劉艷霞，徐創(chuàng)龍，原淳淳，索文棟，楊景科，唐德志，徐浩

1.寧夏回族自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院暨中醫(yī)研究院，寧夏 銀川 750021；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200030

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是以關(guān)節(jié)軟骨退變、骨質(zhì)增生、軟骨下骨病變、滑膜炎癥等病理改變的一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病[1-2]，可引起疼痛、關(guān)節(jié)活動受限，嚴重時可致膝內(nèi)翻或膝外翻畸形，從而降低患者生活質(zhì)量。由于膝關(guān)節(jié)解剖結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)的特殊性，KOA在全世界291種致殘疾病中排名第11位[3]。目前KOA的發(fā)病機制不清楚，臨床主要治療方法為口服藥物治療。長期口服非甾體類藥物等對人體具有較大的副作用，如引起消化性潰瘍等，而中藥在治療本病時具有簡、效、廉等特點，且歷史悠久，經(jīng)驗豐富，能更好地改善KOA 患者癥狀[4]，從而明顯提高患者的生活質(zhì)量。在中醫(yī)理論中，KOA 多歸屬“膝痛”“骨痹”等范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)》指出“痛在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛……名曰骨痹”，骨痹發(fā)生于筋骨關(guān)節(jié)，發(fā)病的主要病機是“腎氣衰弱，寒濕入骨”，根據(jù)“腎主骨”“肝主筋”“脾主肌肉”的理論，確立了從肝腎脾論治骨痹的治則。有研究發(fā)現(xiàn)在治療“骨痹”的用藥規(guī)律中[5-6]，以肝腎虧虛為“骨痹”的發(fā)病根本，從“虛而補之”為根本治則，多選用歸肝、腎、脾經(jīng)的藥物。

枸杞子(Lycii Fructus)為常用中藥材之一，用藥歷史悠久，其為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果實。在《2020中國藥典》中記載，枸杞子歸肝、腎經(jīng)，具有滋補肝腎、益精明目等功效。研究顯示枸杞子中含有多糖、黃酮類、萜類、生物堿等多種生物活性成分，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、改善骨質(zhì)疏松等藥理活性[7]，是珍貴的藥食兩用植物資源。因此本研究通過構(gòu)建“藥物-成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，從而預(yù)測枸杞子治療KOA的有效成分及其作用機制，為后續(xù)研究枸杞子活性成分的作用于KOA的作用機制以及治療KOA的藥物的研發(fā)提供參照。

1 材料與方法

1.1 枸杞子藥物有效成分及靶點的獲取 通過在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺2.3(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性指數(shù)(drug likeness，DL)≥0.18 獲取枸杞子有效活性成分及各成分對應(yīng)的體內(nèi)作用靶點蛋白，將靶點蛋白輸入Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中(數(shù)據(jù)收集截止日期2022-08)，篩選條件為“Reviewed”，限定物種為“Human(人)”，合并后刪除重復(fù)基因，保留唯一值，最終得到枸杞子活性成分的候選靶標對應(yīng)的基因名。

1.2 枸杞子-活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將1.1 收集到的將枸杞子活性成分及其體內(nèi)作用的靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，構(gòu)建“枸杞子-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 枸杞子治療膝骨關(guān)節(jié)炎預(yù)測靶點的篩選 以“knee osteoarthritis”O(jiān)R“KOA”作為檢索詞，分別利用Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(http://www.genecard.org)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)來獲取膝骨關(guān)節(jié)炎的疾病相關(guān)基因，根據(jù)score 篩選KOA 相關(guān)靶點。將疾病靶點與藥物靶點導(dǎo)入微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)數(shù)據(jù)分析平臺繪制Venny圖，確定枸杞子治療KOA的作用靶點。

1.4 枸杞子治療膝骨關(guān)節(jié)炎靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將“1.1”項下獲得的枸杞子活性成分與1.3中枸杞子治療KOA 作用的潛在靶點導(dǎo)入生物信息分析軟件Cytoscape 3.9.1，構(gòu)建“枸杞子-主要活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選 將1.3 項下所獲共同靶點上傳至String (https://string-db.org/)平臺構(gòu)建枸杞子治療KOA 的PPI 網(wǎng)絡(luò)。將所獲相關(guān)tsv 格式數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件進行拓撲屬性分析，構(gòu)建“枸杞子治療KOA核心靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對接預(yù)測活性成分與膝骨關(guān)節(jié)炎的核心靶點基因結(jié)合活性 在Cytospace 3.9.2 中構(gòu)建“藥物-疾病-靶點”的作用網(wǎng)絡(luò)，將枸杞子發(fā)揮治療KOA的關(guān)鍵靶點及活性成分進行分子對接實驗，驗證其相互作用活性。根據(jù)Degree值由高到低進行排序，然后利用TCMSP數(shù)據(jù)庫下載的枸杞子發(fā)揮治療KOA主要的3 個活性成分三維分子結(jié)構(gòu)，通過PCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(https//www.rcsb.org/)下載枸杞子發(fā)揮治療KOA 的關(guān)鍵靶點蛋白分子下載，并根據(jù)分子對接蛋白結(jié)構(gòu)六大原則進行篩選，最終獲取可靠性最高的蛋白結(jié)構(gòu)并下載PDB Format 格式，利用StoneMIND Collector 軟件進行結(jié)構(gòu)識別和修飾，利用Discovery Studio Client 2019進行生物學(xué)驗證對接。

1.7 核心靶點GO 富集分析及KEGG 信號通路富集分析與可視化 利用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫6.8(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)對枸杞子潛在治療KOA 靶點進行GO (Gene Ontology)及KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路富集分析，篩選前五個具有顯著性差異的GO和KEGG數(shù)據(jù)予可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 枸杞子有效活性成分篩選結(jié)果 通過檢索和篩選后共獲取枸杞子有效活性成分共36 個(表1)。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫，將有效成分的靶標名稱轉(zhuǎn)換為人源基因并刪除重復(fù)基因后獲得203 潛在作用靶點，即得枸杞子活性成分體內(nèi)作用靶點。

表1 枸杞子有效活性成分Table 1 Effective active ingredients of Lycii Fructus

2.2 枸杞子-活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 收集到的枸杞子活性成分體內(nèi)作用靶標導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，構(gòu)建“枸杞子-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。該網(wǎng)絡(luò)共包括240個節(jié)點，其中中心的黃色節(jié)點代表枸杞子，36 個橙色節(jié)點代表枸杞子的活性成分，203 個綠色節(jié)點代表枸杞子活性成分體內(nèi)發(fā)揮作用的相關(guān)靶點，394 條邊代表枸杞子活性成分與相關(guān)的靶點的相互作用。其中槲皮素的節(jié)點值最大(Degree值為152)，說明其可能是枸杞子在體內(nèi)發(fā)揮疾病治療作用的關(guān)鍵有效成分。

圖1 枸杞子-活性成分－靶點網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Lycii Fructus-active ingredients-targets network diagram

2.3 枸杞子有效活性成分治療膝骨關(guān)節(jié)炎作用靶點預(yù)測及篩選 通過Gene Cards 平臺與OMIM 數(shù)據(jù)庫共獲取KOA 疾病相關(guān)靶點基因有2 303 個，以Relevance score≥2.687作為篩選條件后，獲得577個靶點基因。然后將枸杞子主要活性作用靶點與KOA 疾病靶點進行映射后獲得66靶點基因，即為枸杞子治療KOA的潛在作用靶點，見圖2。

圖2 枸杞子主要活性成分靶點與膝骨關(guān)節(jié)炎靶點Venn圖Figure 2 Venn diagram of the target of main active ingredient of Lycii Fructus and target of knee osteoarthritis

2.4 枸杞子藥物-活性成分-膝骨關(guān)節(jié)炎靶點網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將“2.3 中得到的共同靶點對應(yīng)上活性成分，制Excel表格，將該表導(dǎo)入Cytoscape3.9.2中，繪制得到枸杞子藥物-活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，該網(wǎng)共有79個節(jié)點，其中黃色節(jié)點代表枸杞子，12個橙色節(jié)點代表枸杞子的有效活性成分(36個有效成分中有24個無治療KOA的作用)，66個藍色節(jié)點代表枸杞子有效成分治療KOA關(guān)鍵靶點，102條邊代表枸杞子活性成分與疾病之間的相互作用。度值越高，則節(jié)點顏色越深，靶點越重要，其中槲皮素(quercetin)的節(jié)點值最大(Degree=60)，其次為β-谷甾醇、黃豆黃素(Degree 值均為11)，其中槲皮素作用于59個疾病靶點，主要作用于PTGS2、PTGS1、PLAU、PIK3CG、BCL2、BAX、JUN、CASP3、TGFB1、PON1、AR、PPARG 等(列舉Degree≥2)，說明槲皮素在枸杞子治療KOA中起關(guān)鍵作用。

圖3 枸杞子藥物-活性成分-膝骨關(guān)節(jié)炎靶點網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 Network diagram of Lycii Fructus-active ingredients-tar gets for knee osteoarthritis

2.5 枸杞子治療膝骨性關(guān)節(jié)炎作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點 將枸杞子治療KOA疾病潛在66個靶點輸入String平臺，構(gòu)建枸杞子治療KOA靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，PPI網(wǎng)絡(luò)(圖4)中包含66 個節(jié)點和272 個相互作用(連線)。網(wǎng)絡(luò)平均度值為33.4，平均聚集系數(shù)為0.784，P值：＜1.0e-16。將獲得的相關(guān)tsv 格式數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.9.2軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，如圖5所示，圓形圖標則代表核心靶點。這些靶點中度值越高，則節(jié)點顏色越深，靶點越重要，度值排名靠前的靶點(列舉前10 個核心靶點，見表2)有腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-6(IL-6)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、細胞腫瘤抗原p53 (TP53)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP9)、重組人胱天蛋白酶3(CASP3)、前列素G/H合成酶2(PTGS2)、c-Jun氨基端激酶(JUN)、表皮生長因子(EGF)等，這10個關(guān)鍵靶點可能通過降低炎癥因子表達水平及調(diào)控骨細胞合成代謝的生物過程等在枸杞子治療KOA 作用機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖4 枸杞子治療膝骨關(guān)節(jié)炎的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 PPI network diagram of Lycii Fructus in the treatment of knee osteoarthritis

表2 核心靶點的拓撲學(xué)參數(shù)信息Table 2 Topological parameter information of the core target

2.6 分子對接預(yù)測活性成分與膝骨關(guān)節(jié)炎的核心靶點基因結(jié)合活性 對圖3所示網(wǎng)絡(luò)圖進行分析，得到枸杞子治療KOA 主要活性成分(槲皮素、β-谷甾醇、黃豆黃素)，將這些成分與網(wǎng)絡(luò)中度值較高的核心靶點PTGS2、PTGS1、OPRM1進行分子對接分析(表3、圖6)。枸杞子主要活性成分與活性位點關(guān)鍵氨基酸殘基形成極性或非極性鍵，以穩(wěn)定配體和受體的結(jié)合。枸杞子主要活性成分相互作用力分析結(jié)果顯示，主要活性成分通過范德華力、氫鍵、Pi 相互作用與關(guān)鍵靶點的活性位點相結(jié)合。

圖6 分子對接模式圖Figure 6 Molecular docking

表3 枸杞子治療膝骨關(guān)節(jié)炎主要活性成分及作用靶點Table 3 Main active ingredients and targets of Lycii Fructus in the treatment of knee osteoarthritis

2.7 枸杞子治療膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)鍵靶點基因GO和KEGG富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對篩選所獲66個枸杞子治療KOA關(guān)鍵靶點基因進行GO-BP、GO-CC、GO-MF和KEGG富集分析。GO-BP、GO-CC、GO-MF分析均以P＜0.01條件進行篩選，按P值從小到大排序取前5條通路進行分析。生物過程(BP)分析中主要涉及基因表達的正向調(diào)控(positive regulation of gene expression)、炎癥反應(yīng)(inflammatory respons)、藥物反應(yīng)(response to drug)、細胞對脂多糖的反應(yīng)(cellular response to lipopolysaccharide)等。細胞組分(CC)涉及細胞外空隙(extracellular space)、細胞外區(qū)域(extracellular region)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum lumen)、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix)等。分子功能(MF)分析中主要涉及酶結(jié)合(enzyme binding)、絲氨酸蛋白酶肽鏈內(nèi)切酶活性(serine-type endopeptidase activity)、相同的蛋白結(jié)合(identical protein binding)、細胞因子活性(cytokine activity)等(圖7)，由此推測出枸杞子的活性成分可能通過干預(yù)以上生物過程發(fā)揮治療KOA 的作用。KEGG富集的通路結(jié)果(圖8)顯示，枸杞子主要通過晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complication)、癌癥信號通路(pathways in cancer)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路(lipid and atherosclerosis)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)等信號通路發(fā)揮治療KOA 的作用。

圖7 枸杞子治療膝骨關(guān)節(jié)炎靶點GO分析Figure 7 GO analysis of target of Lycii Fructus in the treatment of knee osteoarthritis

圖8 枸杞子治療膝骨關(guān)節(jié)炎的靶點KEGG分析Figure 8 KEGG analysis of target of Lycii Fructus in the treatment of knee osteoarthritis

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，枸杞子發(fā)揮治療KOA主要活性成分是槲皮素。有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可促進脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖，調(diào)控軟骨細胞外基質(zhì)合成與代謝平衡，抑制炎癥反應(yīng)，恢復(fù)軟骨細胞功能[8-11]。此外研究表明，局部炎癥因子釋放相關(guān)及軟骨細胞不能維持細胞外基質(zhì)和軟骨下骨合成和降解之間的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致KOA 發(fā)生[12]。因此，枸杞子中發(fā)揮治療KOA 最主要活性成分為槲皮素，可能與調(diào)控軟骨細胞的代謝平衡、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、改善內(nèi)環(huán)境的炎癥反應(yīng)等機制密切相關(guān)。

本研究枸杞子藥物-活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖和PPI結(jié)果表明，枸杞子中多種有效成分作用于TNF、IL6、AKT-1 關(guān)鍵靶點基因。TNF 和IL-6 是一種具有多功能的細胞因子，且參與炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)TNF能促進膠原酶和前列腺素E2的產(chǎn)生及IL-6的分泌，可使軟骨及軟骨下骨結(jié)構(gòu)改變、刺激軟骨細胞增殖，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹以及軟骨侵蝕等炎癥反應(yīng)，加重KOA患者的臨床表現(xiàn)[13-16]。也有研究表明KOA患者關(guān)節(jié)損傷程度與血清中TNF-α、IL-6 水平顯著相關(guān)[17]。AKT1 參與調(diào)節(jié)新陳代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成等過程[18]，研究發(fā)現(xiàn)AKT1 參與軟骨內(nèi)骨化過程，抑制骨贅的形成，還可以通過磷酸化使蛋白聚糖的合成增多，促進了人關(guān)節(jié)軟骨細胞的細胞活力[19-20]。因此可以推測枸杞子各成分主要作用于炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)、調(diào)控軟骨細胞的增殖、分化等相關(guān)的靶點發(fā)揮治療KOA。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對枸杞子治療KOA關(guān)鍵靶標進行GO富集分析，研究顯示這些靶點與PPI網(wǎng)絡(luò)分析的規(guī)律相一致，也與KOA發(fā)病機制相符合。

KEGG信號通路富集結(jié)果顯示，枸杞子治療KOA核心靶點基因參與的多條信號通路，主要涉及晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體(AGEs-RAGE)、癌癥、白介素17 (IL-17)信號通路等，其中AGEs-RAGE信號通路富集最顯著，AGEs 通過與受體RAGE 結(jié)合產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活大量促炎癥細胞因子、生長因子和黏附分子等的表達和釋放，使軟骨細胞合成和分解代謝的失衡，進而調(diào)控細胞凋亡或存活、誘發(fā)炎癥反應(yīng)等[21-23]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)IL-17 作為一種重要的炎癥細胞因子，當KOA 關(guān)節(jié)液中IL-17 升高時，關(guān)節(jié)軟骨IL-17信號通路關(guān)鍵蛋白，最終激活NF-κB，啟動下游炎癥反應(yīng)[24]。王國良[25]、馮方等[26]研究發(fā)現(xiàn)KOA患者的滑膜液和滑膜中的IL-17 水平增加且與KOA嚴重性呈正相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)通過抑制IL-17 及其受體的生物學(xué)效應(yīng)時可減輕關(guān)節(jié)炎的滑膜炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)IL-17 基因表達水平可能會減輕患者臨床癥狀。GO和KEGG富集結(jié)果表明，枸杞子治療KOA作用機制涉及多個生物學(xué)過程和多條重要的信號通路。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建“藥物-成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測枸杞子治療KOA的主要活性成分為槲皮素，以TNF、IL-6、AKT-1 為關(guān)鍵靶點，可能通過調(diào)控軟骨細胞的代謝平衡、促進細胞增殖、分化、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、改善內(nèi)環(huán)境的炎癥反應(yīng)等機制，為枸杞子在臨床中作用于KOA 研究方面提供了方向和思路，但本研究通過調(diào)取相關(guān)數(shù)據(jù)庫對藥物的活性成分作用于疾病靶點及核心靶點基因參與的信號通路進行預(yù)測，仍存在一定的局限性，結(jié)論需進行后期實驗研究加以驗證。