王子見，馬芝薇，何樹妮，任媛媛，王琳琳，石玉琪，劉婷，李子恒，何鳳琴

西安文理學(xué)院 西安市秦嶺天然產(chǎn)物開發(fā)與創(chuàng)新藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710065

關(guān)鍵字：利血平；脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3 型；ataxin-3；蛋白包涵體；核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；可溶性蛋白

脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3 型/馬查多約瑟夫?。⊿CA3/MJD，簡(jiǎn)稱SCA3）是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)退行性疾病，是僅次于亨廷頓舞蹈癥的第2 大類多聚谷氨酰胺（polyQ）疾病[1-2]。該病是由ATXN3基因編碼的ataxin-3 蛋白polyQ 異常擴(kuò)增引起的。一般情況下，健康人群polyQ 重復(fù)序列數(shù)目12～43，SCA3 患者會(huì)增加至51～91。正常ataxin-3 蛋白是一種胞漿蛋白，含有異常擴(kuò)增polyQ 的ataxin-3蛋白在各種致病因素的刺激下進(jìn)入細(xì)胞核，在核內(nèi)募集其他多種組分包括轉(zhuǎn)錄因子、泛素蛋白酶、伴侶蛋白或RNA 等形成核內(nèi)包涵體（SCA3 標(biāo)志性病理特征），從而導(dǎo)致核內(nèi)轉(zhuǎn)錄異常、蛋白穩(wěn)態(tài)失衡、能量代謝障礙、運(yùn)輸障礙等，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡[3-4]。因此，與其他很多神經(jīng)退行性疾病的致病蛋白一樣，細(xì)胞核是關(guān)鍵的病理位點(diǎn)，ataxin-3 的病理入核現(xiàn)象和核內(nèi)包涵體的形成是SCA3 早期重要的病理特征和發(fā)病機(jī)制[5]。

利血平是從印度蘿芙木屬蛇根木Rauvolfia serpentina(L.) Benth.ex Kurz 中提取的一種生物堿，是具有溫和持久特點(diǎn)的抗高血壓藥物[6-8]。但同時(shí)，利血平能夠誘發(fā)帕金森綜合征和抑郁癥[9-10]。研究表明，利血平能夠促使人神經(jīng)母細(xì)胞SH-SY5Y 的凋亡和誘導(dǎo)自噬損傷，引發(fā)α-synuclein 蛋白聚集體，并能影響Ddc-GAL4 果蠅的運(yùn)動(dòng)能力[11]。利血平作為單胺類抑制劑，可治療運(yùn)動(dòng)機(jī)能亢進(jìn)，已被廣泛用于亨廷頓舞蹈癥的抽動(dòng)癥[12]。結(jié)合利血平對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的影響，本研究探討利血平在SCA3 致病過(guò)程中對(duì)一系列細(xì)胞水平病理變化的影響，分析最早期的病理變化ataxin-3 核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，觀察可溶性ataxin-3 蛋白水平以及ataxin-3 形成的包涵體數(shù)量，檢測(cè)SCA3 細(xì)胞活性，進(jìn)而闡明利血平對(duì)SCA3 細(xì)胞模型的影響，揭示老藥新用的藥理作用，為臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

利血平（批號(hào)83580）、陰性對(duì)照DMSO 溶劑（批號(hào)32160405）均購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司。β-半乳糖苷酶抗體（β-gal，貨號(hào)200-4136，稀釋比例為1∶10 000）購(gòu)自Enzo Life Science 公司，為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參蛋白；LaminAC 抗體（貨號(hào)7293，稀釋比例為1∶500）購(gòu)自Santa cruz biotechology 公司，為細(xì)胞核內(nèi)參蛋白；1H9 抗體（貨號(hào)MAB5360，稀釋比例為1∶2 500）購(gòu)自Merck Millipore 公司，為檢測(cè)ataxin-3 蛋白；Actin 抗體（貨號(hào)A5441，稀釋比例為1∶10 000）購(gòu)自Sigma Aldrich 公司，為內(nèi)參蛋白；辣根過(guò)氧化物標(biāo)記二抗Anti-Mouse IgG（貨號(hào)9597364，稀釋比例為1∶2 500；Anti-Rabbit IgG（貨號(hào)9596107，稀釋比例為1∶2 500）均購(gòu)自GE Healthcare Life Science 公司；熒光標(biāo)記二抗Anti-Mouse IgG（Alexa Fluor 488，貨號(hào)A-21202，稀釋比例為1∶200）購(gòu)自Life Technologies 公司；Attractene 試劑（貨號(hào)301005）購(gòu)自Qiagen 公司；Prestoblue Cell Viability 試劑（貨號(hào)A13262）購(gòu)自Life technologies 公司。

1.2 細(xì)胞及質(zhì)粒

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢CHO 細(xì)胞和人胚腎HEK293T 細(xì)胞均由德國(guó)圖賓根大學(xué)Thorsten Schimdt 博士惠贈(zèng)；野生型peGFP-ataxin-3-15Q（正常）、polyQ 中度擴(kuò)增型peGFP-ataxin-3-77Q（中度患?。┖蚿olyQ 中度擴(kuò)增型peGFP-ataxin-3-148Q（重度患?。┵|(zhì)粒均由德國(guó)圖賓根大學(xué)Thorsten Schimdt 博士惠贈(zèng)。

1.3 儀器

熒光顯微鏡（蔡司Axioscope 5）；酶標(biāo)儀（Bio-Tek Synergy HT microplate reader，內(nèi)含Gen5 軟件）；Li-Cor C-DiGit?化學(xué)發(fā)光掃描儀，含Image Studio 軟件；96 孔Bio-Dot 微孔過(guò)濾儀（Bio-Rad 公司）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

CHO 細(xì)胞和HEK293T 細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，在含有5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 天將細(xì)胞傳代至6 孔板，第2 天使用Attractene 轉(zhuǎn)染試劑按照說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，將1.2 μg DNA 質(zhì)粒（溶解在TE 緩沖液中）稀釋在總體積100 μL 的DMEM 培養(yǎng)液（不含血清和雙抗）中，加入4.5 μL的Attractene 轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫孵育15 min，將轉(zhuǎn)染混合物加入到6 孔板中，按照倒八字搖勻后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞質(zhì)核分離

收集細(xì)胞，加入200 μL 的細(xì)胞質(zhì)緩沖液（10 mmol/L HEPES pH 7.5，10 mmol/L KCl，0.1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，0.5% NP40，加入蛋白酶抑制劑），吹打混勻，置冰上20 min，期間渦旋2 次，每次5 s。在4 ℃條件下13 000 r/min 離心5 min，上清即為細(xì)胞質(zhì)蛋白。向細(xì)胞沉淀中加入80 μL 的細(xì)胞核緩沖液（細(xì)胞質(zhì)緩沖液+1% NP40），吹打混勻，置冰上30 min，其間渦旋3 次，每次5 s。在4 ℃條件下13 000 r/min 離心20 min，上清液即為細(xì)胞核蛋白。

1.6 全蛋白提取

收集細(xì)胞，離心，在細(xì)胞沉淀中加入100 μL 的蛋白裂解緩沖液TNES（1 mol/L Tris pH 7.5，5 mol/L NaCl，0.1%聚山梨醇酯20，加入蛋白酶抑制劑），吹打混勻，置冰上15 min，其中渦旋2 次，每次5 s。在4 ℃條件下13 000 r/min 離心5 min，上清即為細(xì)胞全蛋白。

1.7 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

采用Bradford 方法測(cè)定蛋白濃度，每孔蛋白上樣量為30 μg，加入一定量的上樣緩沖液，煮沸5 min進(jìn)行變性，離心，取蛋白上清上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，電壓80 V 轉(zhuǎn)膜2 h，取出硝酸纖維素膜，采用含5%脫脂奶粉的1×TBST 進(jìn)行室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，使用1×TBST漂洗3 次，每次10 min，加入二抗室溫孵育1 h，再使用1×TBST 漂洗3 次，每次10 min，加入ECL底物進(jìn)行顯色，在LI-COR Odyssey 成像儀上拍照分析。一抗：1H9 抗體用于檢測(cè)ataxin-3 蛋白；稀釋倍數(shù)為1∶1 000。辣根過(guò)氧化物標(biāo)記二抗稀釋倍數(shù)均為1∶2 000。

1.8 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種在含有4%多聚賴氨酸預(yù)處理的蓋玻片（蓋玻片放置于6 孔板中）上生長(zhǎng)過(guò)夜。第2天棄掉培養(yǎng)液，用1∶1 的甲醇和丙酮固定5 min，用預(yù)冷的PBS 洗1 次，加入封閉液室溫封閉20 min，加入一抗室溫孵育1 h，PBS 洗3 次，每次5 min，室溫孵育二抗1 h，洗滌同上，隨后用DAPI 染核10 min，洗滌后，加入封片劑和蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。采用Image J 軟件分析ataxin-3 蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的熒光值，計(jì)算ataxin-3 在細(xì)胞核分布的百分比。

1.9 微孔過(guò)濾實(shí)驗(yàn)

該方法用于檢測(cè)不溶于SDS 的蛋白包涵體，分析ataxin-3 形成的包涵體數(shù)量。細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h 后，收集細(xì)胞，1 500 r/min 離心5 min，將含有蛋白酶抑制劑的PBS 加入到細(xì)胞沉淀中進(jìn)行重懸，用超聲破碎儀裂解細(xì)胞和DNA 片段。采用Bradford 方法測(cè)定蛋白濃度，在蛋白樣品中加入2% SDS，煮沸5 min 使蛋白質(zhì)完全變性，將醋酸纖維素膜在1×TBST（含2% SDS）中浸潤(rùn)預(yù)處理，安裝并打開微孔過(guò)濾儀，在每孔中加入100 μg 的蛋白樣品，在抽濾真空泵的作用下，小分子蛋白通過(guò)醋酸纖維素膜，而大分子蛋白包涵體會(huì)留在膜上，PBS 沖洗3 次，待樣品全部吸附在濾膜上，將濾膜取出放置在含5%脫脂奶粉的1×TBST 進(jìn)行4 ℃孵育過(guò)夜，之后進(jìn)行一抗、二抗孵育以及 ECL 顯色等步驟進(jìn)行Western blotting 實(shí)驗(yàn)。

1.10 細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

PrestoBlue 細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒是一種以resazurin 為基礎(chǔ)的用于檢測(cè)細(xì)胞活性的試劑。將細(xì)胞鋪板至96 孔板，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，利血平或DMSO處理后，加入PrestoBlue 試劑孵育10 min，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)（激發(fā)光：535 nm，發(fā)射光：615 nm）。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 利血平對(duì)ataxin-3 核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

結(jié)果表明，與DMSO 組相比，利血平組對(duì)野生型和突變型ataxin-3 核質(zhì)分布沒(méi)有影響，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1），表明利血平對(duì)ataxin-3 核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)沒(méi)有影響。同時(shí)，本研究采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證利血平對(duì)ataxin-3 入核的影響。結(jié)果表明，與DMSO 組相比，利血平組對(duì)野生型和突變型ataxin-3的核質(zhì)分布的影響差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。通過(guò)以上方法得出利血平對(duì)SCA3 早期的病理變化ataxin-3 核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)沒(méi)有顯著影響。

圖1 Western blotting 實(shí)驗(yàn)探索利血平對(duì)野生型（A）和突變型ataxin-3（B）核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響（n＝3）Fig.1 Effects of reserpine on translocation of wild-type (A) and mutant ataxin-3 (B) investigated by Western blotting (n＝3)

圖2 轉(zhuǎn)染ataxin-3-15Q（A）或ataxin-3-77Q（B）的CHO 細(xì)胞和ataxin-3 在細(xì)胞核分布的百分比（C）Fig.2 Percentage of the nuclear distribution of ataxin-3 (C) in CHO cells transfected with ataxin-3-15Q (A) or ataxin-3-77Q (B)

2.2 利血平對(duì)ataxin-3 可溶性蛋白的影響

如圖3 所示，利血平對(duì)野生型和突變型ataxin-3可溶性蛋白均沒(méi)有影響，說(shuō)明利血平?jīng)]有通過(guò)改變ataxin-3 可溶性蛋白水平對(duì)SCA3 致病過(guò)程產(chǎn)生影響。

圖3 利血平對(duì)ataxin-3 可溶性蛋白水平的影響（n＝3）Fig.3 Effect of reserpine on ataxin-3 soluble protein level (n＝3)

2.3 利血平對(duì)ataxin-3 蛋白包涵體數(shù)量的影響

如圖4 所示，在過(guò)表達(dá)野生型ataixn-3 的細(xì)胞模型中，DMSO 組和利血平組均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)蛋白包涵體；對(duì)于含異常擴(kuò)展ployQ 的突變ataxin-3 在DMSO處理組和藥物處理組均存在蛋白包涵體。而且，與DMSO 組相比，利血平能夠顯著增加蛋白包涵體數(shù)量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明利血平能夠增加突變ataxin-3 形成的蛋白包涵體數(shù)量。

圖4 利血平對(duì)ataxin-3 蛋白包涵體數(shù)量的影響（n＝4）Fig.4 Effect of reserpine on the aggregates formed by expanded ataxin-3 (n＝4)

2.4 利血平對(duì)SCA3 細(xì)胞活性的作用

如圖5 所示，與DMSO 組相比，利血平（100 μmol/L）處理24 h 時(shí)，能夠顯著降低SCA3 細(xì)胞的活性（P＜0.01）。但處理時(shí)間為2 h，利血平的毒性作用并不明顯，表明利血平長(zhǎng)時(shí)間處理才會(huì)引起對(duì)細(xì)胞的毒性，這和蛋白包涵體的結(jié)果相一致。

圖5 處理2 h（A）或24 h（B）利血平對(duì)SCA3 細(xì)胞活性的作用（n＝3）Fig.5 Effect of reserpine on SCA3 cell viability after 2 h (A) or 24 h (B) (n＝3)

3 討論

利血平用于治療高血壓已經(jīng)在臨床應(yīng)用很多年，通過(guò)阻斷神經(jīng)末梢內(nèi)囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的形成，使突觸前神經(jīng)末梢產(chǎn)生的去甲腎上腺素等物質(zhì)在未受保護(hù)的情況下被耗竭，緩解了應(yīng)激損傷，對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用。而且，利血平能夠通過(guò)耗竭單胺類神經(jīng)遞質(zhì)而改善亨廷頓舞蹈癥的多動(dòng)性運(yùn)動(dòng)障礙[13]。但是，利血平的不良反應(yīng)是會(huì)引起帕金森綜合征和抑郁癥。最新研究表明，利血平能夠損傷自噬系統(tǒng)，并增加α-synuclein 蛋白聚集體[11]。鑒于此，本研究通過(guò)分析利血平對(duì)ataxin-3 核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、ataxin-3 可溶性蛋白水平以及蛋白包涵體的影響，進(jìn)一步探究利血平對(duì)SCA3 細(xì)胞活性的影響，闡明該藥物對(duì)SCA3疾病的潛在作用。

研究表明，單給利血平對(duì)PC12 細(xì)胞無(wú)毒性作用，但利血平與多巴胺共同作用后可明顯增加多巴胺的毒性作用，從而誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[14]。另有研究表明，在秀麗隱桿線蟲實(shí)驗(yàn)中，利血平在濃度為60 μmol/L 時(shí)會(huì)降低線蟲的存活率[15]?？紤]到利血平的毒性作用，本研究采用小劑量（10 μmol/L）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在該濃度下，利血平雖然對(duì)ataxin-3 核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和ataxin-3 可溶性蛋白水平?jīng)]有顯著性影響，卻增加了蛋白包涵體的形成，但是該濃度對(duì)細(xì)胞的活性影響不大。雖然ataxin-3 核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)是SCA3最早期的病理癥狀，入核后才會(huì)進(jìn)一步誘發(fā)核內(nèi)包涵體的形成，這是一個(gè)關(guān)鍵影響因素。但蛋白包涵體的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，還受到蛋白降解的影響。因此，利血平可能通過(guò)影響蛋白降解過(guò)程作用于蛋白包涵體的形成。另外，利血平是否通過(guò)已報(bào)道的自噬途徑對(duì)ataxin-3 蛋白包涵體產(chǎn)生作用，其具體分子機(jī)制可能需要闡明。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，利血平在100 μmol/L 時(shí)對(duì)SCA3 細(xì)胞活性具有毒性，這種毒性可能是通過(guò)增加胞內(nèi)包涵體的數(shù)量實(shí)現(xiàn)的，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果部分一致[16]。后續(xù)仍需要探索10～100 μmol/L 濃度梯度的利血平對(duì)細(xì)胞活性的影響。

另有一些研究表明，利血平作為多靶點(diǎn)藥物，在阿爾茨海默癥的小鼠模型和線蟲模型中，能夠減少β 淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑，增加活動(dòng)認(rèn)知能力，但是在這些研究中并沒(méi)有進(jìn)行可靠的定量分析和科學(xué)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究方法具有一定的局限性[17-19]。重要的是，SCA3 疾病表現(xiàn)為認(rèn)知行為喪失，由于腦中膽堿能神經(jīng)元變性導(dǎo)致的血清素神經(jīng)傳遞減少是主要功能障礙，因此，利血平作為多巴胺系統(tǒng)的效應(yīng)藥物減少了血清素等神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)SCA3 來(lái)說(shuō)是不利的，而且利血平通過(guò)促進(jìn)蛋白包涵體的形成而對(duì)SCA3 細(xì)胞模型具有毒性作用，為老藥新用提供了理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突