鐘 春,黃遠(yuǎn)虹,張?jiān)７?賴慧娟

(廣東省人民醫(yī)院贛州市立醫(yī)院,江西 贛州 341000)

在目前加強(qiáng)抗菌藥物使用的大背景下,多黏菌素等新型藥物逐步應(yīng)用于臨床,被認(rèn)為是治療耐碳青霉烯腸桿菌(CRE)感染的最后防線[1-3]。控制抗菌藥物的使用量、減少抗菌藥物選擇壓力是控制細(xì)菌耐藥性發(fā)展的主流要求[4-5]。所以,對(duì)聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物采取慎重態(tài)度尤為重要。碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌目細(xì)菌的感染性和耐藥性逐年上升,針對(duì)該病原菌的治療是臨床尤其是重癥感染患者救治的難點(diǎn)[5]。多黏菌素B是強(qiáng)效抗生素,在防微生物感染中發(fā)揮重要作用,并且是宿主免疫反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)物[6-8]。白藜蘆醇是發(fā)現(xiàn)于植物中的一大類(lèi)生物活性物質(zhì),廣泛存在于葡萄、花生等植物中,其潛在治療優(yōu)勢(shì)受到醫(yī)療領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[9]。有研究表明[10],白藜蘆醇中提取的活性成分具有一定的抗菌能力,可顯著增強(qiáng)慶大霉素、阿米卡星等藥物的抗菌作用。本研究從臨床選取100 株碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌目細(xì)菌,探討白藜蘆醇能否增強(qiáng)多黏菌素B在體外的抗菌活性,為臨床診療及合理選用抗菌藥物提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

本研究所用菌株均從臨床樣本中分離而來(lái),100 株碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌目細(xì)菌包括CRE38 株、耐碳青霉烯銅綠假單胞菌(CRPA)22 株、耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌(CRAB)40 株。本研究已獲得我院倫理委員會(huì)審批,涉及患者均獲得書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 試劑制備

白藜蘆醇與多黏菌素B均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。將白藜蘆醇與多黏菌素B分別于去離子水、二甲亞砜(DMSO)中溶解,制備濃度為10 mg/mL,100 mg/mL的試驗(yàn)試劑,用醋酸纖維素(上海源葉生物科技有限公司)0.2 μm注射過(guò)濾器進(jìn)行滅菌。將所制配原液儲(chǔ)存于-20 ℃環(huán)境中,保存時(shí)間不超過(guò)1 個(gè)月。

1.3 方法

1.3.1 最低抑菌濃度測(cè)定

采用肉湯微量稀釋方式對(duì)抗菌藥物最低抑菌濃度(MIC)進(jìn)行測(cè)定。選Mueller-Hinton肉湯(采購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)新鮮制備在96 孔微量滴定板中測(cè)MIC。設(shè)定細(xì)菌樣本最終體積200 μL,濃度5×105CFU/mL,于37 ℃孵育24 h后目視讀取微量滴定板數(shù)值記錄結(jié)果。整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程均參照2017年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)定敏感為MIC≤2 μg/mL,耐藥為MIC≥4 μg/mL。

1.3.2 棋盤(pán)試驗(yàn)

選96 孔無(wú)菌微孔板實(shí)施棋盤(pán)稀釋測(cè)定。每種抗菌藥物都用無(wú)菌Mueller-Hinton肉湯稀釋至最大濃度為藥物MIC濃度的2 倍,通過(guò)稀釋制備每種藥物8 個(gè)濃度,將50 μL適當(dāng)藥物與100 μL細(xì)菌溶液(予5×105CFU/mL最終接種物)稀釋至板孔中。MIC為無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)最低藥物濃度,根據(jù)MIC值計(jì)算出抑菌濃度指數(shù)(FIC),通過(guò)FIC評(píng)估藥物間協(xié)同作用。FIC指數(shù)=FIC(藥物A)+FIC(藥物B),其中FIC=MIC(聯(lián)合)/MIC(單獨(dú))。FIC判讀:FIC指數(shù)在0.5以內(nèi)(含0.5)為具有協(xié)同效應(yīng),FIC指數(shù)超過(guò)4.0為具有拮抗作用,FIC指數(shù)為0.5～4.0范圍內(nèi)(不含0.5)為無(wú)相互作用。

1.3.3 抑菌率曲線測(cè)定

采用微孔板生物監(jiān)測(cè)法,于96 微孔板取3 微孔為對(duì)照孔,每孔內(nèi)裝200 μL無(wú)菌培養(yǎng)液,再取3孔裝200 μL濃度1.5×1010CFU/mL細(xì)菌培養(yǎng)液,其他孔設(shè)為樣品測(cè)定孔,于測(cè)定孔內(nèi)加入200 μL 1.5×1010CFU/mL細(xì)菌培養(yǎng)液,再依次加入10 μL不同濃度藥物,在37 ℃下培養(yǎng)16 h,酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)600 nm微孔板中培養(yǎng)液吸光度(A)值,計(jì)算孔內(nèi)樣品抑菌率。抑菌率(%)AR-A/AR-AB×100%。(AR為菌液對(duì)照孔吸光度值;AB為空白對(duì)照孔吸光度值;A為樣品測(cè)定孔吸光度值)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離物

選取100 株碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌目細(xì)菌,主要包括CRE 38 株、CRPA 22 株、CRAB 40 株。其中53 株來(lái)自呼吸內(nèi)科(53%),37 株來(lái)自重癥醫(yī)學(xué)科(37%),6 株來(lái)自神經(jīng)外科(6%),4 株來(lái)自神經(jīng)內(nèi)科(4%)。

2.2 多黏菌素B單藥與白藜蘆醇聯(lián)合對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌目細(xì)菌的MIC值

通過(guò)監(jiān)測(cè)多黏菌素B單藥與白藜蘆醇聯(lián)合對(duì)CRE,CRPA,CRAB抗菌效果可知,各菌株對(duì)白藜蘆醇的MIC值均在512 μg/mL以上。加入白藜蘆醇前,100個(gè)菌株中多黏菌素B的MIC值≥4 μg/mL有90 個(gè)菌株,其他10 個(gè)菌株為2 μg/mL。加入白藜蘆醇后,分離株中針對(duì)多黏菌素B的MIC顯著降低。在CRE,CRPA,CRAB三類(lèi)菌株中,白藜蘆醇均可發(fā)揮相似作用(見(jiàn)表1)。

表1 多黏菌素B單藥及聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌目細(xì)菌的MIC值

2.3 多黏菌素B單藥與白藜蘆醇聯(lián)合對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌目細(xì)菌的FIC值

本研究選取了15 株菌株,結(jié)果發(fā)現(xiàn)15 株細(xì)菌菌株FIC指數(shù)均小于0.5,表明多黏菌素B和白藜蘆醇之間存在協(xié)同效應(yīng)(見(jiàn)表2)。

表2 多黏菌素B與白藜蘆醇FIC指數(shù)

2.4 多黏菌素B單藥與白藜蘆醇聯(lián)合抑菌率分析

不同濃度多黏菌素B+128 μg/mL白藜蘆醇時(shí),其抑菌率比單獨(dú)應(yīng)用多黏菌素B有明顯升高(見(jiàn)圖1)。

圖1 多黏菌素B與白藜蘆醇單藥及聯(lián)合抑菌率分析

3 討 論

碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌目細(xì)菌是一類(lèi)具有強(qiáng)大獲得性耐藥以及克隆、傳播能力的細(xì)菌,也是我國(guó)院內(nèi)感染的重要病原菌之一[11-12]。近年來(lái),隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,抗生素藥物的廣泛應(yīng)用,多重耐藥菌顯著上升,碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌目細(xì)菌的感染性和耐藥性也呈現(xiàn)上升趨勢(shì),針對(duì)此類(lèi)菌目治療是重癥感染患者救治的難點(diǎn)[13]。多黏菌素B是強(qiáng)效抗生素,在宿主防御微生物感染中發(fā)揮重要作用,并且是宿主免疫反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)物。多黏菌素B通過(guò)與細(xì)菌脂多糖的脂質(zhì)體A結(jié)合,改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),通透性增強(qiáng)[14-15]。有研究證實(shí)[16],多黏菌素B與其他抗生素聯(lián)合可提高藥物抗菌活性,但目前尚未對(duì)此聯(lián)合用藥方案作出統(tǒng)一規(guī)定。白藜蘆醇是一種天然抗自由基、抗氧化劑,最早從葫蘆中分離出來(lái),能夠阻止低密度脂蛋白氧化,可防治心血管疾病如高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等[17]。有學(xué)者表示[18],白藜蘆醇有一定抗菌作用,且作為天然化合物,聯(lián)合用藥安全性更有保障。本研究以上述理論為基礎(chǔ),探討了多黏菌素B與白藜蘆醇聯(lián)合在碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌目細(xì)菌中的應(yīng)用價(jià)值。

研究選取了100 株碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌目細(xì)菌,包括CRE 38 株、CRPA 22 株、CRAB 40 株。通過(guò)監(jiān)測(cè)多黏菌素B單藥與白藜蘆醇聯(lián)合對(duì)CRE,CRPA,CRAB抗菌效果可知,各菌株對(duì)白藜蘆醇的MIC值均在512 μg/mL以上,加入白藜蘆醇前,100 個(gè)菌株中多黏菌素B的MIC值≥4 μg/mL有90個(gè)菌株,其他10 個(gè)菌株為2 μg/mL。加入白藜蘆醇后,分離株中針對(duì)多黏菌素B的MIC顯著降低,且在CRE,CRPA,CRAB三類(lèi)菌株中,白藜蘆醇均可發(fā)揮相似作用。MIC值是藥物活性指標(biāo),上述結(jié)果說(shuō)明與單獨(dú)應(yīng)用多黏菌素B相比,添加白藜蘆醇能夠在某種程度上增加多黏菌素B的藥物活性,且對(duì)3 種菌株均有效果,說(shuō)明白藜蘆醇發(fā)揮的協(xié)同作用普適性較好[19-20]。通過(guò)棋盤(pán)試驗(yàn)可知,15 株細(xì)菌菌株FIC指數(shù)均小于0.5,表明多黏菌素B和白藜蘆醇之間存在協(xié)同效應(yīng)。在探討不同濃度多黏菌素B+128 μg/mL白藜蘆醇時(shí),藥物抑菌率明顯提升。