林麗，高素芳，晉玲*，陳紅剛，崔治家，王亞麗

1.甘肅中醫(yī)藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000；

2.西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000

秦艽Gentiana macrophyllaPall.別名大葉龍膽、大葉秦艽、西秦艽[1]，為常用中藥，在藏族藥、蒙古族藥中也常用。《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規(guī)定藥材秦艽為龍膽科植物秦艽G.macrophyllaPall.、麻花秦艽G.stramineaMaxim.、粗莖秦艽G.crassicaulisDuthie ex Burk.或小秦艽G.dahuricaFisch.的干燥根。秦艽屬植物種類繁多，主要以野生資源為主，但濫采濫挖使其資源匱乏，偽品頻繁出現(xiàn)導致藥材市場混亂，因此本研究對《中國藥典》2020 年版規(guī)定的4 種基原的秦艽屬植物及其他幾種秦艽屬植物進行相關性研究。

目前，秦艽屬植物的質量評價主要集中在傳統(tǒng)鑒別手段及高效液相色譜[2-5]、氣相色譜技術[6]方面，缺少傳統(tǒng)感官評價的全局性、整體性、模糊性[7]。20世紀90 年代發(fā)展起來的電子鼻是模擬生物嗅覺傳導機制設計的，由傳感器陣列和適當的模式識別系統(tǒng)組成，其識別的是樣品中揮發(fā)性成分的整體信息，亦稱“電子指紋”[8-21]。由于電子鼻的特點及其方便快捷的優(yōu)越性，其已被廣泛應用于環(huán)境檢測、食品工業(yè)、農業(yè)等方面[22-30]，但其在中藥材、中成藥領域的應用研究報道尚不多見。外觀性狀是中藥質量重要評價指標，涉及到形態(tài)、色澤、氣味、質地等方面。其中，顏色和氣味是中藥外觀質量檢查中的主要指標。由于目前仍是通過眼看、鼻聞、口嘗的方法來控制中藥的顏色和氣味，檢測結果不可避免地受到感觀差異和檢測環(huán)境的影響，客觀性和準確性難以保證。而電子鼻客觀評價氣味，使得其在客觀表達和控制中藥外觀信息氣味方面表現(xiàn)出巨大的應用潛力，而電子鼻的工作原理恰恰符合傳統(tǒng)中藥“四氣五味”的藥性原理。

因此，本研究以39 批秦艽為研究對象，通過電子鼻技術建立一種針對秦艽的準確性好且簡便可行的鑒別方法，為中藥材揮發(fā)性成分的鑒定提供新思路和方法。

1 材料

1.1 試藥

39 批秦艽樣品經甘肅中醫(yī)藥大學晉玲教授鑒定，樣本保存在甘肅中醫(yī)藥大學藥學院實驗教學中心中藥標本室，具體信息見表1。

表1 秦艽樣品信息

1.2 儀器

Pen3型電子鼻（德國Airsense公司），12根傳感器均為金屬氧化物傳感器，傳感器具體信息見表2；XSE 205DU型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

表2 電子鼻金屬氧化物傳感器信息

2 方法

2.1 樣品制備

選取慶陽市合水縣野生X1秦艽樣品，用粉碎機打粉，分別過20、40、60、80、100 目篩，編號后密封保存以防氣味散失。

2.2 電子鼻數據采集

采用直接頂空吸氣法，設置電子鼻的工作參數，待儀器運行穩(wěn)定后，稱取適量樣品置于樣品瓶中密封放置固定時間，在室溫條件下直接將進樣針頭插入裝有秦艽粉末的10 mL 頂空進樣瓶中進行氣味數據的采集，每個樣品做3個重復。

2.3 因素水平及條件篩選

初步設計為4 個影響因素，分別為樣品顆粒度大小、電子鼻進氣量、測量前密封放置時間及被檢測樣品的稱樣量；單因素水平均設置為5 個水平，每水平3個重復。

2.4 檢測條件的優(yōu)化

設定進氣量分別為100、150、200、250、300 mL·min-1，放置時間分別為5、10、15、20、25 min，樣品質量分別為1、2、3、4、5 g。

2.5 數據分析

采用Winmuster 1.6.2 軟件中的主成分分析（PCA）、線性判別分析方法（LDA）及負荷加載分析法（Loadings）對實驗數據進行分析。

3 結果與分析

3.1 電子鼻響應值及因素水平篩選

采用電子鼻對秦艽樣品的氣味進行采集，得到10 個傳感器的響應圖（圖1）。圖1 中，每條曲線代表1 個傳感器，曲線上的點代表秦艽的氣味物質通過傳感器通道時相對電阻率（G/G0，其中G為被測氣體的響應值，G0為空氣的響應值）隨進樣時間的變化情況。由圖1 可知，從進樣初到最終樣品氣體平穩(wěn)過程中，G/G0快速增加，然后有所降低，最后趨于穩(wěn)定，表明電子鼻對秦艽氣味識別靈敏、穩(wěn)定，說明秦艽氣味中所含的化學成分相對穩(wěn)定、揮發(fā)性較好，可采用電子鼻進行測定。

圖1 電子鼻對秦艽的響應曲線

將電子鼻測得的數據輸入SPSS 25 軟件中進行分析，考察樣品顆粒度、電子鼻進氣量、密封放置時間及樣品稱樣量對主要成分含量（區(qū)分能力強且峰面積較大的色譜峰）的影響，結果見表3～表6。從表3 可知，當其他因素固定不變，電子鼻測得的主要成分含量會隨著進氣量的變化而變化，當進氣量為250 mL·min-1時可得到最佳主要成分含量和最小偏差，故后續(xù)研究最佳進氣量確定為250 mL·min-1。同理，由表4～表6 可以分別得到最佳放置時間15 min、最佳稱樣量3 g、最適顆粒度60目。

表3 進氣量對秦艽樣品主要成分質量分數的影響（±s,n=3）

表3 進氣量對秦艽樣品主要成分質量分數的影響（±s,n=3）

注：不同字母代表P＜0.05，表4～表6同。

表4 放置時間對秦艽樣品主要成分質量分數的影響（±s,n=3）

表4 放置時間對秦艽樣品主要成分質量分數的影響（±s,n=3）

表5 稱樣量對秦艽樣品主要成分質量分數的影響（±s,n=3）

表5 稱樣量對秦艽樣品主要成分質量分數的影響（±s,n=3）

表6 顆粒度對秦艽樣品主要成分質量分數的影響（±s,n=3）

表6 顆粒度對秦艽樣品主要成分質量分數的影響（±s,n=3）

3.2 PCA區(qū)分不同種的秦艽

PCA 是一種多元統(tǒng)計方法，在一定程度上可以實現(xiàn)多指標數據的轉換和降維，并對其結果進行線性分類，最終呈現(xiàn)二維/三維圖。本研究采用的PCA可以在沒有任何樣品信息的情況下，迅速瀏覽所有數據，篩選出其中區(qū)分能力強（discrimination power＞0.900）、峰面積大（range＞1000）且分離效果較好的色譜峰作為傳感器，進行PCA，最終建立模型。采用3.1 項建立的秦艽的最佳檢測方法對不同產地的秦艽進行檢測，然后將氣味數據調入電子鼻自帶的Winmuster 1.6.2 軟件中，選取在5～53 s 平穩(wěn)時間段的數據進行分析，結果見圖2。圖2結果顯示，第一主成分（PC1）方差貢獻率為88.24%，第二主成分（PC2）方差貢獻率為9.05%，PC1和PC2累積方差貢獻率為97.29%，基本代表秦艽所有電子鼻特征信息。PCA 能夠較好區(qū)分6 種秦艽，彼此之間無重疊，且整體的最低區(qū)分度也達到了70%以上，表明不同種的秦艽之間存在較大差異。6 種秦艽樣品中與其他樣品的區(qū)分度最高者為黃管秦艽，與其他5 種秦艽區(qū)分度都達到了95%以上，最高達到了99.7%；秦艽和小秦艽樣品的數據分散，不夠穩(wěn)定，雖未重疊，但其之間差異相距較近，說明傳感器對其響應值較小，由此可知其所含成分的含量相近，不易區(qū)分。總體來看，6種秦艽樣品聚類區(qū)分的結果顯示不同種秦艽之間氣味差異較明顯。

圖2 不同產地秦艽的PCA

3.3 LDA區(qū)分不同種的秦艽

LDA 是一種常用的分類方法，應用該方法需要樣本空間呈正態(tài)分布，并有相等的離差。構造的判別函數由原始變量經線性組合得出，能夠最大限度地區(qū)分不同的樣本集，在降低數據空間維數的同時最大限度地減少信息丟失。這種數學分類規(guī)則可將N維空間分成子空間，并從而將其定義在直線、平面或超平面上。這種計算判別函數的方法可以使組間變異與組內變異的比率達最大。

由圖3可知，LDA 中判別式1和判別式2的方差貢獻率分別為54.98%和41.05%，兩判別式的累積方差貢獻率為96.03%。運用LDA可以使6個種的秦艽完全分開而不與其他的有重疊，且較PCA 區(qū)分效果更好，表明LDA 更適合對不同種的秦艽進行區(qū)分，因此后續(xù)采用LDA 對同種秦艽的不同產地進行區(qū)分。

圖3 LDA對不同種秦艽的區(qū)分

3.4 LDA區(qū)分不同產地的粗莖秦艽

由圖4 可知，8 個產地的粗莖秦艽有4 個產地的可以很好地與其他產地樣品區(qū)分來，其中C2、C3、和C8 均為云南省不同州的粗莖秦艽的栽培品，而C6 為甘肅和政的野生粗莖秦艽，由此可以分析，云南省不同州栽培的秦艽品質存在較大差異，可能與各地的栽培方式以及環(huán)境條件有關；C6 為野生資源，可以看出其與另外7 個樣品相距較遠，證明了野生秦艽與栽培品之間的差異性，也驗證了野生資源的不可替代性。C1、C4、C5 和C7 間有重疊，無法分開，說明其氣味十分相近，可能是生長海拔相近所致，說明海拔對秦艽化學成分的生成有一定影響。

圖4 LDA區(qū)分不同產地的粗莖秦艽

由圖5 可以看出，LDA 對大葉秦艽的區(qū)分效果較好，11 個產地的樣品有5 個不能很好地分開，其余6 個樣品都達到了較好的分離度。不同產地的大葉秦艽較粗莖秦艽質量差異更大，可能是因為大葉秦艽的生長環(huán)境條件要求更嚴格，所以產地變化對其所含的成分的含量有較大影響，所以電子鼻可以很好地區(qū)分開。D2 和D9 有交集，區(qū)分效果欠佳，但D6 和D7 幾乎完全重疊，說明電子鼻中傳感器對其氣味響應敏感程度一致，不能區(qū)分，可能是因為產地相鄰，且海拔相近，所以生物氣味也相同，又因為D7 和D8 為野生資源，D6 為一等品，可得出栽培品中的一等品與野生資源中的揮發(fā)性成分相近，說明人為分出的等級是合理的，即對秦艽進行等級劃分是有必要的。

圖5 LDA對不同產地大葉秦艽的區(qū)分

由圖6可知，LDA 對不同產地麻花艽進行分析，第一判別式的方差貢獻率為78.15%，第二判別式的方差貢獻率為13.76%，累積方差貢獻率達91.91%。LDA 對麻花艽的區(qū)分度很高，6 個產地的都可以被完全分開，只有M4 和M8 沒有分開，可能是由于這2 個產地的人工栽培條件或者自然生長條件類似，以致這2 個產地的秦艽氣味相似，電子鼻無法將其區(qū)分開。

圖6 LDA對不同產地麻花艽的區(qū)分

由圖7、圖8 可知，運用LDA 分析不同產地黃管秦艽、小秦艽都可以完全區(qū)分開，且相對于樣本量較大的粗莖秦艽、麻花秦艽等區(qū)分度更高，由此可知，電子鼻對小容量樣品區(qū)分更好。黃管秦艽與小秦艽都為3 個樣本，但是秦艽比小秦艽區(qū)分度高，因為秦艽的產地差別大，可能所含成分差別大，而小秦艽都產自甘肅，氣味較相似，表明了電子鼻對不同產地的秦艽區(qū)分準確性好。

圖7 LDA對不同產地小秦艽的區(qū)分

圖8 LDA對不同產地黃管秦艽的區(qū)分

3.5 Loadings區(qū)分不同產地的秦艽

由圖9 可知，1 號、2 號、9 號即W1W、W2W、W5S 傳感器對模式識別影響較大，對區(qū)分不同產地秦艽樣品的貢獻率最大，由此得出秦艽中所含芳香類成分和氮氧化合物含量較其他成分多。W1S、W2S、W1C、W6S、W3S 傳感器幾乎無響應，貢獻率低，趨近于0。3 號和8 號即W5C 和W3C 具有相似的負載因子。

圖9 Loadings傳感器貢獻率分析

4 結論與討論

由于電子鼻技術對秦艽的氣味響應靈敏、穩(wěn)定，故本研究考察了電子鼻響應值及進氣量、放置時間、稱樣量、顆粒度對秦艽樣品的區(qū)分度的影響，最終確立了電子鼻技術對秦艽最佳的樣品前處理條件，可以用于區(qū)分不同種、不同產地的秦艽樣品。

本研究主要采用LDA、PCA、Loadings 3 種分析方法對秦艽樣品的電子鼻的結果進行分析，結果顯示，LDA 較PCA 更適合秦艽的產地鑒定。Loadings 分析可得秦艽中芳香類成分和氮氧化合物含量較高，與化學鑒定結果一致。與現(xiàn)有研究相比[31]，算法的多樣性增加了實驗的可靠性及準確性，因此，電子鼻技術可以準確區(qū)分不同種的秦艽，對于同種不同產地的秦艽的區(qū)分樣本容量越小其區(qū)分能力越強，準確度越高；秦艽的產地、生長地海拔高度、栽培方式等都會影響電子鼻對其的區(qū)分，產地距離越近越不易區(qū)分，反之則區(qū)分度越高；海拔相差越大，電子鼻對其區(qū)分越好；野生資源與人工栽培品之間差異大，更容易區(qū)分。

中藥具有的氣味是評價其質量的主要依據之一，也是其真?zhèn)渭爱a地鑒別的重要依據[32-33]。當前對中藥材的鑒別大多是傳統(tǒng)的鑒別方法，在中藥真?zhèn)舞b別中的應用較為廣泛，但在不同產地藥材之間的鑒別中存在一定的困難。另外，現(xiàn)代技術如薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）及GC-質譜法（MS）等在中藥的鑒別上應用廣泛，但由于樣品前處理過程復雜，費用高昂、污染環(huán)境等問題也逐漸顯現(xiàn)出來，而且這些技術往往是針對單一成分或幾類成分的定性、定量研究。與之相比，電子鼻技術在分析樣品時過程相對簡單，分析速度快，并且是對樣品“氣味”的整體性研究。所以，電子鼻技術在中藥的鑒別中有很好的應用價值。本研究結果表明，電子鼻可用來區(qū)分不同產地甚至不同栽培方式的秦艽，避免了使用各種有機溶劑造成的環(huán)境污染，人體主觀因素及其他因素造成的對秦艽產區(qū)、栽培方式的誤判，也可防止相似的藥材混淆和冒充。此項研究為電子鼻用于秦艽產地和秦艽栽培方式的鑒別提供了新思路和方法。

甘肅、青海、四川、山西、陜西、寧夏為秦艽樣本分布較多的省域，本研究所采用的秦艽樣本整體分布區(qū)域較廣泛，考慮到了不同省域不同地區(qū)樣本的差異性，以及同一樣本不同生態(tài)型（野生與栽培）的差異性。由于秦艽個別種本身分布區(qū)域小，獲取樣本量有限，導致個別實驗分析缺乏一定的指導性，有待進一步深入研究