胡少華,趙振理*,萬(wàn)智盛,卜威振,陳松強(qiáng),陸毅群

(1.海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心,海南 ?？?570206;2.復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院,上海 201102)

臨床上各種原因引起的尿道狹窄、尿道缺損等是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)病。由于尿道黏膜組織有限,狹窄缺損部位的修復(fù)重建是長(zhǎng)期困擾泌尿外科醫(yī)生的一大難題。雖然有報(bào)道可應(yīng)用皮膚移植物、鞘膜、舌黏膜或頰黏膜進(jìn)行修復(fù),但往往存在取材有限,且容易引起纖維化、再狹窄、尿道瘺、結(jié)石等問(wèn)題[1-4]。再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展及組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為尿路修復(fù)提供了新的方向[5-6],進(jìn)行尿路修復(fù)的關(guān)鍵在于有足夠的種子細(xì)胞。研究[7-9]發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞(ADSCs)具有多向分化潛能,已廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué),如肌肉骨骼系統(tǒng)、心臟、角膜、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等,但轉(zhuǎn)化為尿路上皮細(xì)胞(UC)的研究相對(duì)較少,并且向UC轉(zhuǎn)化效率較低。淫羊藿總黃酮(TFE)是淫羊藿的主要活性成分,研究[10]發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)干細(xì)胞的增殖分化。TFE是否可以促進(jìn)ADSCs向UC分化目前未見(jiàn)研究?；谀壳癆DSCs向UC轉(zhuǎn)化效率低下以及TFE促干細(xì)胞增殖分化的特性,我們擬通過(guò)在ADSCs向UC分化過(guò)程中加入TFE,觀察其對(duì)增殖分化的影響,以期提高轉(zhuǎn)化效率,獲得高效穩(wěn)定的UC來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

脂肪干細(xì)胞及尿路上皮細(xì)胞由南京博恩生物技術(shù)有限公司協(xié)助制備。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

免疫印跡系統(tǒng)(伯樂(lè)公司,美國(guó));天能6600發(fā)光成像工作站(天能公司);倒置相差顯微鏡(奧林巴斯公司,日本);ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司,美國(guó));梯度PCR基因擴(kuò)增儀(生命技術(shù)公司,美國(guó));淫羊藿總黃酮(Sigma公司,美國(guó));胎牛血清(Hyclone,美國(guó));高糖型改良依格爾(DMEM)培養(yǎng)基(英杰公司,美國(guó));iScript cDNA合成試劑盒(1708891EDU)(伯樂(lè)公司,美國(guó));噻唑藍(lán)比色法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(C0009S)(碧云天公司,中國(guó)上海);抗Up-Ⅰa抗體(APC-Cy7抗體標(biāo)記檢測(cè)試劑盒)、抗Up-Ⅲ抗體(APC-Cy7抗體標(biāo)記檢測(cè)試劑盒)(Taiclone公司);抗AE1/AE3抗體(圣克魯斯生物技術(shù)公司,美國(guó));抗CK7抗體(賽默飛世爾科技公司,美國(guó));抗CD44抗體、抗波形蛋白抗體、山羊抗兔IgG抗體、兔抗小鼠IgG抗體(Abcam公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)照組:兔ADSCs與UC使用普通培養(yǎng)基在Transwell共培養(yǎng)體系中間接共培養(yǎng)7 d和14 d。

實(shí)驗(yàn)組:兔ADSCs與UC使用含TFE(根據(jù)濃度0.1 μg/mL,1 μg/mL,10 μg/mL,100 μg/mL分為四組)的培養(yǎng)基在Transwell共培養(yǎng)體系中間接共培養(yǎng)7 d和14 d。

1.2.2 兔ADSCs的誘導(dǎo)分化

將ADSCs懸液以0.5×104/cm2密度種植于Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)的下層,同時(shí)將尿路上皮細(xì)胞以1×104/cm2種植于小室的上層,按照實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)培養(yǎng)基。完成細(xì)胞分層種植后,將Transwell小室系統(tǒng)放置于37 ℃,5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱,間接共培養(yǎng)7 d和14 d。

1.2.3 MTT測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兔ADSCs以每孔5×103細(xì)胞接種于96孔板,按實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行培養(yǎng),直至細(xì)胞90%融合后,用無(wú)血清培養(yǎng)基孵育2 h使細(xì)胞同步化。隨后細(xì)胞培養(yǎng)1,3,5,7 d后,每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)孵育,孵育4 h后,將96孔板以1 500 r/min離心3 min,棄去各孔上清液,每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO),細(xì)胞振蕩儀上振蕩10 min,待結(jié)晶物充分溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在570 nm波長(zhǎng)處的吸光光度值(OD570)。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法

細(xì)胞總蛋白提取:按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行共培養(yǎng),于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集下層細(xì)胞,洗滌裂解離心后獲得細(xì)胞蛋白,采用基于銅離子還原法的蛋白定量法進(jìn)行蛋白定量。凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜:根據(jù)待測(cè)蛋白分子量的不同,配置10%或12%的分離膠和5%的壓縮膠,灌制聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)后將細(xì)胞蛋白加入泳道進(jìn)行電泳。按照聚偏二氟乙烯膜(PVDF)≥凝膠≥濾紙的原則制作轉(zhuǎn)膜“三明治”,觀察膜上蛋白。顯影:用三羥甲基氨基甲烷鹽緩沖液(TBST)將膜上殘余液體洗干凈,加入適當(dāng)濃度一抗(一抗及稀釋比見(jiàn)表1),4 ℃過(guò)夜,用三羥甲基氨基甲烷鹽緩沖液洗膜后加入適當(dāng)濃度二抗(二抗及稀釋比見(jiàn)表1),室溫孵育。等體積混合化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液與膜蛋白充分接觸,天能6600發(fā)光成像工作站進(jìn)行檢測(cè),蛋白表達(dá)量使用Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)光密度值進(jìn)行分析,蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

表1 抗體及稀釋比

1.2.5 RT-PCR

細(xì)胞mRNA提取:按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行共培養(yǎng),于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集下層細(xì)胞,每孔加入0.5 mL Trizol吹打至澄清后轉(zhuǎn)移至EP管。加入氯仿離心后取上清,沉淀RNA,取焦碳酸二乙酯水(DEPC)10 μL溶解RNA,吹打均勻后得到總RNA溶液,取2 μL樣品,使用Nanodrop 2000測(cè)定mRNA濃度和純度。cDNA合成:采用20 μL體系,在除酶的200 μLEP管中分別加入RNA 2 μL、5×iScript反應(yīng)混合液4 μL、iScript逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL、無(wú)核酸酶水13 μL,反應(yīng)后獲得cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR采用20 μL體系,將預(yù)混好的試劑加入8聯(lián)管內(nèi)封好,放入儀器內(nèi)設(shè)置參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算,所用引物見(jiàn)表2。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以means±SD表示,組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用one-way ANOVA和Tukey’s檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs培養(yǎng)與鑒定

Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CD44和Vimentin蛋白陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖1a),符合ADSCs表型,且與對(duì)照組相比,MTT顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力良好(見(jiàn)圖1b)。

(a):Western Blot檢測(cè)CD44及波形蛋白;(b):MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

2.2 尿路上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置電子顯微鏡×100鏡下觀察:脂肪干細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,尿路上皮細(xì)胞呈現(xiàn)多角形。TFE作用7 d后,對(duì)照組和0.1 μg/mLTFE組、1 μg/mL TFE組細(xì)胞出現(xiàn)局部分化現(xiàn)象,部分細(xì)胞呈多角形;10μg/mLTFE組、100 μg/mL TFE組細(xì)胞呈大面積分化,多角形樣細(xì)胞呈現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞聚集現(xiàn)象,其中100 μg/mL TFE組分化現(xiàn)象最明顯。TFE作用14 d后,與對(duì)照組相比,TFE組細(xì)胞均完全分化,ADSCs由原來(lái)的長(zhǎng)梭形變成多角形,呈尿路上皮細(xì)胞形態(tài)(見(jiàn)圖2)。

2.3 尿路上皮細(xì)胞鑒定

TFE作用14 d后,與對(duì)照組相比,0.1 μg/mL TFE組細(xì)胞中尿路上皮細(xì)胞標(biāo)記物Up-Ⅰa,Up-Ⅲ,AE1/AE3和CK7的蛋白表達(dá)水平及Up-Ⅲ的mRNA表達(dá)水平上升,但變化不明顯;1 μg/mL,10 μg/mL,100 μg/mL TFE組細(xì)胞中Up-Ⅰa,Up-Ⅲ,AE1/AE3和CK7的蛋白表達(dá)水平以及Up-Ⅲ的mRNA表達(dá)水平均顯著上升,其中TFE濃度為100 μg/mL時(shí)作用效果最好(P<0.05,P<0.01)(見(jiàn)圖3)。

(a):Up-Ⅰa,Up-Ⅲ,AE1/AE3和CK7蛋白在不同濃度淫羊藿總黃酮作用下的表達(dá)情況;(b):Up-Ⅰa蛋白在不同濃度淫羊藿總黃酮作用下的表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)分析;(c):Up-Ⅲ蛋白在不同濃度淫羊藿總黃酮作用下的表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)分析;(d):AE1/AE3蛋白在不同濃度淫羊藿總黃酮作用下的表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)分析;(e):CK7蛋白在不同濃度淫羊藿總黃酮作用下的表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)分析;(f):Up-Ⅲ mRNA在不同濃度淫羊藿總黃酮作用下的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)分析

3 討 論

尿路修復(fù)重建的關(guān)鍵在于替代材料的選擇,這也是目前尿路修復(fù)的研究熱點(diǎn)及難點(diǎn)[11]。采用自身黏膜修復(fù)由于各種并發(fā)癥及創(chuàng)傷等問(wèn)題并未獲得滿意的效果,組織工程技術(shù)及再生醫(yī)學(xué)策略提出后,在尿路重建中顯示出了巨大的應(yīng)用前景[12-13]。采用組織工程技術(shù)進(jìn)行尿路修復(fù)基本上依賴于三個(gè)方面,首先將細(xì)胞種植在所選的支架上,其次選取用作支架的生物材料,最后是局部微環(huán)境,如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等[14]。作為工程化組織的來(lái)源,種子細(xì)胞的高效穩(wěn)定獲取是進(jìn)行尿路修復(fù)的基礎(chǔ)。

干細(xì)胞作為一類具有自我更新、長(zhǎng)期生存以及在特定微環(huán)境下多向分化潛能的細(xì)胞,在組織器官的修復(fù)和重建方面具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值[15]。根據(jù)來(lái)源不同,干細(xì)胞可以分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞的分化潛能最大,但由于具有倫理學(xué)爭(zhēng)議并且可能導(dǎo)致畸胎瘤的產(chǎn)生,限制了它的應(yīng)用[12]。成體干細(xì)胞中,目前對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的研究較多,尤其是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)和ADSCs。BM-MSCs和ADSCs在特定環(huán)境下都具有向UC分化的潛能,但是與ADSCs相比,獲取BM-MSCs的方法創(chuàng)傷性大,且隨著年齡的增長(zhǎng),BM-MSCs的數(shù)量、分化潛能和生存能力降低,在長(zhǎng)期培養(yǎng)中,遺傳穩(wěn)定性較ADSCs差[16-18]。ADSCs具有良好的增殖活性及多向分化潛力,并且含量高、來(lái)源容易、可獲得性強(qiáng)、倫理問(wèn)題少[19-21]。

TFE是從淫羊藿中提取的黃酮類化合物,其主要活性成分為淫羊藿苷(ICA)。研究[22-23]發(fā)現(xiàn)它可以促進(jìn)BM-MSCs和ADSCs等多種干細(xì)胞的增殖分化。關(guān)于TFE促進(jìn)ADSCs分化主要集中在成骨/軟骨分化、創(chuàng)傷修復(fù)等,TFE是否能夠促進(jìn)ADSCs向UC的分化目前研究較少。因此,為了研究TFE在ADSCs向UC轉(zhuǎn)化中的作用,我們采用隔離共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)ADSCs向UC分化,培養(yǎng)14 d后出現(xiàn)UC特有的細(xì)胞標(biāo)記(Up-Ⅰa,Up-Ⅲ,AE1/AE3和CK7),證明ADSCs向尿路細(xì)胞進(jìn)行了分化。本研究在培養(yǎng)基中添加不同濃度的TFE,對(duì)比發(fā)現(xiàn)UC特有的細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,并且在TFE濃度為100 μg/mL時(shí)作用效果最好,提示TFE可以促進(jìn)ADSCs向UC的增殖分化,并且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性。

基于ICA的促干細(xì)胞轉(zhuǎn)化特性,我們將其應(yīng)用于目前研究相對(duì)較少的ADSCs向UC的轉(zhuǎn)化中。間接共培養(yǎng)的方法常用于誘導(dǎo)分化的生長(zhǎng)因子不明確時(shí),分化的關(guān)鍵在于細(xì)胞旁分泌機(jī)制對(duì)鄰近干細(xì)胞分化的調(diào)控,因此我們推測(cè)ICA主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的旁分泌來(lái)促進(jìn)了ADSCs向UC的轉(zhuǎn)化。有研究者[24]認(rèn)為miR-33a可能是轉(zhuǎn)化過(guò)程中一個(gè)重要靶點(diǎn),然而,目前精確的分子調(diào)控機(jī)制還處于探索階段。ADSCs有效的UC分化依賴于條件介質(zhì)的使用。本實(shí)驗(yàn)顯示ICA為轉(zhuǎn)化的有效條件介質(zhì),提高了轉(zhuǎn)化效率,為UC的高效、穩(wěn)定獲得提供了新的途徑,由此可以獲取穩(wěn)定的種子細(xì)胞來(lái)源,為后續(xù)將其聯(lián)合支架用于尿路修復(fù)實(shí)驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。在本實(shí)驗(yàn)中,我們根據(jù)既往研究基礎(chǔ)將TFE按濃度進(jìn)行分組,結(jié)果顯示濃度為100 μg/mL時(shí)作用效果最好,但未選取更高濃度的TFE觀察其作用效果,存在一定的不足。我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步分析濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響,并進(jìn)一步探討TFE提高轉(zhuǎn)化效率的精確分子機(jī)制。