白苗 田雯青 武帥 王敏 王利祥 岳愛琴 牛景萍 張永坡高春艷 張武霞 郭數(shù)進 杜維俊 趙晉忠

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，太谷 030801；2. 山西農(nóng)業(yè)大學基礎部，太谷 030801；3. 山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，太谷 030801）

維生素E又名生育酚［1］，能夠抗不孕、抗氧化、保持紅細胞完整性、調(diào)節(jié)體內(nèi)DNA的生物合成，是最主要的抗氧化劑之一。天然維生素E廣泛存在于各種油料種子及植物油中。大豆中維生素E含量約為18.90 mg/100 g，遠遠超過所有谷類食品［2］。膳食中，維生素E的主要來源就是大豆［3-4］。維生素E是光合產(chǎn)物α-、β-、γ-和δ-生育酚的總稱，它們都有抗氧化特性，由于人類肝臟中有α-生育酚轉移蛋白，所以α-生育酚具有最高的相對維生素E活性（100%），β-、γ-和δ-生育酚的維生素E活性分別為50%、10%和3%。γ-生育酚甲基轉移酶（γ-TMT）催化δ-和γ-生育酚轉化為β-和α-生育酚，是決定植物維生素E組分及活性的關鍵酶之一［5］。

維生素E在作物生長發(fā)育抵御逆境脅迫發(fā)揮重要作用，在改善動物和人類內(nèi)臟功能，保持生物體健康方面的研究非常多。目前，關于大豆籽粒維生素E含量積累研究相對較多，例如，氣候條件［6-7］、稀土鑭、鈰［8］對大豆籽粒維生素E組分含量及品質的影響、大豆維生素E組分含量特異種質的鑒定及優(yōu)異種質資源的挖掘［9］等，而對于維生素E響應激素和逆境脅迫的研究相對較少。通過對模式植物擬南芥外源噴施5 mmol/L維生素E發(fā)現(xiàn)，經(jīng)處理的擬南芥單株種子產(chǎn)量顯著高于野生型擬南芥，且提升了擬南芥的抗氧化能力［10-11］，表明根莖葉中維生素E組分含量與植物抗逆性有關。Cela等［12］和Casadesús等［13］發(fā)現(xiàn)在擬南芥乙烯信號傳導（EIN3?1）、感知（ETR1?1）和乙烯過量產(chǎn)生（ETO1?1）的突變體中，EIN3?1的突變延遲了α-生育酚與水分脅迫相關基因的增加，并導致α-生育酚水平降低約30%，而ETR1?1和ETO1?1突變體在葉片老化過程中α-生育酚水平急劇增加（高達5倍），表明乙烯感知和乙烯信號傳導可能參與水分脅迫和葉片老化過程中生育酚生物合成的調(diào)控。Maeda等［14］和K?nig等［15］證明低溫處理的VTE2具有獨特的多不飽和脂肪酸（PUFAs）組成，與野生類型相比，亞麻酸（18：3）水平較低，亞油酸水平（18：2）較高，生育酚在低溫下調(diào)節(jié)擬南芥的質外多不飽和脂肪酸代謝。

γ-生育酚甲基轉移酶（γ-TMT）可以催化生物活性較低的γ-生育酚甲基化生成更高生物活性的α-生育酚，γ-TMT產(chǎn)物是決定植物維生素E組分及活性的關鍵酶之一。目前，大豆γ-生育酚甲基轉移酶基因應對激素和逆境脅迫的研究較少，董強［16］對大豆植株進行低溫脅迫處理，觀察到低溫脅迫使葉片中總維生素E含量增加，GmTMT?2轉錄本很高，揭示了基因在低溫脅迫下的重要作用。通過對紫花苜蓿［17］、辣椒［18］、花生［19-20］等作物的γ-生育酚甲基轉移酶基因在抗旱抗鹽等逆境方面的研究表明，過量表達MsTMT顯著促進紫花苜蓿葉片中α-生育酚的合成及總生育酚含量的提高，轉基因苜蓿抗旱性顯著增強，葉片氧化損傷顯著減輕，滲透調(diào)節(jié)物質積累增多［21-23］。賈會麗等［24］發(fā)現(xiàn)MsTMT在紫花苜蓿葉片中表達量最高，受NaCl、PEG及黑暗誘導后MsTMT表達上調(diào)，低溫脅迫后MsTMT表達下降，外源ABA不影響MsTMT的表達。在干旱條件下，過表達擬南芥VTE1到轉基因煙草中，葉綠素含量較野生型增加，VTE1可用于增加植物的維生素E含量，并增強對環(huán)境脅迫的耐受性［25-28］。研究者從擬南芥中分離出來兩個脅迫誘導啟動子和龍葵的VTE2.1基因，在脅迫誘導型啟動子控制下轉基因煙草植株在干旱條件下表現(xiàn)出α-生育酚水平的增加，增加植物體內(nèi)維生素E的含量，并減少環(huán)境脅迫對植物的不利影響［29-30］。

目前，關于大豆富含維生素E的研究主要集中在大豆種子維生素E積累方面研究，鮮見關于維生素E及其合成關鍵酶γ-TMT參與大豆激素和逆境脅迫響應的報道。

本研究通過對大豆在激素和逆境脅迫下幼苗各組織維生素組分含量及γ-TMT的表達模式進行研究，探討大豆維生素E組分含量及其γ-TMT表達與激素和逆境的關系，從而為維生素E參與逆境脅迫開辟新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗大豆品種為晉大88號，由山西農(nóng)業(yè)大學選育，是山西省主栽品種之一。

1.2 方法

1.2.1 γ-TMT1-γ?TMT3的生物信息學分析 利用DNAMAN進行氨基酸序列比對；利用MG2C2.0進行染色體定位；利用Plant?CARE、Tbtools預測啟動子的順式作用元件。

1.2.2 逆境脅迫環(huán)境下植物形態(tài)生理指標的測定 在溫度、濕度合適的專用苗室內(nèi)進行試驗，將大豆種子播種于20 cm×15 cm的育苗盆中，以蛭石作為基質，每穴2株，3次重復，采用隨機區(qū)組設計。待真葉完全展開后，以濃度為150 mmol/L NaCl、330 mmol/L H2O2、100 mmol/L PEG、300 mg/L SA、0.20 mg/L ABA低氮營養(yǎng)液進行脅迫處理，等量低氮營養(yǎng)液為對照，每2 d澆水1次，每盆澆水1.5 L［31-34］。二出復葉完全展開時，用SPAD?502型葉綠素測定儀測定頂葉到一葉SPAD值，每隔3 d測量1次。第16天對維生素E、株高、鮮重、含水量等各指標測定。

1.2.3 逆境脅迫環(huán)境下植物根、莖、葉維生素E含量的測定 采用高效液相色譜法測定大豆維生素E［35-36］。選取處理后的根、莖、葉組織于?20℃保存24 h后，在冷凍干燥箱中冷凍干燥48 h，研磨成粉，取0.100 0 g加入抗壞血酸0.125 g、70%乙醇提取液3 mL，振蕩混勻30 s，超聲提取20 min，再加入正己烷6 mL，振蕩混勻30 s，超聲提取15 min，取出后12 000 r/min離心8 min，上清液使用平衡濃縮儀氮氣下吹干，復溶于甲醇中備用。色譜條件：流動相為甲醇，柱溫35℃，檢測波長295 nm，流速1.0 mL/min，測量維生素E中各組分含量。

1.2.4 逆境脅迫環(huán)境下γ-TMT的表達分析 選取經(jīng)SA、H2O2、PEG、ABA處理后0、3、8、18、36和48 h的幼苗根、葉，以及經(jīng)NaCl處理后0、4、8、18、36和72 h的幼苗根、葉。選取生長狀態(tài)一致的材料，每個樣品3次生物學重復［37-40］。液氮速凍，?80℃保存?zhèn)溆?。利用Bio?Rad CFX96實時熒光定量PCR儀，采用全式金TransStart?Tip Green qPCR Super?Mix試劑盒進行熒光定量PCR。根據(jù)γ-TMT序列，使用Primer Premier6軟件設計實時熒光定量PCR引物（表1），GmCYP2為內(nèi)參基因。計算γ-TMT的相對表達。

表1 γ-TMT的RT-qPCR擴增引物Table 1 Primers for RT-qPCR amplification of γ-TMT gene

2 結果

2.1 大豆γ-TMT的家族成員數(shù)量及染色體定位

大豆基因組中有3個γ-TMT，命名為γ-TMT1-γ?TMT3。由染色體定位分析可知，γ-TMT1定位區(qū)間是在大豆第12染色體的1 020 482-1 023 990 bp，γ-TMT2定位區(qū)間在大豆第12染色體的1 028 184-1 031 945 bp，γ-TMT1和γ-TMT2定位區(qū)間比較靠近，γ-TMT3定位區(qū)間是在大豆第9染色體的45 209 996-45 214 333 bp。

2.2 γ-TMT氨基酸序列比對

通過序列比對發(fā)現(xiàn)（圖1），γ-TMT1-γ-TMT3氨基酸序列相似性為80.15%，其中，有5個谷氨酸差異和7個絲氨酸差異，推測γ-生育酚甲基轉移酶更多的絲氨酸差異可能是為甲基化反應提供更多的亞甲基集團以及反應所需的能量，催化反應的進行。

圖1 γ-TMT氨基酸序列的比對Fig. 1 Amino acid sequence alignment of γ-TMT

2.3 γ-TMT上游2 000 bp啟動子順式作用元件的預測

γ-TMT1的上游順式作用元件有脫落酸應答元件、植物抗旱元件、茉莉酸甲酯反應相關的調(diào)節(jié)因子、參與光反應的順式作用調(diào)節(jié)元件、光響應的順式調(diào)節(jié)元件、光敏感元件的一部分、參與防御和應激反應、參與水楊酸反應、光響應元件的一部分等，這些皆是參與脅迫、激素、傷害的元件。γ-TMT2的上游順式作用元件有參與脫落酸反應的元件、厭氧誘導中必不可少的元件、植物抗旱元件、茉莉酸甲酯反應相關的調(diào)節(jié)因子、參與光反應的順式作用調(diào)節(jié)元件、光響應要素、普通順式作用元件參與低溫反應的元件、參與防御和應激反應的順式作用元件等，這些皆是參與脅迫、激素、傷害的元件。γ-TMT3的上游順式作用元件有參與脫落酸反應的元件、植物抗旱元件、參與光反應的順式作用調(diào)節(jié)元件、參與赤霉素反應的順式作用元件、參與防御和應激反應的順式作用元件、參與水楊酸反應元件等，這些皆是參與脅迫、激素、傷害的元件（圖2）。

圖2 γ-TMT啟動子順式作用元件預測熱圖Fig. 2 Prediction heat map of γ-TMT gene promoter cisacting element

2.4 不同激素和脅迫環(huán)境下植物幼苗生理形態(tài)的分析

2.4.1 不同激素和脅迫環(huán)境下葉片SPAD值 經(jīng)PEG、SA、NaCl、ABA和H2O2處理7 d時，觀察植物理化形態(tài)，株高、長勢均低于對照，葉色卻深于對照，SPAD值大于對照。隨著植株生長，對照葉片濕潤有光澤，而處理的材料葉片干澀萎蔫。經(jīng)ABA處理13 d的植株萎蔫，經(jīng)H2O2處理的植株葉片微卷曲，經(jīng)PEG處理的葉片微卷、葉色微黃。同時，處理材料的葉片SPAD值伴隨葉片水分的減少而降低，可能是脅迫處理阻止了Na+、CI-等離子流向葉片，使葉綠素的合成受到影響，活性氧的大量積累也導致葉綠素的合成遭受破壞，同時加速了葉綠素的降解。處理16 d時，對照長勢旺盛，株高最高，SPAD值最低，推測由于實驗室光強稍微過盛，葉片或葉綠體暴露在強光下會導致葉綠素含量下降，光合作用下降，葉綠素蛋白質復合物中的PSII核心的CPa受損，影響了LHCP，抑制PSII的活性，最終導致SPAD值降低（圖3）。

圖3 激素和逆境脅迫環(huán)境下SPAD值Fig. 3 SPAD values in hormonal and adversely stress environment

2.4.2 不同激素和脅迫環(huán)境下植株鮮重、干重、含水量及株高的變化 由結果可知，NaCl、H2O2、PEG、SA、ABA處理后材料的株高約為CK的0.45、0.31、0.65、0.29和0.31倍，與CK相比，激素和脅迫處理后材料的株高顯著低于CK的株高；NaCl、H2O2、PEG、SA、ABA處理后材料的鮮重約為CK的0.63、0.38、0.83、0.47和0.38倍，處理后材料鮮重顯著低于CK。NaCl、H2O2、PEG、SA、ABA處理后材料的干重約為CK的0.84、0.41、0.83、0.70和0.60倍，與CK相比，H2O2處理后材料的干重顯著低于CK，SA、ABA、PEG、NaCl處理后材料的干重低于CK。NaCl、H2O2、PEG、SA、ABA處理后材料的含水量約為CK的0.84、0.92、0.99、0.94和0.95倍，與CK相比，NaCl、H2O2、SA、ABA處理后材料的含水量顯著低于CK，PEG處理后材料的含水量低于CK。CK三出復葉、第二次三出復葉抽出的時間顯著早于激素和脅迫處理的植株，表明激素和逆境脅迫環(huán)境下大豆植株的生長被顯著抑制。材料株高、鮮重干重以及含水量皆小于CK，植株生長處于一種受壓迫的不利條件（圖4）。

圖4 激素和逆境脅迫環(huán)境下植物各生理指標測定Fig. 4 Determination of physiological indexes of plants under hormonal and adversely stress environment

2.5 逆境脅迫環(huán)境下植物根莖葉維生素E含量測定

2.5.1 逆境脅迫環(huán)境下植物根莖葉維生素E含量分析 晉大88經(jīng)激素和逆境處理生長期16 d后，對其根莖葉維生素E含量進行測定，由表2可知，各生育酚標準品的線性回歸方程R2≥0.999 7，說明各生育酚質量濃度與峰面積的線性條件良好。與CK相比，PEG、NaCl、H2O2、ABA、SA處理后的葉中總維生素E含量平均值約為CK總維生素E含量平均值的0.85、0.94、0.90、0.97和0.78倍（表3），激素和脅迫處理后的總維生素E含量平均值小于CK總維生素E含量平均值；在莖中，PEG處理后的總維生素E含量平均值約為CK總維生素E含量平均值的0.42倍，NaCl處理后的總維生素E含量平均值約為CK總維生素E含量平均值的0.18倍（表4），在晉大88的莖中，PEG、NaCl處理后的總維生素E含量平均值顯著低于CK總維生素E含量平均值。激素和脅迫條件下大豆葉中維生素E含量被抑制，莖中維生素E含量被顯著抑制。

表2 生育酚標準品的回歸方程與檢出限Table 2 Regression equation and detection limit of tocopherol standard

表3 激素和逆境脅迫環(huán)境下大豆葉中維生素E含量分析Table 3 Analysis of vitamin E content in soybean leaves under hormonal and adversely stress environment

表4 激素和逆境脅迫環(huán)境下大豆莖中維生素E含量分析Table 4 Analysis of vitamin E content in soybean stems under hormonal and adversely stress environment

2.5.2 逆境脅迫環(huán)境下植物根莖葉維生素E組分含量分析 CK以及PEG、NaCl處理的莖中有少許的γ-生育酚和δ-生育酚，α-生育酚含量檢測不出來（表4）。在CK和激素脅迫處理的植株葉中，γ-生育酚＞α-生育酚＞δ-生育酚（表3），在莖中，γ-生育酚＞δ-生育酚（表4）。

在晉大88葉中，與CK相比，PEG、NaCl、H2O2、ABA、SA處理后的α-生育酚含量平均值約為CK的0.58、0.71、0.42、0.56和0.56倍（表3），PEG、NaCl、ABA、SA處理后的α-生育酚含量平均值低于CK，H2O2處理后的α-生育酚含量平均值顯著低于CK。與CK相比，PEG、NaCl、H2O2、ABA、SA處理后的γ-生育酚含量平均值約為CK的0.96、1.18、1.14、1.14和0.87倍（表3），CK高于PEG、SA處理后的γ-生育酚的含量，低于H2O2、NaCl、ABA處理后的γ-生育酚的含量，H2O2、NaCl、ABA處理一定程度上提高了γ-生育酚的含量。與CK相比，PEG、NaCl、H2O2、ABA、SA處理后的δ-生育酚含量平均值約為CK的0.57、0.59、0.22、0.51和0.53倍（表3），PEG、NaCl、ABA、SA處理后的δ-生育酚含量低于CK，H2O2處理后的δ-生育酚含量顯著低于CK（表3）。在晉大88莖中，與CK相比，PEG處理后的γ-生育酚含量平均值約為CK的0.37倍，NaCl處理后的γ-生育酚含量平均值約為CK的0.12倍，PEG和NaCl處理后的γ-生育酚含量顯著低于CK（表4）。與CK相比，PEG處理后的δ-生育酚含量平均值約為CK的1.19倍，NaCl處理后的δ-生育酚含量平均值約為CK的1.20倍，PEG和NaCl處理后的δ-生育酚含量高于CK（表4）。

2.6 γ-TMT對逆境脅迫條件的響應分析

2.6.1 γ-TMT1對逆境脅迫條件的響應 為探究γ-TMT1-γ?TMT3是否與激素和逆境響應相關，對大豆幼苗進行SA、ABA、H2O2、PEG 和NaCl脅迫處理，檢測處理不同時間該基因的表達情況。經(jīng)SA處理18 h時，葉中γ-TMT1相對表達量最高，約為對照的45.05倍，基因相對表達表現(xiàn)上調(diào)。經(jīng)SA處理3 h時，根中基因相對表達量最高，約為對照的84.2倍，基因相對表達表現(xiàn)上調(diào)；經(jīng)ABA處理48 h時，葉中γ-TMT1相對表達量最低，約為對照的0.02倍，基因相對表達量受到顯著抑制。經(jīng)ABA處理36 h時，根中基因相對表達量最高，約為對照的50.16倍，3 h時，基因相對表達量最低，約為對照的1.12倍，呈持續(xù)上調(diào)趨勢；經(jīng)H2O2處理8 h時，葉中γ-TMT1相對表達量最高，約為對照的24.9倍，36 h時，基因相對表達量最低，約為對照的6.13倍，呈上調(diào)趨勢。經(jīng)H2O2處理8 h時，根中基因相對表達量最高，約為對照的9.54倍，呈上調(diào)趨勢；經(jīng)PEG處理18 h，γ-TMT1在葉中相對表達量最高，約為對照的3.34倍，呈上調(diào)趨勢。經(jīng)PEG處理48 h，基因在根中相對表達量最低，約為對照的0.001倍，表達量受到顯著抑制；經(jīng)NaCl處理4 h，γ-TMT1在葉中相對表達量最高，約為對照的110.82倍，18 h時，基因相對表達量最低，約為對照的0.78倍。經(jīng)NaCl處理36 h，基因在根中的相對表達量最高，約為對照的39.90倍，8 h時，基因相對表達量最低，約為對照的1.28倍（圖5）。

圖5 激素及逆境脅迫環(huán)境下γ-TMT1的表達分析Fig. 5 Analysis of γ-TMT1 gene expressions in hormonal and advsrsely stress environment

2.6.2 γ-TMT2對逆境脅迫條件的響應 經(jīng)SA處理48 h時，γ-TMT2在葉中表達量最低，約為對照的0.001倍，表達受到顯著抑制。在根中表達量呈先升高后降低趨勢，48 h時，基因相對表達量最低，約為對照的0.001倍，表達受到顯著抑制；在ABA處理條件下，3 h時，γ-TMT2在葉中表達量最低，約為對照的0.006倍，表達受到顯著抑制。3 h時，在根中表達量最低，約為對照的0.72倍，18 h時，基因表達量最高，約為對照的100.34倍，呈上調(diào)趨勢；在H2O2處理條件下，48 h時，γ-TMT2在葉中表達量最高，約為對照的12.8倍，總體呈上調(diào)趨勢。8 h時，在根中表達量最高，約為對照的1.8倍，呈上調(diào)趨勢。在PEG處理條件下，3 h時，γ-TMT2在葉和根中的相對表達量顯著下降，8 h之后無顯著變化；在NaCl處理條件下，72 h時，γ-TMT2在葉中的表達量最低，約為對照的0.001倍，表達受到顯著抑制。36 h時，在根中的表達量最高，約為對照的12.85倍，總體呈上調(diào)趨勢（圖6）。

圖6 激素及逆境脅迫環(huán)境下γ-TMT2基因表達分析Fig. 6 Analysis of γ-TMT2 gene expressions in hormonal and adversely stress environment

2.6.3 γ-TMT3對逆境脅迫條件的響應 在SA處理條件下，48 h時，γ-TMT3在葉中表達量最低，約為對照的0.002倍，表達受到顯著抑制。36 h時，在根中的表達量最高，約為對照的16.4倍，總體呈上調(diào)趨勢。在ABA處理條件下，18 h時，γ-TMT3在葉中表達量最高，約為對照的2.09倍，48 h時，基因表達量最低，約為對照的0.435倍，總體呈下調(diào)趨勢。48 h時，在根中的表達量最高，約為對照的87.35倍，8 h時，表達量最低，約為對照的0.36倍，總體呈上調(diào)趨勢；在H2O2處理條件下，18 h時，γ-TMT3在葉中基因的表達量最低，約為對照的0.15倍，總體表現(xiàn)顯著下調(diào)。在根中，表達先下降后上升，呈上調(diào)趨勢；在PEG處理條件下，8 h時，γ-TMT3在葉中相對表達量最高，約為對照的11.7倍，之后開始下降，72 h時表達量最低，約為對照的0.001倍，表達受到顯著抑制。36 h時，在根中的表達量最高，約為對照的716.6倍，總體呈上調(diào)趨勢；在NaCl處理條件下，36 h時，γ-TMT3在葉中的表達量最高，約為對照的0.32倍，表達受到顯著抑制。36 h時，在根中的表達量最高，約為對照的16.37倍，4 h時，表達量最低，約為對照的0.774倍，總體呈上調(diào)趨勢（圖7）。

圖7 激素及逆境脅迫環(huán)境下γ-TMT3基因表達分析Fig. 7 Analysis of γ-TMT3 gene expressions in hormonal and adversely stress environment

3 討論

3.1 γ-TMT氨基酸序列比對、基因家族成員數(shù)量及染色體定位分析

γ-TMT氨基酸序列相似性為80.15%，保守位點相對分散，其中，共有5個谷氨酸差異，7個絲氨酸差異，推測γ-生育酚甲基轉移酶更多的絲氨酸差異可能是為甲基化反應提供更多的亞甲基集團以及反應所需的能量，催化反應的進行。在植物中谷氨酰胺由谷氨酰胺合成酶催化谷氨酸而來，谷氨酸在檸檬酸循環(huán)下經(jīng)過谷氨酸脫氫酶催化α-酮戊二酸還原氨化而來。絲氨酸由糖酵解途徑轉化而來，糖酵解是糖分解代謝和生物體取得能量的主要方式，同時檸檬酸循環(huán)又是三大營養(yǎng)素（糖、脂、氨基酸）的最終代謝通路和聯(lián)系樞紐［41］。因此，谷氨酸和絲氨酸差異可能在γ-生育酚甲基轉移酶能量代謝中具有較大作用，這些差異位點的氨基酸或許更多在能量供應上促進γ-生育酚甲基轉移酶的作用。絲氨酸羥甲基轉移酶是催化絲氨酸和甘氨酸之間可逆互換的分子，在光照作用下C3植物甘氨酸合成的速率很快，光呼吸中甘氨酸的脫羧作用為其他生物合成反應提供C1單位，SHMT催化一個亞甲基基團從絲氨酸轉移到四氫葉酸上以供胸苷酸合成直接使用。利用13C核磁共振技術和多13C?標記底物進行研究，在非光合組織細胞線粒體中，由GDC/SHMT系統(tǒng)催化甘氨酸的分解，絲氨酸-甘氨酸循環(huán)的最后平衡可能是氧化1分子絲氨酸產(chǎn)生2個C1單位、1個CO2和1個NH3，該反應可能在蛋白快速周轉、細胞快速分裂、在有高蛋白酶活性的衰老組織、細胞程序性死亡的組織中起重要作用［42］。由此推測γ-生育酚甲基轉移酶更多的絲氨酸差異其原因可能是為甲基化反應提供更多的亞甲基集團以及反應所需的能量，催化反應的進行。γ-TMT在大豆基因組中成員數(shù)量有3個，命名為γ-TMT1-γ?TMT3。γ-TMT1的定位區(qū)間是在大豆第12染色體1 020 482-1 023 990 bp，γ-TMT2的定位區(qū)間是在大豆第12染色體1 028 184-1 031 945 bp，定位區(qū)間比較靠近，γ-TMT3的定位區(qū)間是在第9染色體45 209 996-45 214 333 bp。此外，還對油棕［43］、棉花［44］、辣椒、花生等γ-TMT進行了生物信息學分析。郭娟等［18］克隆了貴州商業(yè)辣椒‘黔椒4號’的γ-TMT，獲得編碼該酶的cDNA全長序列，并利用生物信息學相關軟件對γ-TMT氨基酸同源性進行比對、開放閱讀框、疏水性、磷酸化位點、跨膜區(qū)、二硫鍵、信號肽、亞細胞定位、二級結構以及三級結構等進行預測分析，辣椒γ-TMT基因開放閱讀框長1 110 bp，編碼369個氨基酸，γ- TMT編碼的蛋白是一種親水性蛋白，該蛋白沒有明顯的跨膜結構域，不存在信號肽，為非分泌蛋白。亞細胞定位得知，辣椒的γ- TMT在葉綠體基質中存在的幾率最高，為93.8%，預測該基因主要是在植物細胞的葉綠體基質中發(fā)揮作用，初步預測辣椒與馬鈴薯、番茄的親緣關系相對較近。劉婷［19］從花生栽培種A、B兩個亞基因組中成功克隆出兩個生育酚甲基轉移酶基因（γ-TMT），分別命名為Ahγ-TMT1和Ahγ-TMT2，生物信息學分析表明，Ahγ-TMT1編碼區(qū)全長為3 111 bp，Ahγ-TMT2編碼區(qū)全長為3 124 bp，都含有6個外顯子和5個內(nèi)含子，且開放閱讀框長均為1 059 bp，編碼352個氨基酸。

3.2 激素和脅迫環(huán)境下大豆形態(tài)生理指標

激素和脅迫處理后的株高和鮮重顯著低于CK的株高和鮮重，H2O2處理后的植株干重顯著低于CK的干重，NaCl、H2O2、SA、ABA處理后的植株含水量顯著低于CK的含水量，激素和脅迫環(huán)境導致植物生長滯緩。第7天時脅迫和激素處理的材料株高、長勢均低于CK，葉色卻深于CK，SPAD值大于CK，第13天處理材料葉片SPAD值伴隨著葉片水分的減少而降低，可能是脅迫處理阻止了Na+，Cl-等離子流向葉片，使葉綠素的合成受到影響，活性氧的大量積累也導致葉綠素的合成遭受破壞，同時加速了葉綠素的降解［45］。第16天CK株高最高，SPAD值也最低，推測由于實驗室光強稍微過盛，葉片或葉綠體暴露在強光下會導致葉綠素含量下降，光合作用下降，葉綠素蛋白質復合物中的PSII核心的CPa受損，影響了LHCP，抑制PSII的活性，最終導致SPAD值降低［46-47］。有學者以野大豆為實驗材料，檢測快速葉綠素熒光和820 nm光反射來研究鹽脅迫對光系統(tǒng)化學活性的影響，結果顯示野大豆幼苗葉片葉綠素a含量顯著降低［48］。

3.3 大豆維生素組分含量對激素和逆境脅迫的響應分析

維生素E主要存在晉大88葉中，莖中有少量，激素和脅迫條件下葉中維生素E含量被抑制，莖中維生素E含量被顯著抑制。在葉中，維生素E在對照和激素脅迫處理的植株葉中，γ-生育酚＞α-生育酚＞δ-生育酚；在莖中，γ-生育酚＞δ-生育酚。在葉中PEG、SA、NaCl、ABA處理后的α、δ-生育酚含量高于CK的α、δ-生育酚含量，H2O2處理后的α、δ-生育酚含量顯著高于CK的α、δ-生育酚含量，激素和脅迫條件下葉中α-生育酚和δ-生育酚含量被抑制，CK高于PEG、SA處理后的γ-生育酚的含量，低于H2O2、NaCl、ABA處理后的γ-生育酚的含量，H2O2、NaCl、ABA處理一定程度上提高了的γ-生育酚含量。莖中α-生育酚的含量為0，與CK相比，PEG和NaCl處理后的莖中γ-生育酚含量顯著低于CK的γ-生育酚含量，PEG和NaCl處理后的莖中δ-生育酚含量高于CK的δ-生育酚含量。

3.4 γ-TMT啟動子順式作用元件預測及對激素處理和脅迫的響應分析

γ-TMT的啟動子含有脅迫、傷害、激素響應等多種順式作用元件，表明γ-TMT可能參與調(diào)控復雜的非生物脅迫響應。研究者對γ-TMT的啟動子順式作用元件進行了預測［49-50］。FAE1是脂肪酸鏈延長酶的組分，在油料種子的胚中特異性表達，張明等［51］通過以擬南芥基因組為模板設計引物并且擴增到該基因啟動子片段，與甘藍型油菜γ-生育酚甲基轉移酶（γ-TMT）基因連接，將構建成的表達載體pFAE1?TMT通過農(nóng)桿菌介導轉化到大豆胚尖，獲得了2株轉γ-TMT大豆植株。Tewari等［52］對大豆γ-生育酚甲基轉移酶基因啟動子進行了克隆及功能分析。前人研究表明γ-TMT啟動子多態(tài)性可能與一些大豆品種的高α-生育酚濃度有關［53-55］，為了解大豆品種α-生育酚含量遺傳變異的分子基礎，對高α-生育酚含量大豆品種和低α-生育酚含量大豆品種γ-TMT上游1.4 kb的啟動子區(qū)進行了克隆，在核心啟動子區(qū)域外觀察到7個單核苷酸多態(tài)性，基于缺失啟動子結構分析進一步闡明這些SNP影響γ-TMT啟動子活性和α-生育酚的濃度［56-57］。

目前，國內(nèi)關于大豆維生素E合成關鍵酶基因γ-TMT對非生物脅迫及激素誘導響應的研究較少，進一步利用RT?qPCR方法分析激素和脅迫誘導下的表達模式，在激素和逆境脅迫下，γ-TMT1受H2O2、NaCl、SA誘導后葉和根中表達上調(diào)，受ABA誘導后葉中表達下調(diào)，根中表達上調(diào)，受PEG誘導后葉中表達上調(diào)，根中表達下調(diào)；γ-TMT2受H2O2誘導后葉和根中表達上調(diào)，受SA誘導后葉和根中表達下調(diào)，而在NaCl、ABA誘導后葉中表達下調(diào)，根中表達上調(diào)；γ-TMT3受H2O2、PEG、ABA、SA、NaCl誘導后根中表達上調(diào)，葉中表達下調(diào)。結合前面對鹽脅迫條件下大豆維生素E及各組分含量的測定，大豆葉中γ-生育酚含量增加，而γ-TMT2、γ-TMT3的表達明顯下調(diào)，由于γ-生育酚甲基轉移酶（γ-TMT）可以催化γ-生育酚轉化為α-生育酚，推測γ-TMT2、γ-TMT3影響鹽脅迫條件下維生素E組分含量，在鹽脅迫條件下γ-TMT2、γ-TMT3表達量的下降導致大豆葉中γ-生育酚含量的增加。在苜蓿和油菜中發(fā)現(xiàn)γ-TMT的過表達可以增加α-生育酚的積累，在調(diào)控紫花苜蓿對PEG模擬干旱脅迫的響應中起積極作用，其機制可能涉及活性氧清除系統(tǒng)、氣孔發(fā)育和多種激素信號通路［58-59］。研究人員發(fā)現(xiàn)α-生育酚對逆境毒害的抵抗和減輕作用，玉米耐鎘ZmVTE4編碼γ-生育酚甲基轉移酶通過其產(chǎn)物α-生育酚減輕鎘毒性［60-61］，在Cd逆境脅迫下，篩選獲得具有耐Cd特性的玉米ZmVTE4，通過異源表達ZmVTE4增強了酵母和煙草對Cd的耐受性，增加玉米葉片的生育酚含量，煙草葉片γ-生育酚和α-生育酚的含量也增加。由此可見，在逆境脅迫下會促進γ-生育酚轉化成α-生育酚，增加α-生育酚的含量。

4 結論

激素和逆境脅迫顯著抑制大豆植株的生長。維生素E主要存在于葉中，莖中有少量。在激素和逆境脅迫處理時，α-生育酚和δ-生育酚被抑制。其中，γ-TMT1受NaCl誘導后，葉和根中表達上調(diào)。γ-TMT2受NaCl誘導后葉中表達下調(diào)，在根中表達上調(diào)。γ-TMT3受NaCl誘導后，在根中表達上調(diào)，葉中表達下調(diào)。鹽脅迫條件下，γ-TMT2、γ-TMT3表達量的下降導致大豆葉中γ-生育酚含量的增加，γ-TMT2、γ-TMT3影響鹽脅迫條件下維生素E組分的含量。