劉翠翠，顧娜，王璐瑤，譚珵，李錫晶，沈洪昇，李新燕，王梅，李文暢，李冬冬，趙秀梅*

1.滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北 滄州 061000

2.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020

甲狀腺癌屬于內(nèi)分泌惡性腫瘤，在我國已成為發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一[1]。甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見的類型，可通過手術(shù)、放射性碘、促甲狀腺激素抑制進(jìn)行治療[2-5]。雖然能獲得較長時(shí)間的無疾病生存期，但是仍有部分患者在治療過程中進(jìn)展為碘難治性甲狀腺癌，生存期大大縮短，嚴(yán)重危害患者生命。因此，臨床上仍需尋找安全有效的治療藥物，來提高甲狀腺癌患者生存率，降低死亡率，改善患者的生活質(zhì)量。

微管靶向劑（MTAs）是癌癥化療中最成功的抗癌藥物。通過干擾微管蛋白聚合和解聚動(dòng)力學(xué)，影響細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和細(xì)胞信號通路，抑制細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和死亡[6-7]。美登木素作為一種高效的MTAs，可在較低濃度下殺死腫瘤細(xì)胞。1972 年，由美國植物學(xué)家Kupchan 及其同事在埃塞俄比亞和肯尼亞產(chǎn)的卵葉美登木中分離得到，并發(fā)現(xiàn)其對小鼠白血病P388 細(xì)胞、黑色素瘤B16細(xì)胞、Lewis 肺癌等有效[8]。隨后，我國科研人員在一種國產(chǎn)云南美登木中也成功提取到美登木素[9]。近年來的研究表明，美登木素對體外培養(yǎng)的人肺癌A549、鼻咽癌細(xì)胞也具有明確地抑制作用[10-11]，但其對甲狀腺癌的作用研究較少。為此，本研究以人甲狀腺乳頭狀癌B-CPAP 細(xì)胞為研究對象，探討了美登木素對甲狀腺癌的作用及機(jī)制，為其臨床上治療甲狀腺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源

人源B-CPAP 細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

1.2 藥品與試劑

美登木素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.80%，美國MCE 公司，批號95688）；SRB（美國Sigma 公司，批號S1402）；三氯乙酸（TCA，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號20190304）；Annexin-FITC 凋亡試劑盒（美國Immunoway 公司，貨號KC0001）；Procaspase-3（美國Proteintch 公司，貨號19677-IAP）；Bcl-2 抗體（美國Abcam 公司，貨號ab32124）；山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記二抗（美國Immunoway公司，貨號RS0002）。

1.3 儀器

FACSCanto II 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；Infinite M200 酶聯(lián)免疫檢測儀（瑞士Tecan 公司）；HERA Cell 150iCO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；IM 倒置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；垂直凝膠電泳儀及配套設(shè)備（美國BIO-RAD 公司）；LAS500凝膠成像一體機(jī)（美國GE 公司）。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) B-CPAP 細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d 胰酶消化傳代1 次。

1.4.2 美登木素溶液的配制 稱取美登木素2 mg，加入二甲基亞砜2.7 mL，于超聲震蕩儀中超聲2 min使充分溶解，配制成1 mmol/L 的儲備溶液。用含10%胎牛血清的RPMI1640 液稀釋成不同濃度的待測溶液。

1.4.3 SRB 法測定美登木素對B-CPAP 細(xì)胞增殖抑制率[12]取對數(shù)生長期的B-CPAP 細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)整密度為1×105個(gè)/mL，接種于96 孔板中，每孔100 μL。37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入不同質(zhì)量濃度的美登木素溶液，使其最終濃度分別為0.19、0.76、3.05、12.21、48.83、195.31、781.25、3 125 nmol/L。同時(shí)設(shè)對照組，每孔100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h 后，每孔加入50 μL 預(yù)冷的50%TCA 溶液固定，4 ℃放置1 h 后，用蒸餾水反復(fù)洗滌，空氣中自然干燥。干燥后每孔加入由冰醋酸配制的SRB 溶液100 μL，室溫中染色10 min。棄去上清液，用1%醋酸反復(fù)洗滌，空氣中自干。最后每孔加入Tris 溶液150 μL，于515 nm 處測定各孔吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.4.4 光學(xué)顯微鏡觀察美登木素對B-CPAP 細(xì)胞形態(tài)的影響 取對數(shù)生長期的B-CPAP 細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105個(gè)/mL，接種于6 孔板中，每孔2.5 mL。貼壁24 h 后，分為對照組，低、中、高濃度美登木素組。對照組用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，而低、中、高濃度美登木素組劑量分別采用48 h 半數(shù)抑制濃度（IC50）的0.05、0.5、5 倍，即終濃度為0.1、1、10 nmol/L 的美登木素溶液培養(yǎng)。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.4.5 流式細(xì)胞儀檢測美登木素對B-CPAP 細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用 參照1.4.4 項(xiàng)下，設(shè)置美登木素終濃度為0.1、1、10 nmol/L 組和對照組。于藥物作用后48 h，用不含EDTA 的胰酶消化后，2 000 r/min，離心收集細(xì)胞。用冷PBS 洗滌細(xì)胞，2 000 r/min 離心。棄去上清，取細(xì)胞沉淀重懸于1×binding buffer緩沖液中，加入Annexin V-FITC 和PI 溶液各5 μL并混勻。在避光情況下室溫孵育15 min。上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.4.6 Western blotting 法測定美登木素對B-CPAP細(xì)胞中Bcl-2、Procaspase-3 蛋白水平表達(dá)變化 參照1.4.4 項(xiàng)下，設(shè)置美登木素0.1、1、10 nmol/組和對照組。于藥物作用后48 h，棄去培養(yǎng)液，加4 ℃預(yù)冷的PBS，平放輕輕搖動(dòng)1 min 洗滌細(xì)胞。加含PMSF 的裂解液，于冰上裂解。裂解完后，用移液器將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 mL 離心管中。于4 ℃下12 000 r/min 離心。將離心后的上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL 的離心管中。BCA 法檢測蛋白濃度后，每孔蛋白上樣量20 μg，SDS-PAGE 電泳后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。以脫脂牛奶封閉PVDF 膜，TBST 緩沖液清洗后，加一抗冰箱4 ℃孵育過夜。次日用TBST 緩沖液洗膜，加二抗室溫孵育后洗膜。最后，將PVDF 膜置于凝膠成像一體機(jī)中，滴加發(fā)光液后，測定目的蛋白條帶。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 美登木素對B-CPAP 細(xì)胞增殖抑制作用

由圖1 可見，不同濃度的美登木素對B-CPAP細(xì)胞的增殖均具有不同程度的抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，抑制程度遞增，具有劑量相關(guān)性。隨著美登木素作用時(shí)間延長，抑制程度也隨之增加。24、48、72 h 的IC50分別為46.191、1.827、1.072 nmol/L，呈明顯的時(shí)間相關(guān)性。

圖1 美登木素對B-CPAP 細(xì)胞生長的影響Fig.1 Effect of maytansine on the growth of B-CPAP cells

2.2 美登木素對B-CPAP 細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組B-CPAP 細(xì)胞胞質(zhì)飽滿，呈圓形或長梭形，相鄰細(xì)胞生長融合成片。經(jīng)美登木素處理后48 h，隨著美登木素濃度增加，細(xì)胞數(shù)逐漸減少、間隙增大、細(xì)胞碎片增多、折光性變差，幾無片狀細(xì)胞生長區(qū)，見圖2。

圖2 美登木素對B-CPAP 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響（×200）Fig.2 Effect of maytansine on morphology of B-CPAP cells(×200)

2.3 美登木素對B-CPAP 細(xì)胞凋亡的影響

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，美登木素處理B-CPAP 細(xì)胞48 h 后，隨藥物濃度遞增，細(xì)胞凋亡比例也隨之增加（P＜0.05），見圖3、表1。

表1 不同濃度美登木素對B-CPAP 細(xì)胞凋亡的對比（，n =3）Table 1 Comparison of different concentrations of maytansine on apoptosis of B-CPAP cells (,n =3)

與對照組比較：*P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group

圖3 美登木素對B-CPAP 細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of maytansine on apoptosis of B-CPAP cells

2.4 美登木素對 B-CPAP 細(xì)胞中 Bcl-2、Procaspase-3 蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，經(jīng)0.1、1、10 nmol/L 美登木素處理后的B-CPAP 細(xì)胞，Bcl-2 和Procaspase-3 蛋白的表達(dá)水平隨藥物濃度的升高逐漸降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 美登木素對Bcl-2、Procaspase-3 蛋白表達(dá)的影響（，n =3）Fig.4 Effect of maytansine on the levels of Bcl-2 and Procaspase-3 protein (,n =3)

3 討論

從天然活性成分中尋找低毒、高效的藥物，一直是抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。近代藥理學(xué)研究表明，鹽酸石蒜堿、姜黃素、白藜蘆醇、小檗堿、毛蕊異黃酮、小白菊內(nèi)酯等單體成分可通過調(diào)控相關(guān)通路和蛋白在體內(nèi)外抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖[13-18]。而自發(fā)現(xiàn)美登木素以來，科研人員對美登木屬植物的化學(xué)成分及其生物活性進(jìn)行了大量研究。近年來其抗腫瘤方面的研究主要集中在肺癌和鼻咽癌，但對甲狀腺癌的研究鮮有報(bào)道。作為MTAs 中的微管聚合抑制劑即微管失穩(wěn)劑，美登木素可通過與微管蛋白的不可逆結(jié)合，使得微管自身的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，抑制微管的聚合生長，讓微管自身的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，從而妨礙細(xì)胞有絲分裂時(shí)紡錘體的形成，阻滯細(xì)胞有絲分裂，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的目的[19]。本研究采用SRB 法觀察了不同濃度的美登木素對體外培養(yǎng)的人乳頭狀甲狀腺癌B-CPAP 細(xì)胞的生長影響。結(jié)果表明，美登木素能明顯抑制該細(xì)胞增殖，并呈劑量和時(shí)間相關(guān)性。此外，美登木素對B-CPAP 細(xì)胞有顯著的凋亡誘導(dǎo)作用。且隨作用濃度的增加，細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）。

細(xì)胞凋亡指生理或病理狀態(tài)下，機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而出現(xiàn)的細(xì)胞程序性死亡。細(xì)胞凋亡水平的下調(diào)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來，細(xì)胞凋亡相關(guān)分子途徑已成為腫瘤診治策略制定及相關(guān)藥物研發(fā)的關(guān)注目標(biāo)[20]。其中Bcl-2 和Caspase-3 是抗腫瘤的有效靶點(diǎn)[21-22]。Caspase-3 是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行分子之一，正常情況下，Caspase-3以Procaspase-3 的形式存在，當(dāng)Procaspase-3 接收到凋亡信號后，被催化裂解成為Caspase-3，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由于腫瘤細(xì)胞中的Caspase-3 被抑制，無法進(jìn)行正常細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致酶原Procaspase-3 呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。因此，直接激活Procaspase-3 成為Caspase-3，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤的目的[23-25]。為了探討美登木素誘導(dǎo)B-CPAP 細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，本研究采用Western blotting 法檢測了細(xì)胞中Bcl-2 和Procaspase-3 蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，美登木素培養(yǎng)48 h 后，B-CPAP 細(xì)胞中Bcl-2 和Procaspase-3 蛋白表達(dá)較細(xì)胞對照組明顯降低。

綜上所述，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)美登木素對人乳頭狀甲狀腺癌B-CPAP 細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)調(diào)亡的活性，其作用機(jī)制可能與調(diào)控Bcl-2、Procaspase-3 蛋白表達(dá)有關(guān)，為其臨床應(yīng)用的可行性提供了充分的依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突