張靈雁，于東升，李曉萍

鄭州大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052

膽汁淤積癥是一種由肝細胞分泌受損或肝內(nèi)外膽管阻塞引起膽汁酸在肝內(nèi)外積聚的綜合癥。遺傳性疾病如膽道閉鎖、自身免疫性肝病、感染性肝病如乙肝病毒感染、藥物誘導性和代謝性疾病等多種因素都會引起膽汁淤積癥。膽汁淤積癥如不及時治療，會導致肝纖維化和肝硬化[1]。目前臨床常用于膽汁淤積癥的藥物有熊去氧膽酸、奧貝膽酸和S腺苷蛋氨酸等[2]。

茵梔黃顆粒目前常用于急性黃疸性肝炎，其主要組分為茵陳、梔子和黃芪提取物。前期研究發(fā)現(xiàn)，茵梔黃顆粒可以改善高脂飲食引起的肥胖和肝臟脂肪變性[3]，還可以通過上調(diào)膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白多藥耐藥相關(guān)蛋白2（Mrp2）與膽鹽輸出泵（Bsep）的表達，對異硫氰酸-α-萘酯誘導的大鼠肝內(nèi)膽汁淤積具有保護作用[4]。茵梔黃顆?？梢詼p輕雌激素誘發(fā)的大鼠妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥[5]，但其對膽汁淤積性肝損傷的作用機制尚不清楚。

腸道菌群失調(diào)與膽汁淤積癥密切相關(guān)[6]。腸道菌群是一個復雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，腸道內(nèi)菌群失調(diào)不僅可能通過腸-肝軸引起肝臟的炎癥性疾病，還能夠影響體內(nèi)結(jié)合型膽汁酸的代謝過程[7]。因此，本研究采用膽管結(jié)扎致小鼠急性肝內(nèi)膽汁淤積模型對茵梔黃顆粒進行藥效學評價，進而通過檢測茵梔黃顆粒對小鼠膽汁酸組成和腸道菌群的影響來研究其作用機制，以闡明茵梔黃顆粒通過調(diào)節(jié)腸道菌群影響膽汁酸穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的作用機制，為茵梔黃顆粒在治療膽汁淤積癥中的臨床應用提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

茵梔黃顆粒購自魯南厚普制藥有限公司（規(guī)格3 g/袋，批號09190871），熊去氧膽酸（質(zhì)量分數(shù)≥98.5%，批號L21043A）購自德國Losan Pharma GmbH 公司。TRIzol（貨號R401-01），2×ChamQ Universal SYBR（貨號Q711-02）和HiScript II 1st Strand cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號R212-01）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。含1%膽酸的飼料購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（批號20220410）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（批號20220317）、堿性磷酸酶（ALP）（批號20220321）購自南京建成生物工程研究所。Anti-NTCP1 一抗（貨號ab131084）、Anti-CYP7A1一抗（貨號ab234982）購自美國Abcam公司，Anti-FXR 一抗（貨號#72105）購自美國Cell Signaling Technology 公司，Anti-BSEP（貨號#67512-1-Ig）、Anti-α-tubulin 一抗（貨號11224-1-AP）、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse二抗（貨號#SA00001-1）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。高敏ECL 化學發(fā)光試劑盒（批號20211201）購自蘇州新賽美生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

徠卡RM 2135 病理組織石蠟切片機（德國Leica公司）；蔡司Axiolab 5 型正置光學顯微鏡（日本ZEISS 公司）；Amersham Image Quant 800 超靈敏多功能成像儀（美國Cytiva 公司）；QuantStudio? 5 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)（美國Applied Biosystems 公司）；AB Triple TOF 6600 質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；Agilent 1290 Infinity LC 超高壓液相色譜儀（美國Agilent 公司）。

1.3 實驗動物

48 只8 周齡C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號SCXK（京）2014-0001。本實驗方案獲鄭州大學第一附屬醫(yī)院生命科學倫理委員會批準，批號2021-KY-0990-002。

1.4 實驗動物分組、造模及給藥

C57BL/6 小鼠飼養(yǎng)于鄭州大學第一附屬醫(yī)院SPF 環(huán)境中，溫度（20±2）℃、相對濕度（50±5）%，均自由飲食、飲水。適應性飼養(yǎng)7 d 后，按體質(zhì)量隨機分為6 組，分別為對照組、模型組、熊去氧膽酸組，以及茵梔黃顆粒5、10、20 g/kg 組，每組8只。對照組給予普通飼料，其余各組均給予含1%膽酸的飼料2 周，構(gòu)建小鼠膽汁淤積癥模型[8-9]。于實驗第3 周開始，茵梔黃顆粒組小鼠分別ig 茵梔黃顆粒5、10、20 g/kg[10]，熊去氧膽酸組小鼠ig 0.1 g/kg熊去氧膽酸[4]，對照組和模型組大鼠ig 同體積生理鹽水，連續(xù)給藥4 周。

1.5 樣本收集

實驗結(jié)束后，收集小鼠肝組織，一部分用4%多聚甲醛固定后用于蘇木精-伊紅（HE）染色，一部分液氮速凍后，-80 ℃保存，用于Western blotting和RT-qPCR 檢測。收集小鼠盲腸內(nèi)容物，液氮速凍后，-80 ℃保存，用于腸道菌群測定。收集小鼠血清，-80 ℃保存，用于非靶代謝組學檢測。

1.6 血清生化指標檢測

收集小鼠血液，3 000 r/min 離心10 min，分離血清，按照試劑盒說明書測定血清ALT、AST、ALP水平。

1.7 肝臟組織病理學檢測

收集小鼠肝組織，4%多聚甲醛固定后，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋切片，行HE 染色，封片后顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學變化。

1.8 免疫印跡檢測

取肝組織，加入RIPA 裂解液在勻漿器中充分研磨后，BCA 法測定蛋白濃度，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離30 μg 蛋白，然后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h 后，加入一抗4 ℃（FXR 一抗1∶1 000 稀釋，BSEP 一抗1∶1 000 稀釋，NTCP一抗1∶1 000 稀釋，CYP7A1 一抗1∶1 000 稀釋，α-tubulin 一抗1∶5 000 稀釋）孵育過夜，TBST 洗滌3 次，每次5 min，室溫孵育二抗1 h，TBST 洗滌3 次，每次5 min，ECL 發(fā)光液顯色，用Cytiva化學發(fā)光成像儀拍照并分析。

1.9 RT-qPCR 檢測

取肝組織，加入TRIzol 充分勻漿后提取總RNA，取1 μg RNA 為模板，按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-qPCR 按照SYBR 試劑說明書進行，反應體系為10 μL。結(jié)果用2-ΔΔCt計算，以相對值表示，其中引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.10 膽汁酸含量分析

收集模型組和茵梔黃顆粒20 g/kg 組小鼠膽汁，甲醇沉淀蛋白后，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液100 μL 加入到檢測瓶中。數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜（Waters ACQUITY UPLC）和質(zhì)譜（AB 三重四極桿質(zhì)譜儀）。色譜條件為ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A 相為超純水（含0.01%甲酸），B 相為乙腈；體積流量0.25 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；洗脫梯度：0～4 min，25% B；4～9 min，25%～30% B；9～14 min，30%～36% B；14～18 min，36%～38% B；18～24 min，38%～50%B；24～32 min，50%～75% B；32～35 min，75%～100% B；35～38 min，100%～25% B。采用電噴霧離子源（ESI），負離子電離模式。離子源溫度500 ℃，離子源電壓-4 500 V，碰撞氣壓力41.37 kPa，氣簾氣壓力206.84 kPa，霧化氣和輔助氣壓均為344.74 kPa。采用多重反應監(jiān)測（MRM）進行掃描。所采用的對照品信息見表2。

根據(jù)不同濃度的對照品，以對照品的濃度為橫坐標，以對照品的峰面積為縱坐標作圖，建立靶向化合物與其峰面積的方程，根據(jù)樣品中相應化合物的峰面積計算其濃度。根據(jù)樣品中膽汁酸濃度進行凝聚層次聚類（agglomerate hierarchical clustering）：即將每個對象歸為一類，合并這些類成為越來越大的對象，直到終結(jié)。通過R（v 3.3.2）中pheatmap程序包對數(shù)據(jù)集進行縮放，得到代謝物相對定量值層次聚類圖，進行偏最小二乘判別（PLS-DA）分析。

1.11 16S rDNA 測序

采用試劑盒說明書對各組小鼠樣本的盲腸內(nèi)容物DNA 進行提取，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用NEB Next?Ultra?DNA Library Prep Kit 建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫通過 Agilent Bioanalyzer 2100 和Qubit 進行質(zhì)檢，采用Illumina Miseq 測序平臺對V3～V4可變區(qū)進行擴增和測序，并利用線性判別分析效應大?。↙EfSe）和R 軟件進行表達和分析。

1.12 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 8.3 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以表示，2 組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用One-way ANOVA 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 茵梔黃顆粒對小鼠血清指標的影響

與對照組相比，模型組小鼠血清ALT、AST、ALP 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，茵梔黃顆粒各組小鼠血清ALT、AST、ALP 水平均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），表明茵梔黃顆粒干預能夠顯著減輕膽汁淤積小鼠肝損傷，見表3。

表3 茵梔黃顆粒對膽汁淤積小鼠血清ALT、AST、ALP 水平的影響（，n =8）Table 3 Effect of Yinzhihuang Granules on serum ALT,AST,and ALP levels of cholestasis mice (,n =8)

表3 茵梔黃顆粒對膽汁淤積小鼠血清ALT、AST、ALP 水平的影響（，n =8）Table 3 Effect of Yinzhihuang Granules on serum ALT,AST,and ALP levels of cholestasis mice (,n =8)

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001**P ＜ 0.01 vs control group;#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 ###P ＜ 0.001 vs model group

2.2 茵梔黃顆粒對小鼠肝組織病理學的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，未見明顯組織病理損傷。與對照組相比，模型組小鼠肝竇和匯管區(qū)炎性細胞浸潤增加，肝組織壞死面積顯著增加，細胞壞死率增加（P＜0.001）。與對照組相比，熊去氧膽酸組小鼠肝組織炎癥細胞浸潤減輕，壞死面積顯著減小，細胞壞死率減少（P＜0.001），茵梔黃顆粒5 g/kg 組肝組織壞死面積減小，細胞壞死率減少（P＜0.05），但炎性細胞浸潤未見減輕。茵梔黃顆粒10、20 g/kg 組小鼠肝組織炎性細胞浸潤和壞死率均顯著減少（P＜0.01、0.001），見圖1。

圖1 茵梔黃顆粒對膽汁淤積小鼠肝臟組織病理學的影響（，n =8）Fig.1 Effect of Yinzhihuang Granules on histopathology of liver in cholestasis mice (,n =8)

2.3 茵梔黃顆粒對小鼠肝臟炎癥因子和膽汁酸代謝關(guān)鍵基因mRNA 表達水平的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠肝臟IL-10、TNF-α、IL-6、MCP-1mRNA 表達水平顯著上調(diào)，IL-1β、CYP7A1、Bsep、Ntcp、Mrp2、Ugt1a1mRNA 表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05、0.01）；與模型組相比，熊去氧膽酸組和茵梔黃顆粒各劑量組小鼠肝臟IL-10、TNF-α、IL-6、MCP-1mRNA 表達水平均顯著降低，IL-1β、CYP7A1、Bsep、Ntcp、Mrp2、Ugt1a1mRNA 表達水平均顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。且茵梔黃顆粒各劑量組改變趨勢呈劑量相關(guān)性。以上結(jié)果表明，茵梔黃顆粒能夠降低膽汁淤積引起的肝臟炎癥反應，并影響肝臟膽汁酸代謝相關(guān)基因的表達，見圖2。

圖2 茵梔黃顆粒對膽汁淤積小鼠肝臟組織炎癥和膽汁酸代謝相關(guān)基因表達水平的影響（，n =8）Fig.2 Effect of Yinzhihuang Granules on liver inflammation and bile acid metabolism related gene expression in cholestasis mice (,n =8)

2.4 茵梔黃顆粒對小鼠肝組織膽汁酸代謝相關(guān)蛋白表達水平的影響

Western blotting 檢測小鼠肝組織膽汁酸代謝關(guān)鍵蛋白的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組小鼠肝組織中膽汁酸代謝的主要調(diào)節(jié)因子FXR、膽汁酸外排的主要轉(zhuǎn)運蛋白Bsep 和膽汁酸重吸收的主要受體Ntcp 的表達水平顯著降低（P＜0.001），膽汁酸生物合成的主要限速酶CYP7A1 表達水平顯著上調(diào)，表明小鼠肝組織膽汁酸代謝失調(diào)。熊去氧膽酸和茵梔黃顆粒各劑量組能夠顯著上調(diào)FXR、Bsep、Ntcp 的表達水平，下調(diào)CYP7A1 表達水平，且其作用呈劑量相關(guān)性，表明茵梔黃顆粒能夠上調(diào)肝組織FXR、Bsep、Ntcp 的表達水平，促進膽汁酸外排和重吸收，降低肝組織CYP7A1 表達水平，減少膽汁酸的合成，而調(diào)節(jié)肝臟膽汁酸代謝過程，見圖3。

圖3 茵梔黃顆粒對膽汁淤積小鼠肝臟膽汁酸代謝相關(guān)蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of Yinzhihuang Granules on bile acid metabolism related protein expression in cholestasis mice

2.5 茵梔黃顆粒對膽汁淤積小鼠膽汁酸的影響

收集小鼠膽汁，LC-MS 法檢測模型組和茵梔黃顆粒20 g/kg 組小鼠膽汁中40 種膽汁酸的成分。

2.5.1 代謝物輪廓分析 用偏最小二乘法-判別分析法（PLS-DA）分析2 組小鼠膽汁代謝輪廓，結(jié)果2 組膽汁酸成分明顯區(qū)分，具有可比性，見圖4A。

圖4 茵梔黃顆粒對膽汁淤積小鼠膽汁成分的影響（，n =8）Fig.4 Effect of Yinzhihuang Granules on bile components in cholestasis mice (,n =8)

2.5.2 差異膽汁酸分析 其中30 種膽汁酸成分有差異，見圖4B。從中選出8 種差異最顯著的膽汁酸，與模型組相比，茵梔黃顆粒20 g/kg 組小鼠膽汁中初級膽汁酸TCDCA、次級膽汁酸UDCA、ACA、THCA、T-α-MCA、T-β-MCA 和結(jié)合型膽汁酸CDCA-G 的含量顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001），次級膽汁酸α-MCA 的含量顯著降低（P＜0.001），見圖4C。

2.6 茵梔黃顆粒對膽汁淤積小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

收集小鼠腸道內(nèi)容物，16S rRNA 測序分析茵梔黃顆粒對膽汁淤積小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。

2.6.1 α 多樣性分析 采用α 多樣性分析對小鼠腸道菌群物種多樣性進行評價，見表4。結(jié)果顯示，模型組Shannon 指數(shù)，Chao 指數(shù)和Ace 指數(shù)顯著降低（P＜0.05），表明模型組小鼠腸道菌群物種多樣性顯著減少。與模型組相比，茵梔黃顆粒20 g/kg組小鼠Shannon 指數(shù)，Chao 指數(shù)和Ace 指數(shù)顯著升高（P＜0.05），表明茵梔黃顆?？梢栽黾幽懼俜e小鼠腸道菌群的物種多樣性。

表4 各組大鼠腸道菌群α 多樣性分析（，n =8）Table 4 Analysis on α diversity of intestinal flora of rats in each group (,n =8)

表4 各組大鼠腸道菌群α 多樣性分析（，n =8）Table 4 Analysis on α diversity of intestinal flora of rats in each group (,n =8)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group

2.6.2 β 多樣性分析 基于OUT（operational taxonomic units）水平的ANOSIM 分析表明，模型組小鼠的腸道菌群組成較對照組發(fā)生了顯著變化（R＝0.371 1，P＝0.001）；茵梔黃顆粒組小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)與對照組無明顯差異（R＝0.211 1，P＝0.066），而與模型組相比存在顯著差異（R＝0.146 9，P＝0.033）。NMDS 分析結(jié)果顯示，模型組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與對照組相比顯著偏離，給予茵梔黃處理能顯著恢復腸道菌群結(jié)構(gòu)，見圖5。以上結(jié)果表明，膽汁淤積小鼠的腸道菌群失調(diào)，茵梔黃顆粒能夠恢復膽汁淤積小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)。

圖5 NMDS 分析Fig.5 Non-metric multidimensional scaling

2.6.3 群落結(jié)構(gòu)分析 主坐標分析（PCoA）結(jié)果提示模型組與茵梔黃顆粒20 g/kg 組小鼠整體腸道菌群組成有顯著差異（圖6）。在門水平上，厚壁菌門、擬桿菌門和放線均門是2 組小鼠腸道菌群主要門，但在各組中組成不同。與模型組相比，茵梔黃顆粒組小鼠腸道菌群厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度降低，而放線菌門相對豐度升高。在目水平上，梭菌目、乳酸桿菌目和擬桿菌目是2 組小鼠腸道菌群主要目，與模型組相比，茵梔黃顆粒組小鼠腸道菌群中乳桿菌屬相對豐度顯著升高，梭菌目和擬桿菌目相對豐度顯著降低。在屬水平上，乳桿菌屬、羅斯氏菌屬和Allobaculum屬是2 組小鼠腸道菌群主要的屬，與模型組相比，茵梔黃顆粒組小鼠腸道菌群中乳桿菌屬相對豐度顯著升高，羅斯氏菌屬和Allobaculum屬相對豐度顯著降低（圖7、8）。

圖6 群落結(jié)構(gòu)差異分析Fig.6 Analysis of differences in community structure

圖7 門水平上各組腸道菌群相對豐度Fig.7 Relative abundance of gut microbiota at phylum level in each group

圖8 屬水平上各組腸道菌群相對豐度Fig.8 Relative abundance of gut microbiota at genus level in each group

LDA（Linear discriminant analysis）LEfSe（Effect Size）分析是一種用于發(fā)現(xiàn)和解釋高維度數(shù)據(jù)生物標識（基因、通路和分類單元）的分析工具，可用于2 個或多個分組的比較，它強調(diào)統(tǒng)計意義和生物相關(guān)性，能夠在組間尋找具有統(tǒng)計學差異的生物標識，LEfSe LDA 分析進一步證實了以上結(jié)果（圖9）。茵梔黃顆粒能夠顯著降低腸道菌群中與膽汁酸次級代謝相關(guān)Clostridium 和Bacteroides（圖10）。

圖9 LEfSe LDA 分析Fig.9 LEfSe LDA analysis

圖10 茵梔黃顆粒對膽汁淤積小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響（，n =8）Fig.10 Effect of Yinzhihuang Granules on the structure of gut microbiota in cholestasis mice (,n =8)

3 討論

中醫(yī)古書籍中并無膽汁淤積癥對應病名，近現(xiàn)代醫(yī)家根據(jù)其癥狀將其歸屬為“淤黃”“黃疸”等范疇，其病機與濕、熱、瘀有關(guān)。如《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載“溺黃赤，安臥者，黃疸，目黃者曰黃疸?！边@是對黃疸最早的論述[11]?！夺t(yī)學集成》說：“疸癥有五，曰黃汗、曰黃疸、曰谷疸、曰酒疸、曰女勞疸……同是濕熱濕寒所化，故曰治濕不利小便，非其治也。”指出濕熱為黃疸的主要病機?，F(xiàn)代醫(yī)家結(jié)合自身臨床經(jīng)驗認為，脾虛亦是發(fā)黃的潛在病機，即“濕主瘀從、黃因虛生”[12]。治療黃疸時尤為注重固護肝陰、固護胃陰、固護元氣[13]。經(jīng)過歷代醫(yī)家的實踐與總結(jié)，黃疸是由濕熱困阻脾胃，脾腎陽虛、寒濕內(nèi)停，進而血分，產(chǎn)生血瘀、血熱之證，方可發(fā)黃。故在臨床治療中，除了從濕論治，還應加以涼血化瘀、溫補脾腎之品。

茵梔黃顆粒由《傷寒論》中經(jīng)典名方“茵陳蒿湯”（茵陳蒿、梔子、大黃）經(jīng)演化而成，主要組分為茵陳、梔子、黃芩、金銀花，具有清熱解毒、利濕退黃的功效，主要用于治療肝炎、肝纖維化以及肝內(nèi)膽汁淤積[4-5,14-16]。目前臨床治療中，多與谷胱甘肽聯(lián)用治療藥物性肝損傷引起的黃疸，與亮菌甲素連用治療膽汁淤積引起的黃疸，與雙環(huán)醇聯(lián)用治療病毒性肝炎引起的黃疸[17]，但其相關(guān)分子機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，茵梔黃顆?？梢越档湍懼俜e引起的肝臟炎癥反應，減小膽汁淤積引起的肝組織壞死面積。

有報道稱，茵梔黃顆粒的主要有效成分綠原酸、黃芩苷、梔子苷和木犀草素[18]。黃芩苷能夠通過上調(diào)腸道中產(chǎn)丁酸鹽的菌群如 g_Alistipes、g_Butyricicoccus 等的豐度，維持腸道屏障完整性而發(fā)揮降壓作用[19]。祛濕化瘀方中的綠原酸和梔子苷可以通過上調(diào)擬桿菌及梭菌的相對豐度顯著而改善非酒精性脂肪性肝炎癥狀[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，茵梔黃顆粒能夠上調(diào)膽汁淤積小鼠腸道中乳桿菌相對豐度，降低梭菌和擬桿菌的含量，而且能夠降低與膽汁酸次級代謝相關(guān)的Clostridium和Bacteroides的相對豐度。

初級膽汁酸是指在肝臟中以膽固醇為原料從頭合成的膽汁酸，以膽酸和鵝去氧膽酸為主。初級膽汁酸的從頭合成包括經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路2 種途徑，分別受CYP7A1 和CYP27A1 調(diào)節(jié)[22-23]。經(jīng)典通路合成70%以上的膽汁酸，其過程包括甲基化、加氧反應、合成膽汁酸核心結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈加氫等步驟[24-25]。首先，膽固醇在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上經(jīng)過甲基化反應，產(chǎn)生甲基膽固醇，然后通過加氧反應，形成醛類物質(zhì)。醛類物質(zhì)通過多環(huán)化合成形成某種膽汁酸的核心結(jié)構(gòu)，最后進行側(cè)鏈加氫反應，生成初級膽汁酸。經(jīng)典通路以肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的CYP7A1 為主要限速酶催化發(fā)生，且FXR 負反饋調(diào)控[26-27]。初級膽汁酸在體內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)運、排泄、重吸收和代謝等多種途徑。約50%的初級膽汁酸在小腸內(nèi)被腸道吸收，重吸收的初級膽汁酸經(jīng)過肝臟代謝，轉(zhuǎn)化為次級膽汁酸，再排泄到腸道中。這一過程中，Ntcp 和Bsep是肝膽汁酸攝取和排泄過程中的2 個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)運蛋白[28]。肝細胞表面的Bsep 負責將膽汁酸運輸至膽小管，經(jīng)血液循環(huán)后，小部分被肝細胞基底膜的膽汁酸轉(zhuǎn)運體和腸道主動攝取吸收，剩余的被排泄出體外，Ntcp 則負責攝取所有的結(jié)合性膽汁酸。膽汁酸循環(huán)中任一環(huán)節(jié)受損均可能導致膽汁淤積性肝損傷的發(fā)生。茵梔黃顆粒能抑制肝組織中CYP7A1mRNA 和蛋白表達水平，上調(diào)FXR、Bsep、NtcpmRNA 和蛋白表達水平，通過抑制膽汁酸合成，促進膽汁酸代謝、轉(zhuǎn)運和重吸收而減輕膽汁酸誘導的肝損傷。

腸道菌群的分布在膽汁酸代謝中發(fā)揮著重要的作用[29-30]。在腸道中，初級膽汁酸可以被菌群代謝，進行大量的生物轉(zhuǎn)化，主要包括水解、氧化、聚合、脫硫和酯化、7α-脫羥基和7β-脫羥基等[31]。初級膽汁酸在膽汁酸輔酶A合成酶和膽汁酸氨基酸轉(zhuǎn)移酶的催化下與甘氨酸和?；撬峤Y(jié)合，形成初級結(jié)合型膽汁酸，初級結(jié)合型膽汁酸生物轉(zhuǎn)化的第1 步是由膽鹽水解酶（BSH）介導的水解去結(jié)合化，將結(jié)合膽汁酸水解為游離膽汁酸和甘氨酸或牛磺酸，BSH 高表達于Bacteroides、Enterococcus、Bifidobacterium、Clostridium、Lactobacillus和Listeria等多種腸道菌群中[32-33]。CA 和CDCA 的7α-脫羥基反應，分別產(chǎn)生DCA 和LCA；熊去氧膽酸的膽汁酸7β-脫羥基反應產(chǎn)生LCA[34]。水解后生成的初級游離型膽汁酸會經(jīng)過7α-脫羥基酶介導的7α-脫羥基化反應生成次級膽汁酸，7α-脫羥基酶僅有少數(shù)菌群產(chǎn)生，如Clostridium、Eubacterium[35-36]。除此之外，生成的次級膽汁酸還會經(jīng)過氧化、差異異構(gòu)化，主要由Peptostreptococcus、Escherichia、Bacteroides、Clostridium、Eubacterium、Eggerthella、Ruminococcus、Bifidobacterium、Lactobacillus等參與[37-40]。而酯化和脫硫作用可以促進膽汁酸通過糞便排泄，主要由Clostridium、Peptococcus、Fusobacterium、Proteobacteria、Pseudomonas、Bacteroides等參與[31,41-42]。由此可見，腸道菌群的生物轉(zhuǎn)化功能，是決定總膽汁酸池中各成分膽汁酸濃度最重要的因素，腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的不同，可以導致膽汁酸池的明顯變化。本研究發(fā)現(xiàn)，茵梔黃顆粒能夠降低腸道菌群中Clostridium和Bacteroides的含量，影響膽汁酸在腸道中的生物轉(zhuǎn)化相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠膽汁淤積時，肝組織膽汁酸合成增加，而膽汁酸轉(zhuǎn)運、重吸收和代謝降低，腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，影響膽汁酸生物轉(zhuǎn)化，改變膽汁池中各種膽汁酸的含量。茵梔黃顆粒能夠抑制肝組織中膽汁酸合成，促進膽汁酸轉(zhuǎn)運、重吸收和代謝，并通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，而改善膽汁酸成分，減輕膽汁淤積引起的肝損傷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突