侯瑞澤 鮑悅 陳啟亮 毛桂玲 韋博霖 侯雷平 李梅蘭

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，晉中 030800）

普通白菜（Brassica rapa ssp. chinensis Makino）是典型的種子春化型蔬菜，屬十字花科蕓薹屬，感受低溫后容易抽薹開花，但春季過早抽薹影響其品質(zhì)和產(chǎn)量，會造成重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，闡明其成花機(jī)理以防止過早抽薹至關(guān)重要。

植物的成花過程可分為花的誘導(dǎo)、成花轉(zhuǎn)變和花器官的發(fā)育3個階段，此過程關(guān)系到植物的開花時間、開花數(shù)量、開花質(zhì)量和花期長短［1］。在過去的幾十年里，擬南芥開花的生理和分子機(jī)制已經(jīng)得到了研究，發(fā)現(xiàn)光周期途徑、春化途徑和環(huán)境溫度途徑主要傳遞光和溫度等外部信號；內(nèi)源性信號是自主途徑、赤霉素途徑和年齡通路的主要途徑［1-8］。這些途徑既相互獨立又相互作用，形成一個復(fù)雜而獨立的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控抽薹和開花。開花決定了植物生長周期的長短，也直接關(guān)系到植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此，成花機(jī)理成為了人們研究的重點［9］。

PRR5（PSEUDO?RESPONSE REGULATOR 5）編碼一個偽響應(yīng)調(diào)節(jié)器，其突變影響各種與晝夜節(jié)律相關(guān)的生物事件，例如長日光周期條件下的開花時間、早期光形態(tài)發(fā)生期間幼苗的紅光敏感性以及某些時鐘控制基因的自由運行節(jié)律周期。PRR基因之所以如此命名，是因為它們編碼類似于“響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白”的蛋白質(zhì)，在細(xì)菌、酵母和植物的磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮輸出作用［10］。前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥PRR5是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，但如果VP16這一強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活域與PRR5（PRR5?VP）串聯(lián)融合，則PRR5?VP將充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活因子。超表達(dá)PRR5?VP的轉(zhuǎn)基因擬南芥具有晚開花和長下胚軸表型，這與超表達(dá)PRR5的擬南芥相反［11］。PRRs通過控制CDF來調(diào)節(jié)CO/FT從而調(diào)控開花時間［12］。在至少2個途徑中，擬南芥PRR誘導(dǎo)FT并促進(jìn)開花［11,13］，但是在普通白菜中未見相關(guān)報道。

本研究以普通白菜‘75#’品系為試驗材料，克隆PRR5的同源基因Bra009768，分析其序列、蛋白結(jié)構(gòu)和在不同器官及不同發(fā)育時期的表達(dá)情況，最后構(gòu)建超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行功能驗證，以明確其在普通白菜中的功能，為了解PRR5對普通白菜成花轉(zhuǎn)變的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

普通白菜‘75#’和擬南芥哥倫比亞野生型為實驗室保存種質(zhì)資源。參照Shang等［14］方法進(jìn)行材料處理，選取籽粒飽滿的種子均勻播種在含有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，催芽3 d后置于4℃低溫處理20 d，將幼苗移栽至50孔穴盤，進(jìn)行常規(guī)管理。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA的合成 選取移栽后10 d的植株莖尖生長點，記作DAV10，用體視顯微鏡觀察花芽分化情況［15］，取花芽分化0級（S0）和1級（S1）時的莖尖生長點，以及根、莖、葉、花和果莢進(jìn)行RT?qPCR分析，將上述樣品參照試劑盒說明書提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行基因克隆和表達(dá)量分析。

1.2.2 過表達(dá)載體的構(gòu)建 利用大白菜數(shù)據(jù)庫（http://brassicadb.org）查找Bra009768的序列，用NCBI中的 Primer?BLAST（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer?blast/）設(shè)計特異性引物（表1）。以S0 cDNA為模板，用引物C?Bra009768?F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測、回收。將回收產(chǎn)物用同源臂引物G?Bra009768?F/R擴(kuò)增，再回收，用無縫克隆試劑盒與線性化pBI121載體重組，并轉(zhuǎn)化至DH5α，待菌液渾濁后進(jìn)行PCR驗證（引物為N?YZ），將條帶大小正確且無雜帶的菌液送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。將測序正確的菌液，參照天根質(zhì)粒小提試劑盒說明書步驟進(jìn)行質(zhì)粒提取，使用NanoDrop 2000檢測質(zhì)粒溶液濃度，?20℃保存，備用。

表1 Bra009768引物列表Table 1 Primers of Bra009768

上述過程反應(yīng)體系為（共20 μL）：2×Phanta Max Master Mix 10 μL、Reverse/Forward Primer（10 μmol/L）各0.8 μL、cDNA 1 μL和RNase Free dH2O 7.4 μL。反應(yīng)程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 90 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。

1.2.3 基因序列的生信分析 使用DNAMAN軟件對Bra009768進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯，以NCBI數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，利用MEGA 7.0軟件對Bra009768蛋白序列進(jìn)行比對并構(gòu)建進(jìn)化樹。利用在線軟件ExPASy（https://www.expasy.org/）進(jìn)行蛋白序列的理化性質(zhì)分析。利用在線軟件SOPMA（https://npsa?prabi.ibcp.fr/cgi?bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，SWISS?MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測三級結(jié)構(gòu)。利用在線分析工具Plant?mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant?multi/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析。

1.2.4 基因的表達(dá)分析 為了解Bra009768在普通白菜中的功能，取普通白菜‘75#’的根、莖、葉、花和果莢進(jìn)行RT?qPCR檢測該基因在不同部位的表達(dá)情況，以DAV10、S0和S1三個時期的cDNA為模板，測定該基因在不同發(fā)育時期的表達(dá)情況，以大白菜ACTIN作為內(nèi)參基因，相對定量使用內(nèi)參基因的2-△△CT算法計算［16］。特異性引物見表2。

表2 RT-qPCR驗證引物Table 2 Primers of real time quantitative PCR

1.2.5 蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥

1.2.5.1 菌株準(zhǔn)備 將1.2.2提取的pBI121?Bra0097 68質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101菌株，擴(kuò)繁至菌液渾濁后使用特異性引物N?YZ?F/R進(jìn)行菌液PCR驗證，用瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物，將條帶大小正確且無雜帶的GV3101?pBI121?Bra009768菌液?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 植物材料準(zhǔn)備 將野生型擬南芥種子用消毒液消毒后均勻播種至MS固體培養(yǎng)基中，先置于黑暗環(huán)境下4℃春化2 d，隨后移至光照16 h/黑暗8 h、溫度25℃、相對濕度55%的組培室中生長5-7 d。待植株兩片真葉展開后移栽至營養(yǎng)缽中進(jìn)行常規(guī)管理。

1.2.5.3 擬南芥花序侵染 侵染菌液制備：將培養(yǎng)至OD600≈0.9的GV3101?pBI121?Bra009768菌體離心后重懸沉淀菌體至OD600≈0.8，加入0.05%Silwet?77，充分混勻后備用。

轉(zhuǎn)化植株準(zhǔn)備：當(dāng)野生型擬南芥移栽6周后，選擇長勢良好、抽薹期基本一致的野生型擬南芥進(jìn)行花序侵染，然后將植株避光培養(yǎng)24 h后取出，進(jìn)行常規(guī)管理。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株篩選及分子鑒定 將收獲的T0種子于MS固體選擇培養(yǎng)基上篩選獲得T1轉(zhuǎn)基因植株，觀察T1轉(zhuǎn)基因植株生長狀況，單株收種并繼續(xù)篩選得到T2植株。

使用DNA提取試劑盒提取野生型植株，T1和T2轉(zhuǎn)基因植株總DNA，以野生型擬南芥DNA為陰性對照，pBI121?Bra00976質(zhì)粒為陽性對照，陽性轉(zhuǎn)基因植株總DNA為模板，引物為N?YZ?F/R，進(jìn)行PCR分子鑒定。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥表達(dá)量分析 切取野生型、T1和T2轉(zhuǎn)基因擬南芥蓮座葉片，參照說明書提取蓮座葉片總RNA。使用NanoDrop 2000檢測RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，質(zhì)檢合格且完整性良好的RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA文庫，以擬南芥ACTIN基因為內(nèi)參基因（表2），Bra009768為目標(biāo)基因，以T1和T2轉(zhuǎn)基因株系cDNA文庫為模板進(jìn)行RT?qPCR驗證。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆及過表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)目的條帶大小約為1 700 bp，與目的片段大小一致（圖1?A），可進(jìn)行后續(xù)的試驗。對pBI121?Bra009768的大腸桿菌菌液進(jìn)行PCR驗證（圖1?B），該基因所對應(yīng)條帶大小約2 000 bp且沒有雜帶，與目的基因大小相同，說明該基因已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌，可進(jìn)行基因測序。

圖1 Bra009768的克隆及其菌液檢測結(jié)果Fig. 1 Cloning of Bra009768 and detection results of its broth

2.2 序列分析

2.2.1 基因序列分析 克隆片段經(jīng)測序后得到核苷酸序列，片段大小為1 701 bp，使用DNAMAN軟件對Bra009768進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯，結(jié)果表明，Bra009768共編碼566個氨基酸，將該基因命名為BrcPRR5，GenBank ID: OQ715277。

2.2.2 氨基酸多重序列比對 BrcPRR5與BpPRR5（大白菜，Brassica pekinensis）、BnPRR5（歐洲油菜，Brassica napus）、AtPRR5（擬南芥，Arabidop?sis thaliana）、CsPRR5（亞麻芥，Camelina sativa）、RsPRR5（蘿卜，Raphanus sativus）、GaPRR5（棉花，Gossypium arboreum）、CsPRR5（歐洲栗，Castanea sativa）、FaPRR5（草莓，F(xiàn)ragaria ananassa）和Cc?PRR5（山核桃，Carya cathayensis Sarg）同源性分別為99.29%、98.41%、73.06%、71.19%、61.65%、38.81%、35.57%、34.44%和34.26%，同源性高，說明克隆片段是普通白菜的PRR5基因片段（圖2?A）。

2.2.3 蛋白質(zhì)親緣關(guān)系分析 為進(jìn)一步了解Bra009768編碼蛋白與其同源蛋白在不同植物之間的進(jìn)化關(guān)系，用DNAMAN軟件構(gòu)建該蛋白在不同植物物種間的系統(tǒng)進(jìn)化樹。與Bra009768編碼蛋白親緣關(guān)系最近的是大白菜（Brassica pekinensis），其次是歐洲油菜（Brassica napus），它們同屬一個分支。與歐洲栗（C. sativa）、草莓（F. ananassa）和山核桃（C.cathayensis Sarg）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2?B）。

2.2.4 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 Bra009768蛋白由566個氨基酸組成，分子量為62 788.90 Da，理論等電點為6.98，脂肪指數(shù)為62.86，親水性總平均值為?0.792；帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為70，帶正電荷的殘基總數(shù)為69，不穩(wěn)定指數(shù)為58.62，此類蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.2.5 二、三級結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測 使用SOPMA預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，Bra009768編碼蛋白（圖2?C）的二級結(jié)構(gòu)主要包括25.44%的α-螺旋、57.42%的無規(guī)則卷曲和13.25%的延伸鏈。使用SWISS?MODEL預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)（圖2?D），二者結(jié)果相吻合。使用Plant?mPLoc對Bra009768進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，其定位在細(xì)胞核上。

2.3 基因表達(dá)分析

為了解Bra009768在普通白菜不同器官與不同生育期中的表達(dá)情況，使用RT?qPCR方法對其進(jìn)行定量分析（圖3?A），發(fā)現(xiàn)該基因在莖中的表達(dá)量最高，花中次之，在葉和果夾中的表達(dá)量最低，對比該基因在DAV10、S0和S1時期莖尖生長點的相對表達(dá)量（圖3?B），發(fā)現(xiàn)該基因在S0時表達(dá)量最高，這與RT?qPCR中莖和花表達(dá)量高相吻合，說明其對成花轉(zhuǎn)變有促進(jìn)作用，有利于植株提早開花。

圖3 Bra009768在普通白菜不同器官（A）及不同發(fā)育時期（B）的表達(dá)Fig. 3 Expressions of Bra009768 in different organs（A）and different developmental stages（B）of pakchoi

2.4 抗性轉(zhuǎn)基因植株的獲得及PCR鑒定

將擬南芥T1、T2代轉(zhuǎn)基因種子播種于MS固體篩選培養(yǎng)基上，10 d后觀察種子發(fā)芽及植株生長情況。此時，抗性植株兩片真葉展開且葉片及根系發(fā)育良好，長勢健壯，而非抗性植株整株表現(xiàn)為黃化，葉片與根系生長發(fā)育停滯（圖4?A, B）。

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥抗性植株篩選Fig. 4 Selection of transgenic Arabidopsis thaliana resistant plants

T0植株收種后進(jìn)行T1轉(zhuǎn)基因植株篩選繼而進(jìn)行T2植株篩選，均于生長室中進(jìn)行常規(guī)管理，提取T1和T2轉(zhuǎn)基因植株的蓮座葉片總DNA作為模板，以同期生長的野生型擬南芥蓮座葉片總DNA為陰性對照，以pBI121?Bra009768質(zhì)粒為陽性對照，以引物N?YZ?F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對抗性株系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株鑒定。結(jié)果表明，電泳條帶大小為2 000 bp，與陽性對照大小一致，陰性對照未檢測到條帶，說明BrcPRR5已經(jīng)成功整合至擬南芥基因組中且能夠穩(wěn)定遺傳。

將T1抗性植株收種后再次播種于MS固體篩選培養(yǎng)基以獲得T2轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行后續(xù)試驗。共篩選獲得T1抗性植株4株，T2抗性植株40株。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株表型分析

通過表型觀察和統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)T1植株個體間存在差異，平均抽薹時間約為移栽后（12.50±2.38）d，早于野生型植株，蓮座葉片數(shù)明顯多于野生型植株，但是側(cè)薹數(shù)、株高和莖粗無明顯區(qū)別（表3，圖5?A-C）。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察及BrcPRR5的RT-qPCR驗證Fig. 5 Phenotypic observation of transgenic plants and RT-qPCR validation of BrcPRR5

表3 T1、T2轉(zhuǎn)基因植株表型統(tǒng)計Table 3 Phenotypic statistics of T1 and T2 transgenic plants

觀察T2轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)其抽薹時間平均為（15.72±0.78）d，早于野生型約1.5 d；株高、莖粗均顯著高于野生型；與T1相比個體間差異明顯縮小，但是側(cè)薹數(shù)與野生型無顯著差別（表3，圖5?D-E）。

綜上所述，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株的開花時間提前，株高和莖粗增加，說明在擬南芥中過表達(dá)BrcPRR5可以使擬南芥提早抽薹，花期提前，表明該基因具有促進(jìn)開花的功能。

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥表達(dá)量分析

為了進(jìn)一步驗證BrcPRR5在擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況，提取經(jīng)PCR分子鑒定的T1和T2轉(zhuǎn)基因植株和野生型擬南芥蓮座葉片的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄總RNA獲得的cDNA為模板，進(jìn)行RT?qPCR檢測，鑒定T1和T2轉(zhuǎn)基因株系中BrcPRR5的相對表達(dá)量（圖5?F）。結(jié)果表明，T1和T2轉(zhuǎn)基因株系中BrcPRR5表達(dá)量顯著高于野生型株系，說明BrcPRR5在擬南芥轉(zhuǎn)基因早花株系中過表達(dá)，從而促進(jìn)開花，增加植株高度和莖粗。

3 討論

在擬南芥中，PRR蛋白由5個基因家族編碼，被定義為生物鐘的核心組成部分（TIMING OF CAB EXPRESSION 1（TOC1）、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9）［17-21］。在長日照植物中，TOC1（也稱PRR1）的衰減會導(dǎo)致晚花并增加生物量［22］，在PRR7/PRR3亞組中，擬南芥prr7突變體和PRR7過表達(dá)品系的開花時間表明PRR7促進(jìn)開花［23-24］。但PRR3的過度表達(dá)導(dǎo)致開花晚［20］。

前人研究表明，在長日照條件下，CO轉(zhuǎn)錄受時鐘控制的藍(lán)光感光器FLAVIN?BINDING、KELCH REPEAT、F?BOX1（FKF1）、時鐘控制的循環(huán)自由因子CYCLING DOF FACTOR（CDF）和時鐘蛋白GIGANTEA（GI）控制。在這種機(jī)制中，F(xiàn)KF1?GI蛋白復(fù)合物通過以光依賴性方式結(jié)合并啟動CD（CO轉(zhuǎn)錄抑制因子）的降解來促進(jìn)CO的轉(zhuǎn)錄［25-27］。CO通過其激活“成花素”基因FLOWERING LOCUS T（FT）轉(zhuǎn)錄的能力直接促進(jìn)花的轉(zhuǎn)變［28］，也就是說，CO與FT結(jié)合可促進(jìn)植株提早開花。

在PRR9/PRR5亞群中，擬南芥PRR蛋白被稱為開花啟動子［29］，PRR介導(dǎo)的CO與FT啟動子結(jié)合，可增加其穩(wěn)定性，使FT增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和早花。此外，PRR將光照信息直接耦合到計時院并允許識別長日照［30］。PRR9/PRR5亞組基因可以控制短日照水稻的開花時間，促進(jìn)長日照擬南芥開花（圖6）［11,23］。

圖6 PRR9/PRR5亞群對開花時間和植株生物量影響的模型Fig. 6 Model for the effect of the PRR9/PRR5 sub-group on flowering time and plant biomass

在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，通過GO注釋分析差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，PRR5的差異倍數(shù)較高，由此推斷這可能會造成普通白菜花芽分化提前，因此，對該基因進(jìn)行了克隆，并將克隆得到的1 701 bp開放閱讀框，編碼566個氨基酸，然后進(jìn)行氨基酸序列多重比對、親緣關(guān)系分析、蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測等生物信息學(xué)分析，確定克隆得到的基因為普通白菜PRR5基因。對于該基因在不同部位的RT?qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在花中、莖中都有高表達(dá)，這和PRR5在2個部位上的作用有關(guān)，除卻其在開花時間上發(fā)揮的作用，其對于植物莖粗也有一定的影響。之后進(jìn)行超表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因功能驗證，通過統(tǒng)計植株生長指標(biāo)，轉(zhuǎn)基因植株的莖粗要明顯高于野生植株，這印證了之前的結(jié)論，同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株確實會使花期提前，這與前人研究的結(jié)果一致。研究結(jié)果為深入研究普通白菜成花機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

普通白菜BrcPRR5在莖和花蕾中的表達(dá)量高于葉和果莢。在S0時表達(dá)量最高，說明其對成花轉(zhuǎn)變有促進(jìn)作用，有利于植株提早抽薹開花。