼、陳皮、蒼術(shù)、苦杏仁、豬牙皂行氣燥濕化痰，茴香、當(dāng)歸、川芎、乳香、沒(méi)藥、五靈脂、牡丹皮溫經(jīng)活血祛瘀，白術(shù)、山藥、補(bǔ)骨脂、黃精、菟絲子、澤瀉補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰膝。臨床上常用于風(fēng)寒濕痹（包括現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的風(fēng)濕、類風(fēng)濕等疾?。?，瘀滯腫痛，跌打損傷諸癥，應(yīng)用廣泛，療效確切[4-5]?；隈T了性風(fēng)濕跌打藥酒治療風(fēng)寒濕痹型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥效物質(zhì)研究較少及作用機(jī)制尚未闡明這兩個(gè)科學(xué)問(wèn)題，本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究其藥效物質(zhì)，揭示馮了性風(fēng)濕跌打藥酒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可能的作用機(jī)制。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)

1.1 馮了性風(fēng)濕跌打藥酒成分、潛在靶點(diǎn)的獲取

本課題組前期研究中采用高分辨質(zhì)譜解析技術(shù)從馮了性風(fēng)濕跌打藥酒中鑒定出59 種化學(xué)成分，從PubChem 中檢索出各化學(xué)成分的SMILES 號(hào)或下載化合物的2D 結(jié)構(gòu)，保存為SDF 文件，導(dǎo)入TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php ）、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstarget prediction.ch/），依據(jù)上傳的成分的2D 結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，歸納篩選結(jié)果剔除評(píng)分值為0 的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，篩選出活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.2 構(gòu)建“藥材-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

將篩選所得的馮了性風(fēng)濕跌打藥酒中活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)、藥材整理成Excel 屬性文件，將數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2（http://www.cytoscape.org/）軟件中，構(gòu)建“藥材-化合物-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行相關(guān)拓?fù)鋵W(xué)分析。

1.3 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病靶點(diǎn)及藥物-疾病共同靶點(diǎn)的獲取

以“rheumatoid arthritis”為檢索詞在Drugbank（https://www.drugbank.ca/）、OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、Disgenet（https://www.disgenet.org/）在線數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相應(yīng)的疾病靶點(diǎn)，將篩選結(jié)果歸納到一起，去除重復(fù)合并后得到類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

將馮了性風(fēng)濕跌打藥酒潛在靶點(diǎn)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0 平臺(tái)（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny），獲得兩者的交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），物種設(shè)置為“Homo sapiens”，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。通過(guò)Cytoscape 3.7.2 軟件分析degree值，取前10 個(gè)定義為馮了性風(fēng)濕跌打藥酒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的核心作用靶點(diǎn)。

1.5 基因本體（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

為了進(jìn)一步觀察分析作用靶點(diǎn)的生物學(xué)功能以及在信號(hào)通路中的作用，先求得成分、疾病靶點(diǎn)蛋白的交集靶點(diǎn)，將篩選得到的交集靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入DAVID 6.8 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”“Gene List”通過(guò)輸入名稱列表并限定物種為“Homo sapiens”，之后選擇“Pathways”下的“KEGG_PATHWAY”進(jìn)行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）信號(hào)通路富集分析，選取符合條件的前15 個(gè)條目，將前15 條KEGG 信號(hào)通路轉(zhuǎn)換并保存為Excel 文件格式，上傳至在線網(wǎng)站工具微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/），將其結(jié)果進(jìn)行可視化處理，繪制成條形圖與氣泡圖。以P值作為參數(shù)，按基因數(shù)從大到小的順序進(jìn)行排列。

1.6 分子對(duì)接

借助Cytoscape 3.7.2 軟件“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖數(shù)據(jù)信息，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中，取與交集靶點(diǎn)相連的網(wǎng)絡(luò)成分，新建交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可視化圖，根據(jù)degree 大小排序得到排名靠前的小分子配體。借助PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)degree 排名，得到排名靠前的大分子受體。在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）下載相應(yīng)的蛋白的PDB 文件，TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://tcmsp-e.com/）下載相關(guān)化合物的mol2 格式文件，運(yùn)用PyMOL 2.4.0 軟件對(duì)受體蛋白進(jìn)行去水、去配體等操作，AutoDock Tools 1.5.6 軟件對(duì)蛋白進(jìn)行加氫以及計(jì)算電荷處理等處理，將受體蛋白和配體小分子分別轉(zhuǎn)化為pdbqt 格式，利用插件“autogrid”及“autodock”進(jìn)行活性位點(diǎn)對(duì)接，對(duì)接過(guò)程中使用La-marckian genetic algorithm（LGA）算法。計(jì)算結(jié)合能來(lái)評(píng)估成分小分子與蛋白之間的結(jié)合活性，一般小于-5.0 kJ/mol 的對(duì)接結(jié)合能被認(rèn)為具有良好的結(jié)合相互作用。最后運(yùn)用PyMOL 2.4.0 軟件、Discovery studio展示其結(jié)構(gòu)模式。

2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.1 材料

2.1.1 動(dòng)物 雄性SPF 級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK2020-005，飼養(yǎng)于陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度為（22±1）℃，相對(duì)濕度（65±5）%，光/暗循環(huán)12 h/12 h，自由攝食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作符合相關(guān)管理要求并通過(guò)陜西省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，許可證號(hào)AF/SL-01/01.2 和AF/SC-05/01.2。

2.1.2 藥物及試劑 牛Ⅱ型膠原（美國(guó)Chondrex 公司，批號(hào)20021）；弗氏不完全佐劑（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)210144）；馮了性風(fēng)濕跌打藥酒（佛山馮了性藥業(yè)有限公司，規(guī)格500 mL/瓶，批號(hào)170908）；甲氨蝶呤片（上海信宜藥業(yè)有限公司，規(guī)格2.5 mg/片，批號(hào)H31020644）；白細(xì)胞介素-6（IL-6，貨號(hào)ER0042）、低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α，貨號(hào)ER0191）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）試劑盒均購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司；RNA 提取液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)G3013）；Servicebio?RT First Strand cDNA（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)G3330）；2×SYBR Green qPCR Master Mix（Low ROX）（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)G3321）；引物（武漢塞維爾生物科技有限公司）；三氯甲烷（批號(hào)10006818）、異丙醇（批號(hào)80109218）、無(wú)水乙醇（批號(hào)10009218）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2.1.3 儀器 臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)（北京DragonLab 公司）；熒光定量PCR 儀（美國(guó)Bio-rad公司）；超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰公司）；超微量分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司）；標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀，青島富勒科技有限公司；Multiskan SkyHigh 酶標(biāo)儀，ThermoFisher Scientific 公司。

2.2 分組和方法

2.2.1 分組、造模、給藥 將48 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為6 組，即對(duì)照組、模型組、甲氨蝶呤組，以及馮了性風(fēng)濕跌打藥酒（0.1、0.2、0.4 g/kg）組。給藥體積為10 mL/kg，馮了性風(fēng)濕跌打藥酒的出膏率為5%左右，根據(jù)臨床給藥劑量以人體質(zhì)量70 kg 換算馮了性風(fēng)濕跌打藥酒大鼠等效劑量。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]造模方法將牛Ⅱ型膠原蛋白溶于0.1 mol/L 乙酸中，濃度為2 mg/mL，在4 ℃冰箱中放置過(guò)夜。之后與等體積弗氏不完全佐劑在冰浴中、無(wú)菌條件下混合乳化。在大鼠尾根部注射0.2 mL 乳劑（含膠原200 μg），從尾根部2 cm 處插入針頭，直到針尖插入位置距尾根部0.5 cm，針尖插入皮下且每次注射后充分擦拭。初次注射7 d 后，在大鼠尾根部再次注射0.2 mL 的乳劑（含膠原200 μg），注射部位在尾根部3 cm 處，針尖插入皮下距鼠尾根部1.5 cm 處。第13 天，馮了性風(fēng)濕跌打藥酒組大鼠分別ig 0.1、0.2、0.4 g/kg，每天1 次，連續(xù)17 d；甲氨蝶呤組ig 1 mg/kg，每3 d 給藥1次。對(duì)照組和模型組ig 等量蒸餾水，每天1 次，連續(xù)17 d。

2.2.2 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評(píng)分 所有大鼠從造模第1 天開始，每7 天測(cè)定1 次體質(zhì)量，每4 天測(cè)定1 次大鼠左后足踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)。AI 評(píng)分每4 天測(cè)定1 次，采用5 分制的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：“0”無(wú)腫脹；“1”指關(guān)節(jié)腫脹；“2”腳踝輕度腫脹；“3”涉及整個(gè)爪子的嚴(yán)重炎癥；“4”關(guān)節(jié)畸形或僵直。每次記錄2 只后腿的關(guān)節(jié)炎指數(shù)分?jǐn)?shù)之和，單只最高分為8 分。

2.2.3 組織病理學(xué)檢查 每組大鼠取4 只，迅速剪去左腿踝關(guān)節(jié)，剝離肌肉和組織，生理鹽水洗滌后置于4%多聚甲醛中固定備用。將組織脫鈣、包埋、切片，并進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察各組大鼠的關(guān)節(jié)處病理特征。

2.2.4 定量PCR 分析 用TRIzol 試劑從關(guān)節(jié)滑膜中提取mRNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶和2 μg RNA 合成互補(bǔ)DNA。本研究使用的引物如表1 所示。擴(kuò)增在15 μL 反應(yīng)體積中進(jìn)行，反應(yīng)體積中含有2 μL cDNA、1.5 μL 2.5 μmol/L 引物、7.5 μL qPCR 混合物和4 μL ddH2O。每個(gè)反應(yīng)經(jīng)過(guò)40 個(gè)循環(huán)：95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s。以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為歸一化對(duì)照。

表1 各基因PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequences for each gene

2.2.5 ELISA 法檢測(cè)HIF-1α 和IL-6 水平 第29天，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，從腹主動(dòng)脈采集血樣。室溫條件下靜置1～2 h，3 000 r/min 離心15 min，分離收集上層血清，-20 ℃保存。按照ELISA 試劑盒使用說(shuō)明書對(duì)HIF-1α 和IL-6 進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 9.4.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以表示，檢驗(yàn)方法為單因素方差檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 馮了性風(fēng)濕跌打藥酒候選活性成分的篩選

根據(jù)實(shí)驗(yàn)前期采用UPLC-Q-Exactive 高分辨質(zhì)譜對(duì)馮了性風(fēng)濕跌打藥酒化學(xué)成分的系統(tǒng)研究，共鑒定得到59 個(gè)活性成分[8]，包括多種生物堿、黃酮類、有機(jī)酸等。再將59 個(gè)化合物的SMILES 號(hào)或下載保存的2D 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/），搜索的結(jié)果經(jīng)過(guò)篩選后共得到661 個(gè)藥物的潛在靶點(diǎn)。

3.2 中藥-化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將上述59 個(gè)藥物活性成分與661 個(gè)潛在靶點(diǎn)以Excel 文件格式分別定義數(shù)據(jù)和屬性文件，通過(guò)Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)編排，得到馮了性風(fēng)濕跌打藥酒的中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），共得到723 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 319 條邊。利用Cytoscape 3.7.2 軟件中的degree 值進(jìn)行拓?fù)浞治?，獲得馮了性風(fēng)濕跌打藥酒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的46 種活性成分，將活性成分信息進(jìn)行匯總，見表2。

表2 馮了性風(fēng)濕跌打藥酒活性成分Table 2 Active ingredients of Fengliaoxing Fengshi Dieda Yaojiu

3.3 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)

在 Drugbank、OMIM、Genecards、TTD、DisGeNET、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)，進(jìn)行合并、去重，最終共獲得2 604個(gè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)。

3.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過(guò)Venny 2.1.0 平臺(tái)共獲得283 個(gè)馮了性風(fēng)濕跌打藥酒-類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系，保存為TSV 文件。進(jìn)一步將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，其中節(jié)點(diǎn)共有99 個(gè)，共有1 226 條線將其連接，根據(jù)degree 值對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行排序，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。利用Cytoscape 3.7.2 軟件中的degree 值進(jìn)行拓?fù)浞治觯@得馮了性風(fēng)濕跌打藥酒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的蛋白激酶B1（Akt1）、磷脂酰肌醇激酶-3 催化亞單位α 基因（PIK3CA）、低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、FYN、HRAS、類固醇受體共激活因子（SRC）、熱休克蛋白90α 家族A 類成員1（HSP90AA1）、腫瘤蛋白p53（TP53）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、有絲分裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）等10 個(gè)核心靶點(diǎn)，見表3。這些靶點(diǎn)為馮了性風(fēng)濕跌打藥酒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的核心靶點(diǎn)，可能發(fā)揮著重要作用。選取影響關(guān)節(jié)滑膜環(huán)境的Akt1、PIK3CA、HIF-1α 作為關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network diagram

表3 主要核心靶點(diǎn)Table 3 Main core target

3.5 GO 與KEGG 通路分析

利用DAVID 6.8 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），將3.4 項(xiàng)下的283 個(gè)交集靶點(diǎn)上傳進(jìn)行GO 富集分析，獲得生物過(guò)程（BP）996 條、細(xì)胞組成（CC）126 條、分子功能（MF）231 條。根據(jù)富集基因數(shù)量降序排序，選取每個(gè)類別的前10 條繪制條形圖進(jìn)行可視化分析，見圖3。

圖3 交集靶點(diǎn)GO 富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of intersection targets

對(duì)馮了性風(fēng)濕跌打藥酒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路的生物學(xué)富集分析，見圖4。KEGG 通路富集分析篩選得到172 條（P＜0.05）結(jié)果，排出掉一些不相關(guān)的途徑，如“癌癥”“前列腺癌”“胰腺癌”、“乙肝”等，按P值從小到大的順序篩選出富集靶點(diǎn)最多的前15 條通路，這些信號(hào)通路大部分都參與炎癥反應(yīng)，如磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、Rap1 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、Chemokine 信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路等。再將上述信號(hào)通路上傳至在線網(wǎng)站工具微生信平臺(tái)（https://www.bioinformatics.com.cn/），進(jìn)行可視化處理，其中氣泡的大小代表該通路的基因數(shù)量，顏色代表富集顯著性，見圖4。

圖4 KEGG 信號(hào)通路氣泡圖Fig.4 Bubble diagram of KEGG signaling pathway

3.6 分子對(duì)接結(jié)果分析

將排名前3 位的核心靶點(diǎn)Akt1、PIK3CA、HIF-1α 與排名前3 位的活性成分秦皮乙素、5,7-二羥基香豆素、東莨菪苷進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示分子對(duì)接的結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol，提示結(jié)合較好，見表4。將結(jié)合較好的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行可視化，見圖5。

圖5 核心化合物與核心靶點(diǎn)結(jié)合示意圖Fig.5 Molecular docking diagram of key compounds to targets

表4 關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接Table 4 Molecular docking between key active chemical components and key targets

3.7 足腫脹和AI 評(píng)分結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，觀察記錄大鼠左后踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)、AI 評(píng)分，結(jié)果見圖6。在造模第13 天，模型組較對(duì)照組左后足腫脹和AI 評(píng)分顯著升高（P＜0.01），表明造模成功。在造模第17 天，與模型組相比，馮了性風(fēng)濕跌打藥酒0.2、0.4 g/kg 組關(guān)節(jié)腫脹程度顯著降低（P＜0.05、0.1）；在造模第21 天，與模型組相比，馮了性風(fēng)濕跌打藥酒0.1、0.2 g/kg 組顯著降低左后足腫脹程度（P＜0.05、0.01）；在造模29 天，與模型組相比，馮了性風(fēng)濕跌打藥酒0.2、0.4 g/kg組能顯著降低關(guān)節(jié)腫脹和AI 評(píng)分（P＜0.05、0.01）。

圖6 各組大鼠關(guān)節(jié)周長(zhǎng)、關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分比較（，n =8）Fig.6 Comparison on ankle circumference and arthritis index (,n =8)

3.8 大鼠踝關(guān)節(jié)組織的組織學(xué)觀察

由圖7 可見，對(duì)照組小鼠大鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎性浸潤(rùn)，屬于正?；そM織；模型組大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜血管翳增生明顯，填塞關(guān)節(jié)腔，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)破壞，關(guān)節(jié)間隙變??；馮了性風(fēng)濕跌打藥酒組干預(yù)后，踝關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，滑膜血管翳增生減輕，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，滑膜增生和軟骨退化顯著減輕。

圖7 踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢查（×100）Fig.7 Histopathological examination of ankle joints (×100)

3.9 定量PCR 分析結(jié)果

如圖8 所示，與對(duì)照組相比，模型組HIF-1αmRNA 顯著升高，Akt、PI3KmRNA 顯著降低（P＜0.01、0.001）；與模型組相比，馮了性風(fēng)濕跌打藥酒0.4 g/kg 組能顯著升高PI3KmRNA 表達(dá)量（P＜0.05），馮了性風(fēng)濕跌打藥酒0.2、0.4 g/kg 組能顯著降低HIF-1αmRNA 表達(dá)量（P＜0.001）。

圖8 馮了性風(fēng)濕跌打藥酒對(duì)Akt、PI3K、HIF-1α mRNA 水平的影響（，n =8）Fig.8 Effects of Fengliaoxing Fengshi Dieda Yaojiu on mRNA levels of AKT,PI3K,and HIF-1α (,n =8)

3.10 ELISA 法檢測(cè)HIF-1α 和IL-6 水平

如圖9 所示，模型組大鼠血清中HIF-1α、IL-6的水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），馮了性風(fēng)濕跌打藥酒0.4 g/kg 組大鼠血清中HIF-1α 水平顯著低于模型組（P＜0.01）。馮了性風(fēng)濕跌打藥酒各劑量組大鼠血清中IL-6 水平顯著低于模型組（P＜0.05、0.01）。

圖9 馮了性風(fēng)濕跌打藥酒對(duì)各組大鼠血清HIF-1α、IL-6 水平的影響（，n =8）Fig.9 Effect of Fengliaoxing Fengshi Dieda Yaojiu on HIF-1α and IL-6 levels in collagen-induced arthritis rats (,n =8)

4 討論

中藥復(fù)方的治療疾病機(jī)制尚不完全清楚，君、臣、佐、使間的相互配伍規(guī)律，使得藥物通過(guò)多分子、多靶點(diǎn)、多途徑作用于疾病，而起到一定的治療效果。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的提出為中藥復(fù)方作用于疾病的研究提供了一種新的思路，它是基于大數(shù)據(jù)時(shí)代背景下的一種整體聯(lián)系微觀的，從各層面系統(tǒng)分析分子作用機(jī)制的科學(xué)，這與中醫(yī)整體觀及辨證論治思想相統(tǒng)一[9]。馮了性風(fēng)濕跌打藥酒臨床上用于風(fēng)寒濕痹（包括現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的風(fēng)濕、類風(fēng)濕等疾?。v史悠久，療效確切。因此本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，同時(shí)收集整理文獻(xiàn)資料，對(duì)馮了性風(fēng)濕跌打藥酒防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

IL-6 是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要致病作用包括促進(jìn)炎癥相關(guān)的B 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞的分化以及急性期蛋白的合成；誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，造成關(guān)節(jié)損傷；與IL-1共同誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，從而破壞關(guān)節(jié)軟骨[10-12]?；罨腃D4+T 細(xì)胞可以浸潤(rùn)關(guān)節(jié)滑膜，而關(guān)節(jié)中某些內(nèi)源性物質(zhì)也會(huì)活化CD4+T 細(xì)胞，從而導(dǎo)致炎性反應(yīng)，IL-1β 和IL-6 可以促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞的分化，從而分泌大量的炎性因子，加重類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情[13-14]。HIF-1α 是組織參與缺氧調(diào)控的重要核轉(zhuǎn)錄因子，在低氧條件下，胞內(nèi)HIF-1α 蛋白大量積聚，并從胞漿進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)參與調(diào)控下游靶基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，使VEGFA 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌、增加血管通透性、加速血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致血管翳形成，影響類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和病情進(jìn)展[15-16]。

通過(guò)研究獲得了馮了性風(fēng)濕跌打藥酒的59 種主要活性成分，661 個(gè)潛在靶點(diǎn)，283 個(gè)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎重疊的靶點(diǎn)，涉及996 個(gè)生物過(guò)程、126 類細(xì)胞組分、231 種分子功能和172 個(gè)KEGG 相關(guān)信號(hào)通路。根據(jù)構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖推測(cè)出馮了性風(fēng)濕跌打藥酒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要活性成分包括秦皮乙素、東莨菪苷、異牡荊素-6'-O-α-L-鼠李糖苷等，其中秦皮乙素的degree值最高。根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)與KEGG 通路富集分析得出馮了性風(fēng)濕跌打藥酒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎涉及Akt1、VEGFA、IL-6、HIF-1α、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）等多個(gè)核心靶點(diǎn)以及PI3K/Akt、Ras、HIF-1、MAPK 等多條信號(hào)通路。PI3K/Akt 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等是和免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路[17-18]，說(shuō)明馮了性風(fēng)濕跌打藥酒對(duì)調(diào)節(jié)免疫、消除炎癥具有一定的作用。本研究建立了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎常用的膠原誘導(dǎo)性（CIA）模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果顯示，馮了性風(fēng)濕跌打藥酒干預(yù)后的大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分明顯降低，其關(guān)節(jié)腫脹度明顯改善，HE 組織切片染色顯示馮了性風(fēng)濕跌打藥酒干預(yù)后，大鼠踝關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，滑膜血管翳增生減輕，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，顯著改善了滑膜增生和軟骨退化。此外，ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α、IL-6 水平表達(dá)明顯升高，給予馮了性風(fēng)濕跌打藥酒干預(yù)后，大鼠滑膜HIF-1α、IL-16水平顯著下降，減少炎性因子分泌、對(duì)下游靶基因VEGF 的激活效應(yīng)減弱，使VEGFA 表達(dá)降低，抑制新生血管的生成，緩解關(guān)節(jié)炎大鼠的骨破壞，減輕關(guān)節(jié)的損傷，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎起到治療作用。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析馮了性風(fēng)濕跌打藥酒作用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在分子機(jī)制，結(jié)果顯示，馮了性風(fēng)濕跌打藥酒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路來(lái)發(fā)揮作用，但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)只是基于大數(shù)據(jù)時(shí)代背景下新興的學(xué)科，多種數(shù)據(jù)庫(kù)資料沒(méi)有實(shí)時(shí)更新，且馮了性風(fēng)濕跌打藥酒及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在不同數(shù)據(jù)庫(kù)下所得出的結(jié)果與最新前沿知識(shí)仍有些許差別。因此，本課題組將進(jìn)一步對(duì)篩選出來(lái)的相關(guān)基因及蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)細(xì)胞因子檢測(cè)、病理切片等信號(hào)通路調(diào)控類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。從分子層面明確馮了性風(fēng)濕跌打藥酒的有效性，為馮了性風(fēng)濕跌打藥酒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)和臨床研究以及中藥組方的新藥研制提供一定的理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突