鄒蘭 王茜 李慕儀 葉坤浩 黃晶

（1. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010；2. 綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院中藥材研究所，綿陽(yáng) 621023）

烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）是毛茛科（Ranunculaceae）烏頭屬（Aconitum）多年生草本藥用植物，其主根（母根）稱烏頭，子根稱泥附子［1］。烏頭常用入藥部位為其子根加工品，又稱附子。附子具補(bǔ)火助陽(yáng)、回陽(yáng)救逆、散寒止痛等藥理作用，被譽(yù)為回陽(yáng)救逆第一品［2］。四川江油是烏頭道地產(chǎn)區(qū)［3］，其產(chǎn)品除滿足國(guó)內(nèi)需求，還遠(yuǎn)銷英國(guó)、日本、韓國(guó)等國(guó)家，國(guó)際國(guó)內(nèi)對(duì)烏頭產(chǎn)品需求量仍逐年增加［2］。生產(chǎn)上，烏頭采用塊根無(wú)性繁種，種植過(guò)程中受白絹病等土傳真菌病害的嚴(yán)重威脅。如在道地產(chǎn)區(qū)，白絹病可使烏頭減產(chǎn)30%-60%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70%-80%，甚至絕產(chǎn)［4］。由于抗病品種缺乏，化學(xué)農(nóng)藥施用是藥農(nóng)防治烏頭白絹病的主要措施，由此帶來(lái)環(huán)境污染、農(nóng)殘及重金屬超標(biāo)以及病原菌耐藥性等系列問(wèn)題。烏頭白絹病病原菌為齊整小核菌（Sclerotium rolfsii），有性態(tài)為羅氏阿太菌（Athelia rolfsii），但有性態(tài)在自然界極為少見(jiàn)［5］。S. rolfsii可以侵染超過(guò)600種植物，導(dǎo)致白絹病、枯萎病、腐爛病的發(fā)生，對(duì)作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［6］。菌核是S. rolfsii存在和傳播的主要方式，可以在土壤中存活很長(zhǎng)時(shí)間，且對(duì)極端環(huán)境耐受性極強(qiáng)，因而化學(xué)農(nóng)藥對(duì)該菌的防治效果不佳［6］。因此，烏頭土傳病害亟需高效、安全、綠色可持續(xù)防治方法。

生物防治，利用有益微生物拮抗、捕食、競(jìng)爭(zhēng)或激發(fā)植物系統(tǒng)性抗性等方式抑制病原菌生長(zhǎng)或侵染植物，經(jīng)濟(jì)、安全且高效，是土傳病害防治的研究熱點(diǎn)［7］。生防菌的篩選是生物防治的關(guān)鍵。植物內(nèi)生菌因其生活周期的全部或部分定殖在植物體內(nèi)，與植物協(xié)同進(jìn)化，其可通過(guò)分泌酶類、抗菌素、揮發(fā)性氣體等次生代謝產(chǎn)物、與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生態(tài)位點(diǎn)或者激發(fā)植物系統(tǒng)性抗性等方式保障植物健康，是生防菌的重要資源庫(kù)［8］。部分內(nèi)生菌可隨植物縱向遺傳，這對(duì)抗病植物育種具有重要意義［9］。烏頭內(nèi)生菌的研究集中在其多樣性［10］、分泌生物堿［11-12］等方面，以烏頭內(nèi)生細(xì)菌為生防材料防治土傳病害的研究比較匱乏。因此本研究從健康烏頭植株分離內(nèi)生細(xì)菌，篩選具有高效抑菌能力的菌株，結(jié)合室內(nèi)試驗(yàn)和大田試驗(yàn)研究其生防和促生潛力，并探究其作用機(jī)制，旨在為烏頭土傳病害生物防治提供優(yōu)良菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 烏頭植物：健康烏頭植株采自烏頭道地產(chǎn)區(qū)四川省江油市三合鎮(zhèn)（31°49′44′ N，104°47′04′ E，海拔550 m）。烏頭品種為綿附1號(hào)，由綿陽(yáng)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育和保存。用鐵鍬沿著植物根部方向挖出整株植物，注意不要造成物理性傷口，抖掉根部土壤。植株裝入無(wú)菌塑料袋，24 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

供試病原真菌：烏頭白絹病病原菌Sclerotium rolfsii?1由西北農(nóng)林科技大學(xué)分離鑒定和提供，S.rolfsii?2由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。烏頭根腐病病原菌Fusarium oxysporum?1和F. oxysporum?2由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB（Luria?Bertani）瓊脂培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，瓊脂12，pH 7.0-7.2；LB液體培養(yǎng)基為L(zhǎng)B瓊脂培養(yǎng)基不加瓊脂。PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂12。羧甲基纖維素（carboxymcthyl cellulose, CMC）培養(yǎng)基（g/L）：羧甲基纖維素鈉10，蛋白胨10，NaCl 10，酵母粉5，瓊脂粉12，pH 7.0-7.2；蛋白質(zhì)培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨5，酵母粉2.5，葡萄糖1，脫脂牛奶7%，瓊脂粉12，pH 7.0-7.2；葡聚糖培養(yǎng)基（g/L）：K2HPO41，酵母粉5，蛋白胨10，葡聚糖5，MgSO4·7H2O 0.1，剛果紅0.4，瓊脂粉12，pH 7.0-7.2。

1.2 方法

1.2.1 烏頭內(nèi)生細(xì)菌的分離 將烏頭植株用自來(lái)水沖洗掉沙土和塵埃，將植株不同組織（根、莖、葉）切成1 cm左右大小，并進(jìn)行表面消毒。先用75%的酒精浸泡5 min，用無(wú)菌水清洗3次；接著用2%次氯酸鈉（有效氯含量）浸泡8 min，用無(wú)菌水清洗5次。吸取最后一次清洗液（100 μL）涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)7 d，無(wú)菌落產(chǎn)生則表示表面消毒徹底，樣品用于內(nèi)生菌的分離。將樣品在無(wú)菌粉碎機(jī)中粉碎，挑取樣品勻漿或粉末均勻接種在LB瓊脂培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)7 d，選取生長(zhǎng)在樣品附近的菌落于新的LB瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純化（至少3次）直至獲得純菌株。

1.2.2 菌株拮抗病原菌能力測(cè)定

1.2.2.1 平板對(duì)峙試驗(yàn) 候選細(xì)菌菌株接種在LB瓊脂培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)直至出現(xiàn)單菌落，挑取單菌落于無(wú)菌水中制成菌懸液。供試病原菌接種至PDA培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基備用。將病原菌菌餅（直徑2 mm）接種至新的PDA培養(yǎng)基中央，在距菌餅2 cm處沿4個(gè)方向點(diǎn)接種候選細(xì)菌菌懸液（10 μL），于25℃恒溫培養(yǎng)7 d后測(cè)定病原菌菌落直徑大小。以病原菌同時(shí)接種無(wú)菌水為對(duì)照。

1.2.2.2 烏頭切片對(duì)峙試驗(yàn) 選取新鮮健康無(wú)物理性傷口的烏頭或其子根，切成1 cm厚的薄片并進(jìn)行表面消毒處理（同1.2.1）。將切片放置在無(wú)菌培養(yǎng)皿的無(wú)菌濕潤(rùn)濾紙上，將供試細(xì)菌菌懸液（同1.2.2.1）接種至切片中間，干燥后接種病原菌菌餅。培養(yǎng)皿用parafilm封口，于25℃恒溫培養(yǎng)7 d后測(cè)定病原菌菌落直徑大小。以病原菌同時(shí)接種無(wú)菌水為對(duì)照。菌株對(duì)病原菌的抑制率采用以下公式進(jìn)行計(jì)算: 抑菌率（%）=（對(duì)照組病原菌菌落直徑-處理組病原菌菌落直徑）/對(duì)照組病原菌菌落直徑 × 100%

1.2.3 菌株分類地位鑒定 挑取供試菌株單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。采用細(xì)菌DNA提取試劑盒（Rapid Bacterial Genomic DNA Isolation Kit）提取菌株總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA質(zhì)量。對(duì)4個(gè)持家基因16S rRNA、atpD、gyrA和rpoB進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：2 × Mix 12.5 μL，10 μmol/mL的Primers F 1 μL，10 μmol/mL的Primers R 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增用引物和程序如表1所示。擴(kuò)增PCR片段采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用DNA回收試劑盒進(jìn)行純化，純化后的DNA片段送至北京擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序。所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)并選取參比菌株（若參比菌株已知全基因組信息，則從中選擇目標(biāo)基因序列用于后續(xù)建樹分析）。采用Mega X Cluster W對(duì)供試菌株序列和參比菌株序列進(jìn)行單基因和多基因序列比對(duì)，采用Neighbor?Joining法構(gòu)建單基因和多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 持家基因擴(kuò)增用引物及反應(yīng)程序Table 1 Primers and reaction procedure for housekeeping genes

1.2.4 菌株對(duì)病原菌的拮抗機(jī)理

1.2.4.1 菌株無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)、菌核形成和萌發(fā)的影響 將白絹病病原菌S. rolfsii?1接種至PDA培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)9 d直至獲得成熟菌核，搜集菌核備用。將供試菌株接種至LB固體培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)直至出現(xiàn)單菌落，挑取單菌落于100 mL LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d。采用一次性微孔濾膜（直徑0.22 μm）將菌株發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾除菌獲得無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液。將無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液與溫?zé)岬臒o(wú)菌PDA培養(yǎng)基混合（V∶V=1∶4）并制作平板，獲得含無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液的PDA混合培養(yǎng)基。以含無(wú)菌LB液體培養(yǎng)的PDA混合培養(yǎng)基為對(duì)照。將病原菌菌餅或菌核（12個(gè)/皿）接種至混合培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)9 d，觀察病原菌菌絲生長(zhǎng)、菌核形成數(shù)量以及菌核萌發(fā)數(shù)量。

1.2.4.2 菌株功能基因PCR擴(kuò)增 選取脂態(tài)（lipopeptides）、二肽類（dipeptide）和聚酮類化合物（polyketides）相關(guān)功能基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，包括ituC、fenB、fenD、srfAA、bmyB、bacA、baeA和mnlA。PCR擴(kuò)增用體系、引物和程序參照Ben Khedher等［13］方法。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 菌株促生能力測(cè)定

1.2.5.1 菌株產(chǎn)IAA能力測(cè)定 采用Salkowski比色法測(cè)定菌株產(chǎn)吲哚乙酸（indoleacetic acid, IAA）的能力［14］。挑取菌株單菌落接種至含1 mL L?色氨酸（2.5 mg/mL）的LB液體培養(yǎng)基（5 mL），28℃恒溫培養(yǎng)2 d，離心取上清液（2 mL）加入4 mL Salkowski比色液［1 mL 0.5 mol/L FeCl3, 49 mL HClO4（35%, V∶V）］，室溫暗處理30 min后在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。配置不同濃度的IAA標(biāo)準(zhǔn)樣品（0，5，10，20，40，60 mg/L），遵照上述方法測(cè)定吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算候選菌株產(chǎn)IAA的含量。

1.2.5.2 菌株分泌鐵載體能力測(cè)定 CAS染色液配置：將溶于10 mL雙蒸水中的0.012 g鉻天青與FeCl3·6H2O溶液（2 mL 1 mmol/L）混合均勻獲得溶液a；0.015 g十六烷基三甲基溴化銨溶于8 mL雙蒸水，獲得溶液b；在不停攪拌的情況下將a液緩慢加到b液中，混合均勻，115℃滅菌20 min，即獲得CAS染色液。配置10 × MM9溶液：Na2HPO430 g，KH2PO41.5 g，NaCl 2.5 g，NH4Cl 5 g，雙蒸水補(bǔ)足500 mL。CAS培養(yǎng)基：100 mL 10 × MM9溶液,1 mL CaCl2（1 mmol/L）, 20 mL MgSO4（1 mmol/L），10 mL葡萄糖（20%），30 mL酪蛋白氨基酸溶液（10%），100 mL CAS染色液，瓊脂粉12 g，去離子雙蒸水補(bǔ)足1 000 mL，pH 6.8-7.0。挑取供試菌株單菌落于1 mL無(wú)菌水制成菌懸液，點(diǎn)接種（10 μL）在CAS培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)3 d，每個(gè)處理3次重復(fù)，觀察是否產(chǎn)生橙色透明圈。

1.2.5.3 菌株產(chǎn)酶能力測(cè)定 挑取供試菌株單菌落于1 mL無(wú)菌水制成菌懸液，分別點(diǎn)接種（10 μL）在CMC培養(yǎng)基、蛋白質(zhì)培養(yǎng)基和葡聚糖培養(yǎng)基，每個(gè)處理3次重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察是否有透明圈存在。CMC培養(yǎng)基用剛果紅（1%）溶液染色，觀察是否有透明圈存在。

1.2.6 大田試驗(yàn) 大田試驗(yàn)在西南科技大學(xué)試驗(yàn)基地進(jìn)行（31°32′01′ N，104°41′43′ E，海拔470 m），該基地已經(jīng)連續(xù)3年種植烏頭，土壤類型為水稻土，烏頭品種為綿附1號(hào)。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，每個(gè)小區(qū)（2.0 m × 3.7 m=3.7 m2）種植200株植物，株距15 cm, 行距25 cm。挑取供試菌株單菌落接種于1 L LB液體培養(yǎng)基，28℃，150 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期獲得發(fā)酵液。烏頭修根時(shí)（4月下旬），采用無(wú)菌注射器接種發(fā)酵液（10 mL, 1 × 109CFU/mL）于烏頭根部傷口處，并覆土。無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，接種時(shí)間、接種量和方法同菌株發(fā)酵液處理。每個(gè)處理接種100株，3次重復(fù)。接種菌株發(fā)酵液后每7 d調(diào)查統(tǒng)計(jì)白絹病發(fā)病植株數(shù)量。發(fā)病烏頭植株表現(xiàn)為地上部萎焉、枯萎甚至死亡，地下部及其周圍土壤存在白色病原菌菌絲、白色或黑色菌核。烏頭收獲時(shí)（6月初），每個(gè)小區(qū)每個(gè)處理隨機(jī)選取5株健康植株，測(cè)定烏頭、子根、莖鮮重和干重。烏頭白絹病田間發(fā)病率和菌株生防效率采用以下公式進(jìn)行計(jì)算：

白絹病發(fā)病率（%）=發(fā)病植株數(shù)量/調(diào)查總植株數(shù) × 100%

生防率（%）=（對(duì)照組發(fā)病率-處理組發(fā)病率）/對(duì)照組發(fā)病率 × 100%

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，應(yīng)用t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)表示差異顯著。采用Excel 2016和SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，采用Origin 2022制圖。16S rRNA、atpD、rpoB和gyrA基因序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)分別為：OQ940466, OQ954435, OQ954437和OQ954430。

2 結(jié)果

2.1 拮抗菌株的分離篩選

從健康烏頭植株分離獲得內(nèi)生細(xì)菌111株。采用平板對(duì)峙和烏頭切片對(duì)峙篩選到1株顯著抑制白絹病病原菌和根腐病病原菌的烏頭內(nèi)生細(xì)菌JY?3?1R（圖1）。如表2所示，在PDA平板上，JY?3?1R對(duì)S.rolfsii的抑制率高達(dá)53.13%，對(duì)F. oxysporum的抑制率高達(dá)52.07%。在烏頭切片上，JY?3?1R對(duì)S. rolfsii的抑制率高達(dá)49.68%，對(duì)F. oxysporum的抑制率高達(dá)46.30%（表2）。因此，JY?3?1R作為后續(xù)試驗(yàn)供試材料，探究其分類地位、促生和生防潛力。

圖1 JY-3-1R對(duì)病原真菌的抑制效果Fig. 1 Inhibition effects of JY-3-1R against pathogenic fungi

表2 JY-3-1R對(duì)病原真菌的抑制效果Table 2 Inhibition effects of JY-3-1R against pathogenic fungi

2.2 JY?3?1R分類地位鑒定

對(duì)JY?3?1R 16S rRNA、atpD、gyrA和rpoB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得一條1 500 bp、600 bp、750 bp、560 bp的目標(biāo)條帶?；?6S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明，JY?3?1R與芽孢桿菌聚為一個(gè)分支（圖2?A），相似度為99.72%?；赼tpD?gyrA?rpoB的聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，JY?3?1R與解淀粉芽孢桿菌聚為一個(gè)分支（圖2?B），相似度達(dá)98.05%。因此，JY?3?1R鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

圖2 JY-3-1R基于16S rRNA（A）和gyrA-rpoB-atpD多位點(diǎn)持家基因（B）的系統(tǒng)發(fā)育研究Fig. 2 Phylogenetic analysis of JY-3-1R based on 16S rRNA gene（A）and multi-locus sequence analysis of gyrA, rpoB and atpD genes（B）

2.3 JY?3?1R對(duì)S. rolfsii的拮抗機(jī)理

2.3.1 JY?3?1R無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液對(duì)S. rolfsii生長(zhǎng)、菌核形成和萌發(fā)的影響 如圖3?A所示，對(duì)照處理的S. rolfsii菌絲在72 h時(shí)幾乎長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基，在120 h左右開始出現(xiàn)白色菌絲球，在192 h左右形成褐色成熟菌核。JY?3?1R無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液在216 h內(nèi)均完全抑制S. rolfsii的生長(zhǎng)（抑制率100%）。對(duì)照處理的S.rolfsii菌核在48 h內(nèi)開始萌發(fā)，72 h菌核萌發(fā)形成肉眼可見(jiàn)菌絲體。而JY?3?1R無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液處理的S. rolfsii菌核在120 h仍不萌發(fā)，對(duì)菌核萌發(fā)抑制率為100%（圖3?B）。

圖3 JY-3-1R無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液對(duì)齊整小核菌菌絲生長(zhǎng)和菌核萌發(fā)的影響Fig. 3 Effects of cell-free culture filtrate of JY-3-1R on the hyphal growth and sclerotia germination of S. rolfsii

2.3.2 JY?3?1R抑病相關(guān)功能基因擴(kuò)增 以JY?3?1R基因組DNA為模板，成功擴(kuò)增到8個(gè)功能基因包括ituC（594 bp）、fenB（670 bp）、fenD（269 bp）、srfAA（201 bp）、bmyB（370 bp）、bacA（500 bp）、baeA（688 bp）、mnlA（668 bp）（圖4）。

圖4 JY-3-1R功能基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳Fig. 4 Gel electrophoresis of JY-3-1R functional genes by PCR amplification

2.4 JY?3?1R產(chǎn)IAA、鐵載體和分泌酶能力

Salkowski比色檢測(cè)結(jié)果表明，JY?3?1R能分泌IAA，其分泌量為2.86 mg/L。接種JY?3?1R菌懸液至CAS培養(yǎng)基后在菌落附近檢測(cè)到橙黃色透明圈，說(shuō)明JY?3?1R具分泌鐵載體的能力。利用底物降解平板培養(yǎng)法，JY?3?1R具分泌蛋白酶、纖維素酶和葡聚糖酶的能力（圖5）。

圖5 JY-3-1R產(chǎn)IAA、鐵載體和分泌酶類能力Fig. 5 Abilities of JY-3-1R producing IAA, siderophore,and secretases

2.5 JY?3?1R對(duì)烏頭白絹病的田間防治效果評(píng)價(jià)

隨著時(shí)間增加，不接菌處理（對(duì)照組）烏頭植株白絹病發(fā)病率持續(xù)增加，在第7天、14天、21天和30天的白絹病發(fā)病率分別為10.83%、25.83%、32.50%和54.17%。JY?3?1R發(fā)酵液接種后第7天、14天、21天和30天后的烏頭植株的白絹病發(fā)病率分別為1.67%、5.00%、12.50%和15.83%。從第14天開始，JY?3?1R接種處理的烏頭白絹病發(fā)病率顯著低于對(duì)照組處理（圖6）。JY?3?1R對(duì)烏頭白絹病的生防效率為61.53%-84.61%。

圖6 JY-3-1R對(duì)烏頭白絹病的田間防病效果Fig. 6 Biocontrol potential of JY-3-1R against southern blight by field experiment

2.6 JY?3?1R對(duì)烏頭生長(zhǎng)的影響

烏頭收獲后，測(cè)定烏頭植株莖、主根（烏頭）及子根鮮重和干重，比較分析JY?3?1R對(duì)烏頭生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，JY?3?1R接種處理的植株莖和烏頭的鮮重和干重分別為37.68、9.35、28.43和5.77 g/株，顯著高于對(duì)照組烏頭（表3），分別比對(duì)照組增加34.67%、34.34%、46.24%、82.59%。JY?3?1R接種處理子根鮮重為77.17 g/株，比對(duì)照組處理（48.54 g/株）增加58.98%。JY?3?1R處理子根干重為20.01 g/株，比對(duì)照組（12.82 g/株）高出56.08%。

表3 JY-3-1R對(duì)烏頭生長(zhǎng)的影響Table 3 Plant growth promoting effect of JY-3-1R on A.carmichaelii

3 討論

利用有益微生物防治作物土傳病害已成為農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的重要手段。常用來(lái)防治土傳白絹病的有益微生物包括木霉菌、假單胞菌、芽孢桿菌等，已在大豆、花生、甜菜等經(jīng)濟(jì)作物相繼報(bào)道［15-17］。分離自草莓根際土的灰黃青霉菌（Penici?llium griseofulvum）、密旋鏈霉菌（Streptomyces pact?um）和婁徹氏鏈霉菌（S. rochei）對(duì)陜西地區(qū)烏頭根腐病和白絹病有一定的抑制作用［5,18］。然而利用烏頭內(nèi)生菌防治土傳白絹病的研究仍比較匱乏。因此，本研究從烏頭道地產(chǎn)區(qū)采集健康植株，分離烏頭內(nèi)生細(xì)菌，篩選到一株顯著抑制白絹病病原菌S.rolfsii和根腐病病原菌F. oxysporum的菌株JY?3?1R。基于16S rRNA和多位點(diǎn)持家基因（atpD、rpoB和gyrA）聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果表明JY?3?1R為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。研究指出，解淀粉芽孢桿菌在植物病害防治方面有著巨大潛力，如分離自人參根際土的B. amyloiuquefaciens FG14 對(duì)人參銹蝕根腐病病原菌Ilyonectria robusta的抑制率高達(dá)90%［19］；B. amyloliquefaciens YZU?SG146對(duì)棉花黃萎病病原菌Verticillium dahliae具有顯著抑制效果，盆栽試驗(yàn)中對(duì)該病的生防效率達(dá)84.2%，同時(shí)對(duì)Sclerotium、Alternaria、Rhizoctonia、Fusarium等多種病原菌具有抑制作用［20］。

菌核是S. rolfsii傳播和侵染植物的主要形式，菌核在適宜條件下萌發(fā)成菌絲并侵染植物，因而高效生防菌的篩選應(yīng)考慮其對(duì)S. rolfsii菌核萌發(fā)的抑制作用。灰黃青霉菌P. griseofulvum CF?3無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液在48 h 內(nèi)對(duì)S. rolfsii菌核萌發(fā)的抑制率為44.2%，但在96 h時(shí)，該抑制率下降至8.3%［5］。分離自棗椰樹的B. velezensis NC318對(duì)S. rolfsii有顯著抑制作用，其細(xì)胞發(fā)酵濾液對(duì)S. rolfsii菌絲生長(zhǎng)抑制率高達(dá)97%，對(duì)S. rolfsii菌核萌發(fā)的抑制率為46.78%，該抑制效果可持續(xù)10 d［21］。B.amyloliquefaciens JY?3?1R及其無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液對(duì)S.rolfsii菌絲生長(zhǎng)和菌核萌發(fā)菌有顯著的抑制作用，特別是該菌的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液對(duì)病原菌菌絲和菌核萌發(fā)的抑制作用達(dá)到100%，該抑制作用可持續(xù)至少120 h。對(duì)比結(jié)果表明JY?3?1R對(duì)S. rolfsii表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，具有較好的生防潛力。

B. amyloliquefaciens對(duì)病原菌的拮抗機(jī)制包括分泌具抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物、與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或生態(tài)位點(diǎn)以及激發(fā)植物系統(tǒng)性抗性［22］。其中，分泌抑菌代謝物質(zhì)拮抗病原菌是生防菌防治土傳病害的重要作用機(jī)制，該機(jī)制常作為室內(nèi)生防菌初步篩選的重要指標(biāo)，抑菌產(chǎn)物的分離和鑒定對(duì)生防菌肥的研制和使用也具有重要意義［23-25］。JY?3?1R無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液完全抑制S. rolfsii菌絲生長(zhǎng)和菌核萌發(fā)（抑制率100%），說(shuō)明該菌分泌了具較強(qiáng)抑菌活性的代謝產(chǎn)物。為進(jìn)一步挖掘JY?3?1R可能分泌的抑菌代謝產(chǎn)物，本研究對(duì)其抑菌相關(guān)功能基因進(jìn)行了擴(kuò)增。結(jié)果表明，JY?3?1R基因組包含ituC、fenB、fenD、srfAA、bmyB、bacA、baeA和mnlA相關(guān)功能基因。其中ituC基因參與伊枯草菌素（iturin）的合成，fenB和fenD基因參與豐原素（fengyin）的合成，srfAA參與表面活性素（surfactin）的合成，bmyB參與芽孢菌霉素（bacillomycin）的合成，以上物質(zhì)歸屬于環(huán)狀脂態(tài)（cyclic lipopeptides），對(duì)病原真菌和細(xì)菌具有很強(qiáng)的拮抗作用［13,22］。bacA基因參與桿菌溶素（bacilysin）的合成，baeA參與桿菌烯（bacillaene）的合成，而mnlA參與大環(huán)內(nèi)酯（macrolactin）的合成，這些物質(zhì)歸屬于聚酮類化合物，對(duì)病原真菌和細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制作用［13,22］。因而我們推測(cè)JY?3?1R不僅能抑制真菌性病原菌，對(duì)病原細(xì)菌也具有一定的抑制作用。此外，本研究證實(shí)JY?3?1R可以分泌蛋白酶、葡聚糖酶和纖維素酶，這些酶類可以直接作用于病原真菌的細(xì)胞壁，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)含物流失，進(jìn)而殺死病原菌［26-27］。研究指出生防菌可通過(guò)分泌鐵載體與病原菌競(jìng)爭(zhēng)土壤中的鐵元素，進(jìn)而抑制病原菌生長(zhǎng)［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，JY?3?1R具分泌鐵載體的能力，其也可能通過(guò)分泌鐵載體在土壤環(huán)境抑制病原菌的生長(zhǎng)，但其分泌鐵載體的種類及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。綜上所述，JY?3?1R對(duì)S. rolfsii的拮抗機(jī)理主要為其分泌了具抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物，包括環(huán)狀脂態(tài)和聚酮類化合物、酶類、鐵載體等物質(zhì)，以上代謝產(chǎn)物的鑒定和作用機(jī)制的解析將有利于探究JY?3?1R對(duì)S. rolfsii的抑制機(jī)理和新型生防材料的挖掘。

由于JY?3?1R對(duì)病原菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，本研究進(jìn)一步探究了JY?3?1R在大田條件下對(duì)烏頭白絹病的生防和促生效果。大田條件往往比室內(nèi)和溫室環(huán)境更為復(fù)雜，特別是環(huán)境中數(shù)量和種類繁多的土著微生物往往會(huì)抑制生防菌生長(zhǎng)，因而有些在室內(nèi)具有抑菌作用的菌株在田間往往效果不理想［7,29］。然而JY?3?1R在大田條件下對(duì)白絹病具有顯著的防治效果，生防率為61.53%-84.61%，生防能力可以持續(xù)30 d，相對(duì)于對(duì)照處理，JY?3?1R接菌處理可降低白絹病發(fā)病率近40%。研究指出，在陜西地區(qū)，P. griseofulvum CF3和放線菌菌絲粉末施用土壤后，降低約20%的烏頭白絹病發(fā)病率［5,18］。雖然陜西和四川江油生態(tài)環(huán)境可能存在差異，但JY?3?1R在烏頭道地產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)出較好的生防潛力。此外，該菌還顯著提高了烏頭植株莖、主根和子根的生物量，表現(xiàn)出較強(qiáng)的促生能力。其促生能力可能由于該菌可以分泌IAA和鐵載體。IAA為植物生長(zhǎng)激素，促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)增，是植物生長(zhǎng)的重要調(diào)控因子［30］。鐵元素是植物生長(zhǎng)的重要元素，但土壤中有效鐵的含量往往較低［28,31］。微生物可以通過(guò)分泌鐵載體吸收土壤中的鐵元素，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)［31］。

4 結(jié)論

本研究從健康烏頭植株分離到1株內(nèi)生細(xì)菌JY?3?1R，該菌對(duì)白絹病和根腐病病原菌具有顯著抑制作用，大田試驗(yàn)證實(shí)該菌可以顯著降低烏頭白絹病發(fā)病率并提高烏頭植株生物量，表現(xiàn)出較好的生防和促生潛能，其潛在作用機(jī)制包括分泌酶類、環(huán)酯類化合物、聚酮類化合物、鐵載體及IAA。JY?3?1R被鑒定為解淀粉芽孢桿菌，具有開發(fā)為促進(jìn)烏頭生長(zhǎng)和防治烏頭白絹病的生物肥料和生防材料的潛力。