姜舒,王飛,2,王旭峰,熊涵錚,彭楠,趙述淼,胡詠梅*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,武漢 430070;2.湖北省普林標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司,武漢 430056)

豆豉是以黃豆或黑豆為主要原料,經(jīng)微生物發(fā)酵而成的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品[1]。豆豉的風(fēng)味獨(dú)具特色,不僅可作為調(diào)味品,而且可入藥[2-3]。豆豉中含有豐富的生理活性物質(zhì),如大豆異黃酮[4]、γ-亞麻酸[5]、豆豉纖溶酶(Douchi fibrinolytic enzyme,DFE)[6]、血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制肽[7]等,能夠有效地預(yù)防心腦血管疾病,具有較高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值,深受廣大消費(fèi)者喜愛。

按照參與發(fā)酵的微生物的不同,可將豆豉分為曲霉型、毛霉型、根霉型及細(xì)菌型豆豉[8]。豆豉的生產(chǎn)主要分為制曲和發(fā)酵兩大工序[9]。制曲的目的是以黃豆或黑豆為原料,在一定條件下積累霉菌或細(xì)菌等微生物的菌體及其所產(chǎn)生的酶。出曲后,拌入食鹽、酒等輔料,進(jìn)入發(fā)酵階段,再以分泌的蛋白酶、淀粉酶等將大豆中的大豆蛋白、淀粉等大分子物質(zhì)降解為小分子的肽、氨基酸、還原糖等[10]。同時(shí),酵母、乳酸菌等風(fēng)味菌也參與了豆豉風(fēng)味的形成[11]。

在豆豉的后發(fā)酵階段,豆豉中的食鹽起到了抑制發(fā)酵微生物的生長(zhǎng)繁殖、保障安全發(fā)酵、賦予豆豉風(fēng)味的作用[12]。然而,研究發(fā)現(xiàn)食鹽攝入量過(guò)高會(huì)引發(fā)高血壓、冠心病等多種疾病[13]。作為百姓常用的調(diào)味品,豆豉中的鹽含量也讓人擔(dān)憂。減鹽、輕鹽調(diào)味品是降低食鹽中鈉攝入的重要途徑。隨著“低鹽”、“減鹽”等健康概念的普及,降低調(diào)味品中的鹽度是近幾年調(diào)味品的大趨勢(shì)[14-15]。此外,也有研究表明在發(fā)酵過(guò)程中減鹽會(huì)降低微生物的滲透壓,有利于氨基酸態(tài)氮、氨基酸和揮發(fā)性風(fēng)味化合物的積累[16]。目前,豆豉中的鹽含量多在12%左右[17]。本文研究了7%、9.5%、12%的鹽度對(duì)曲霉型豆豉發(fā)酵理化性質(zhì)的影響,以期為低鹽豆豉的開發(fā)生產(chǎn)與質(zhì)量控制提供技術(shù)指導(dǎo)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 發(fā)酵菌種、原料與試劑

米曲霉孢子粉(曲精):購(gòu)自山東濟(jì)寧玉園生物科技有限公司。黃豆、食鹽、米酒、白酒:均為市售。甲醛、氫氧化鈉、濃鹽酸、磷酸、碳酸鈉、三氯乙酸、十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉、乳酸、乳酸鈉、硼酸、硼酸鈉、酪素、L-酪氨酸、DNS等化學(xué)試劑:均為分析純,均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

PL303電子分析天平、101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、通風(fēng)曲床、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、721型光光度計(jì)、HJ-5多功能攪拌器等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豆豉的生產(chǎn)工藝流程

黃豆→篩選→浸泡→蒸煮→冷卻→接種、制曲→拌食鹽、米酒、白酒后入缸,水浴保溫發(fā)酵→檢驗(yàn)、包裝→成品。

將去除雜質(zhì)的黃豆采用30 ℃水溫浸泡1.5 h后瀝干,蒸汽常壓蒸煮3 h。出料后,按萬(wàn)分之二加入米曲霉曲精,拌和均勻,在通風(fēng)曲床上維持30～35 ℃品溫制曲46 h,期間翻曲2次。出曲后,分為3組,分別按7%、9.5%、12%加入食鹽,每組按2%加入米酒和白酒,拌和均勻,使食鹽和水分均勻滲入豆豉曲胚內(nèi)部。待曲胚充分拌和均勻后,入陶缸,水浴40～55 ℃保溫發(fā)酵,后發(fā)酵20 d[18-19]。

1.2.2 總酸和氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

總酸和氨基酸態(tài)氮的測(cè)定采用酸堿滴定法[20]與甲醛滴定法[21]。首先稱取5 g試樣,研碎后加入到100 mL容量瓶中,加蒸餾水定容至100 mL,以8 000 r/min離心10 min。吸取上清液10.0 mL置于200 mL的燒杯中,加入60 mL的蒸餾水,開動(dòng)磁力攪拌器,用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至酸度計(jì)指示pH為8.2,記下消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積,計(jì)算總酸含量。然后加入10.0 mL甲醛溶液,混勻,再用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液繼續(xù)滴定至pH為9.2,記下消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積,計(jì)算氨基酸態(tài)氮含量。以蒸餾水為空白對(duì)照試樣,氨基酸態(tài)氮的計(jì)算公式如下:

式中:X表示試樣中氨基酸態(tài)氮的含量,g/100 g;V1表示滴定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積,mL;V2表示試劑空白試驗(yàn)加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積,mL;c表示氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度,mol/L;V3表示試樣稀釋液取用量,mL;0.014為與氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[c(NaOH)=0.050 mol/L]相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量,g。

1.2.3 蛋白酶酶活的測(cè)定[22]

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別吸取0,10,20,30,40,50 μg/mL的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL,加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.00 mL、福林試劑1.00 mL,置于(40±0.2) ℃的水浴中顯色20 min后,采用10 mm比色皿,采用分光光度計(jì)在680 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色,以不含酪氨酸的零管為空白管調(diào)零,測(cè)定其吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo),酪氨酸濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。

酶液的制備:準(zhǔn)確稱取1.000 g試樣,加少量的相應(yīng)緩沖液,充分研磨,轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中,稀釋至刻度后,用4層紗布過(guò)濾,取濾液待測(cè)。

樣品的測(cè)定:先將10 g/L酪素溶液在(40±0.2) ℃的水浴中預(yù)熱。取4支試管,各加1.00 mL待測(cè)酶液。取1支作為空白管,加2.00 mL三氯乙酸;其他3管作為測(cè)試管,各加入1.00 mL預(yù)熱的酪素溶液,搖勻后于(40±0.2) ℃的水浴中保溫10 min。取出試管,在3支測(cè)試管中分別加入2.00 mL三氯乙酸,在空白管中加入1.00 mL預(yù)熱的酪素溶液,靜置10 min后過(guò)濾。再各取濾液1.00 mL,加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.00 mL、福林試劑1.00 mL,置于(40±0.2) ℃的水浴中顯色20 min后,采用10 mm比色皿,采用分光光度計(jì)在680 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色,以空白管調(diào)零,測(cè)定其吸光度值。

酶活的定義:1 g試樣在40 ℃(酸性pH 3.0、中性pH 7.5、堿性pH 10.5)的條件下,1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg 酪氨酸為一個(gè)酶活力單位。

1.2.4 氨基酸含量的測(cè)定

試樣送至農(nóng)業(yè)部微生物產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(武漢)進(jìn)行氨基酸分析檢測(cè)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007 進(jìn)行整理,使用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用Origin 8.6 和Adobe Illustrator CS3作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽度對(duì)豆豉發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶酶活的影響

由圖1中A可知,在制曲階段,曲料中的酸性蛋白酶酶活先升后降,在18 h時(shí)達(dá)最高,30 h后降低幅度不明顯;中性蛋白酶酶活在12～30 h內(nèi)增加迅速,30 h時(shí)最高,是酸性蛋白酶的3.3倍;堿性蛋白酶酶活一直呈逐漸升高的趨勢(shì)。適宜的制曲時(shí)間為30～42 h。

圖1 豆豉發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶酶活的變化Fig.1 Change of protease activity during the fermentation of fermented soybeans

由圖1中B～D可知,在后發(fā)酵階段,隨著鹽的加入,3種蛋白酶酶活均呈下降趨勢(shì),其中4 d時(shí)酶活下降明顯;4～16 d,在3種鹽度的豆豉中中性蛋白酶酶活無(wú)明顯下降,尤其是7%鹽度的豆豉中一直維持著較高的蛋白酶酶活水平;至20 d時(shí),在9.5%和12%鹽度的豆豉中幾乎檢測(cè)不出酸性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活。總體看來(lái),在后發(fā)酵期間,7%鹽度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于12%鹽度豆豉中的蛋白酶酶活。

2.2 不同鹽度對(duì)豆豉發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量的影響

由圖2中A可知,在制曲階段,曲料的氨基酸態(tài)氮含量在18 h內(nèi)上升很快,從0.06%升至0.23%,18 h之后趨于平穩(wěn)。

圖2 豆豉發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.2 Change of amino acid nitrogen content during the fermentation of fermented soybeans

由圖2中B可知,在后發(fā)酵階段,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,豆豉中的氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加,而且鹽度越低,豆豉的氨基酸態(tài)氮含量越高。鹽度為7%、9.5%、12%的豆豉在后發(fā)酵20 d時(shí)的氨基酸態(tài)氮含量分別為0.92%、0.88%、0.61%。

2.3 不同鹽度對(duì)豆豉發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的影響

由圖3可知,在制曲階段,曲料的總酸含量起伏較大,在18 h時(shí)升至最高后下降,30 h后又略有上升,至制曲42 h為1.13%。拌入食鹽等配料進(jìn)入后發(fā)酵階段后,7%鹽度豆豉的總酸含量呈平穩(wěn)上升趨勢(shì);9.5%和12%鹽度豆豉的總酸含量先下降后逐漸上升。在后發(fā)酵階段結(jié)束時(shí),豆豉的鹽度越低,總酸含量越高;鹽度為7%、9.5%、12%的豆豉總酸含量分別為1.84%、1.79%、1.28%,均控制在2%的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)。

圖3 豆豉發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化Fig.3 Change of content of total acids during the fermentation of fermented soybeans

2.4 不同鹽度對(duì)豆豉成品氨基酸含量的影響

經(jīng)測(cè)定,不同鹽度的豆豉產(chǎn)品中各種氨基酸含量見表1。

表1 不同鹽度豆豉中的氨基酸含量Table 1 Content of amino acids in fermented soybeans with different salinities %

由表1可知,豆豉的鹽度越低,氨基酸總含量越高。鹽度為7%、9.5%、12%的豆豉氨基酸總含量分別為30.30%、28.21%、26.38%;鮮味氨基酸含量分別為15.48%、15.18%、14.25%,與12%鹽度的豆豉相比,7%、9.5%鹽度的豆豉分別提升了8.63%和6.53%。其中,谷氨酸含量分別增加了6.12%和3.96%;天門冬氨酸含量分別增加了8.88%和7.16%。

3 結(jié)論

本文研究了7%、9.5%、12%的鹽度對(duì)豆豉發(fā)酵理化性質(zhì)的影響,結(jié)果表明,鹽度越低,豆豉成品的蛋白酶酶活、氨基酸態(tài)氮、總酸和氨基酸總含量越高。后發(fā)酵20 d后,鹽度為7%、9.5%、12%的豆豉的氨基酸態(tài)氮含量分別為0.92%、0.88%和0.61%,總酸含量分別為1.84%、1.79%和1.28%,氨基酸總含量分別為30.30%、28.21%和26.38%。從營(yíng)養(yǎng)健康和產(chǎn)品質(zhì)量方面考慮,豆豉發(fā)酵適宜的鹽度為7%～9.5%。本研究為豆豉的生產(chǎn)開發(fā)與質(zhì)量控制提供了技術(shù)指導(dǎo)和參考依據(jù)。