肖芊含，王宇帆，曹蔚

西北農林科技大學 化學與藥學院，陜西 楊凌 712100

多糖是由超過10 個單糖基通過糖苷鏈連接而成的大分子天然活性物質。作為中藥主要的水溶性成分，多糖有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、抗衰老、抗病毒和抗疲勞等多種藥理活性[1]，且具有有效、低毒的優(yōu)點，作用機制多靶點、多通路。近年來逐漸發(fā)現(xiàn)生物體內糖類結合分子在腫瘤、免疫、衰老等信號轉導中的重要調控作用，極大地推動了中藥多糖結構和功能研究的快速發(fā)展，也為闡明多糖這一中藥發(fā)揮獨特療效的重要水溶性成分的作用機制拓寬了視野?；诖吮疚膶χ兴幎嗵窃隗w內的藥動學、主要作用靶點及其構效關系進行綜述，以期進一步闡釋中藥多糖的體內作用機制，并為其進行綜合利用開發(fā)提供參考。

1 中藥多糖的藥動學研究進展

口服給藥是臨床使用中藥的主要給藥途徑。中藥多糖給藥后能否進入血液循環(huán)進而分布于不同組織、以何種形式進入血液循環(huán)和組織是其發(fā)揮體內多種藥理作用的先決條件，因此中藥多糖的藥動學研究一直備受關注。但是，由于絕大多數(shù)中藥多糖沒有紫外吸收基團和熒光發(fā)射基團，同時，內源性的糖類物質常對生物樣品中的多糖測定造成干擾，很難直接用紫外檢測器、熒光檢測器和質譜等常見方法對其進行定量檢測。與其他天然活性成分相比，中藥多糖的藥動學研究進展緩慢。近年來，隨著核素標記示蹤法、熒光標記示蹤法、衍生化-質譜法等研究方法的發(fā)展，中藥多糖的藥動學研究取得了一些進展，這為闡明中藥多糖體內作用特點、深入挖掘其體內作用機制奠定了基礎。

1.1 吸收

目前研究發(fā)現(xiàn)中藥多糖的吸收方式主要包括直接吸收和腸道菌群代謝后吸收2 種方式。直接吸收是指多糖主要以巨胞飲、網(wǎng)格蛋白介導和小窩蛋白介導的內吞作用途徑進入毛細血管和細胞中，從而發(fā)揮作用，直接吸收是多糖口服吸收最常見的方式。鄭子明[2]采用核素標記法和Ussing chamber 技術檢測香菇多糖在不同腸段（十二指腸、空腸、回腸和結腸）中的腸吸收行為，發(fā)現(xiàn)香菇多糖在不同腸段的累積轉運量均呈現(xiàn)出時間依賴性，且在回腸的累積轉運量、表觀滲透系數(shù)與吸收容易程度均遠高于其他腸段，表明回腸是香菇多糖吸收的優(yōu)勢腸段，這可能與回腸高表達膽汁酸轉運體有關；香菇多糖在腸道吸收的機制主要是通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞和巨胞飲途徑進入細胞。Yu等[3]采用熒光標記法測定南瓜多糖在小鼠體內的吸收特性，發(fā)現(xiàn)小鼠灌胃給予南瓜多糖后，空腸和回腸被吸收入血，并且在腸道中的相對分子質量幾乎恒定，為195～210 kDa，表明南瓜多糖并未在小腸中分解，是以直接吸收的形式進入機體發(fā)揮作用。此外，一些中藥多糖可耐受唾液、胃和小腸中的消化酶，而不被消化分解，以原形形式到達大腸，被腸道菌群轉化為代謝物，進入血液而發(fā)揮藥理作用[4-5]。茯磚茶多糖可被大腸的腸道菌群分解為短鏈脂肪酸進而被機體利用[6]。蘆薈多糖不被消化酶降解，但在腸道菌群的作用下可產生短鏈脂肪酸，進一步調節(jié)腸道免疫力[7]。

有研究者提出多糖可能通過派爾集合淋巴結吸收的假設[8]，然而，目前尚無中藥多糖從派爾集合淋巴結被吸收進入體循環(huán)的報道。

1.2 分布

目前發(fā)現(xiàn)吸收后的中藥多糖主要分布在肝臟，此外，尚有腎臟、胰腺和脾臟分布的報道[3]。Yu等[3]采用熒光標記法測定南瓜多糖在小鼠體內的組織分布，結果發(fā)現(xiàn)小鼠灌胃給藥60～360 min 后南瓜多糖主要在空腸和回腸以原形被吸收，然后進入肝臟和腎臟，最后進入胰腺和脾臟。Zhang 等[9]采用熒光標記與單光子發(fā)射計算機斷層成像技術相結合的方法測定當歸多糖（ASP）靜脈注射后在大鼠體內的組織分布，發(fā)現(xiàn)ASP 主要聚集于肝臟，這種大量蓄積主要是ASP 通過去唾液酸糖蛋白受體被肝實質細胞內吞產生的。

1.3 代謝與排泄

中藥多糖進入機體后，可在內源性酶或微生物的作用下產生一定程度的降解，但消除速率大多較慢，在體內保持活性的時間較長。鄭子明[2]采用核素標記法研究香菇多糖的代謝與排泄，發(fā)現(xiàn)香菇多糖靜脈注射后在血液中會有部分降解，但大部分以原形形式被肝臟攝取，在肝臟中主要被細胞色素P450（CYP）亞族（CYP2D、CYP2C）和環(huán)氧化物水解酶緩慢代謝降解；滯留于血液中的香菇多糖可隨循環(huán)系統(tǒng)分布于腎臟并被部分降解，進一步進入膀胱后，在尿液中也可被降解，最終排出體外。由于血液、肝臟、腎臟和尿液對香菇多糖的降解均不完全，所以香菇多糖最后隨尿液排出時，仍有部分原形形式存在。但是，大鼠灌胃給藥后部分香菇多糖可隨尿液排泄，其余香菇多糖隨糞便排出。除了肝藥酶對中藥多糖的代謝，腸道菌群可將進入體內的中藥多糖降解為低聚糖或單糖，或進一步代謝生成短鏈脂肪酸。體內外實驗證明，褐藻多糖可被腸道菌群分解，產生短鏈脂肪酸，如乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽等[10]。

通過對中藥多糖藥動學研究發(fā)現(xiàn)，大部分中藥活性多糖進入人體后以原形的形態(tài)進入血液，通過循環(huán)系統(tǒng)分布到組織，甚至進入細胞，通過多糖作用靶點發(fā)揮藥理活性。此外，還有一部分中藥多糖無法被機體直接吸收，需要通過被腸道菌群代謝進而產生藥理作用。

2 中藥多糖的體內藥物作用靶點

中藥多糖被證實具有抗氧化、免疫調節(jié)、抗腫瘤、降血糖、調血脂、抗炎、抗疲勞、抗衰老等多種藥理活性，已成為中藥重要的一類活性成分。近年來，隨著肝素核心糖鏈的解析、巨噬細胞表面糖特異性識別受體的發(fā)現(xiàn)，多糖結構和功能研究發(fā)展迅速。越來越多的證據(jù)表明，生物體內存在多樣的碳水化合物結合組件，其中部分已證實是中藥多糖的直接作用靶點，在免疫、腫瘤、發(fā)育等多方面產生重要的調控作用。

2.1 血管內皮生長因子（VEGF）

VEGF家族屬血小板源生長因子超家族，包括A、B、C、D、E（病毒編碼）、F（蛇毒中分離）、胎盤生長因子（PLGF）和內分泌腺源性-VEGF[11-12]；由于VEGF-A 具有促進血管通透性增加，細胞外基質變性，血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用，在調節(jié)血管生成中起主導作用，故又稱VEGF。VEGF 能與其VEGF 受體1（VEGFR1）和VEGFR2結合，對VEGFR1 親和力較低，因此VEGFR2 是VEGF的主要受體，VEGF激活可促進血管內皮細胞有絲分裂和通透性增加[13]。

癌細胞需要氧氣和營養(yǎng)物質才能存活和增殖，因此癌細胞的生長轉移依賴于腫瘤血管生成。越來越多的證據(jù)表明，含硫酸基的中藥多糖可直接與VEGF 結合，通過阻斷其作用顯著抑制腫瘤新生血管的形成，從而抑制腫瘤的生長。采用表面等離子體共振法（SPR）測定蛋白與配體的親和力時發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛中提取的1 種甘露葡聚糖硫酸酯化后，與VEGF 有著較強的親和力，其平衡解離常數(shù)（KD）值為4.82×10-9mol·L-1。該中藥多糖與VEGF 結合后，抑制細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）磷酸化，進而抑制VEGF 及其轉錄因子激活蛋白-1（AP-1）的表達和轉錄，從而抑制血管生成[14]。

2.2 半乳糖凝集素家族（Gals）

Gals 被發(fā)現(xiàn)是重建微環(huán)境的細胞-細胞相互作用的主要調節(jié)因子，其與多種人類代謝相關疾病相關，包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移，尤其與腫瘤血管新生關系密切[15-17]。Gals蛋白主要存在于細胞質和細胞核中，迄今為止已知的哺乳動物Gals 有15 種，其中11 種來源于人類。其大多數(shù)生物學功能尚未被詳細破譯，僅有Gal-1 和Gal-3 對腫瘤的調控機制被較為系統(tǒng)地闡明[18]。免疫激活被認為是機體對抗癌癥的重要防御策略之一。Gal-1 可以通過誘導活化的T 細胞凋亡，激活宿主免疫反應，發(fā)揮腫瘤免疫抑制作用[19]，還可以通過誘導VEGF信號通路刺激腫瘤血管生成[20]。細胞質中的Gal-3 具有不同的促進腫瘤進展機制，如激活胰腺癌中的大鼠肉瘤蛋白Ras 信號通路，上調黑色素瘤和胃癌中的基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）及調節(jié)肺癌和膠質母細胞瘤中的ERK/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等促進腫瘤生長[21]。

目前，已有研究表明，中藥多糖可通過直接結合Gal-1 和Gal-3 產生藥理活性。采用微量熱泳動（MST）技術測定從中藥蠐螬中分離得到的均一性多糖HDPS-2Ⅱ和Gal-1 的親和力，發(fā)現(xiàn)HDPS-2Ⅱ和Gal-1 的KD值為（17.2±7.3）μmol·L-1。結果表明，HDPS-2Ⅱ可直接結合Gal-1，影響VEGFR2 信號通路的激活，進而抑制腫瘤微血管的生成[22-23]。ASP組分APS-2Ⅰ與Gal-3 有著較強的親和力，采用MST法測定其KD值為（9.35±0.30）μmol·L-1；APS-2Ⅰ直接與Gal-3 結合，激活Caspase-9 和Caspase-3 從而誘導白血病細胞凋亡，延長白血病模型小鼠的存活時間[24]。Yao 等[25]使用SPR 探索發(fā)現(xiàn)，紅花多糖能與Gal-3特異性結合（KD=4.158×10-6μmol·L-1），進而阻斷Gal-3 與表皮生長因子受體（EGFR）之間的相互作用，抑制胰腺癌細胞增長。

2.3 Toll樣受體（TLRs）

TLRs 是參與非特異性免疫的一類模式識別受體，也是目前發(fā)現(xiàn)的與中藥多糖關系最為密切的一類多糖受體。TLRs 能通過激活信號轉導途徑調控在宿主防御中起作用的多種基因，包括主要組織相容性復合體、炎性細胞因子、趨化因子及共刺激分子等[26]。目前在人體內已經發(fā)現(xiàn)的TLRs家族成員有11 個，多種中藥多糖可通過TLR4或TLR2激活核轉錄因子（NF）-κB 或MAPK 信號通路等誘導巨噬細胞、腫瘤細胞等釋放細胞因子，發(fā)揮抗腫瘤、免疫調節(jié)等作用[27-29]。例如，枸杞多糖可激活細胞表面的TLR2，促進NF-κB 和p38 的活化，進而促進骨髓來源樹突狀細胞的成熟，加入TLR2阻斷劑后，NF-κB和p38的表達顯著降低[30]。黃芪多糖通過調控TLR4-MyD88 依賴途徑，活化腫瘤壞死因子（TNF）受體相關蛋白6（TRAF-6）、NF-κB 和AP-1，進而增強白細胞介素-6（IL-6）和TNF-α等細胞因子的產生,從而發(fā)揮免疫調節(jié)作用；在TLR4 基因缺陷小鼠中，黃芪多糖不會影響TRAF-6和NF-κB。因此，黃芪多糖可以通過激活TLR4，進而介導TLR4/MyD88信號通路來調節(jié)宿主生物體的免疫力[31]?；⒄榷嗵且脖蛔C實可以通過激活TLR4，調控TLR4-MAPK 和NFκB 信號通路發(fā)揮抗腫瘤活性，而當使用了TLR4 抑制劑后，信號通路的相關細胞因子分泌受到抑制[32]。

2.4 Dectin-1

Dectin-1 是一種跨膜模式識別的C 型凝集素受體，可通過介導免疫識別和響應來保護機體免受病原體侵襲[33-34]。Dectin-1 表達于多種哺乳動物髓細胞的表面，如樹突狀細胞、巨噬細胞和單核細胞。研究發(fā)現(xiàn)，多糖能夠通過和Dectin-1結合，激活雷帕霉素靶蛋白/蛋白激酶B/缺氧誘導因子-1a（mTOR/Akt/HIF-1a）、NF-κB 等信號通路，提高免疫功能，發(fā)揮多種活性[35]。SPR分析結果表明，靈芝多糖可直接和Dectin-1 結合，其分離得到的4 個組分，即F1、F2、F3、F4，與Dectin-1 的KD值分別為1.948×10-4、4.370×10-6、3.993×10-6、6.188×10-7mol·L-1，其中F4 和Dectin-1 的親和力最強。F4 通過與Dectin-1 結合，誘導NF-κB活化，激發(fā)免疫活性[36]。Gao等[37]發(fā)現(xiàn)，白肉靈芝中的多糖DLP-1 在體內和體外均具有顯著的免疫刺激作用；Dectin-1被阻斷后，GLP-1對巨噬細胞的激活作用被顯著抑制，表明GLP-1 通過Dectin-1 激活免疫。香菇多糖可特異性作用于Dectin-1，顯著降低TNF-α和IL-1β的表達，同時升高IL-10 和神經營養(yǎng)因子（BDNF）的表達，進而抑制脂多糖（LPS）誘導的神經炎癥，在加入Dectin-1阻斷劑后，香菇多糖對TNF-α和IL-1β的抑制作用和對IL-10和BDNF的促進作用被抑制；在中樞脫髓鞘疾病模型小鼠中，香菇多糖還可通過調控Dectin-1受體，使小膠質細胞從M1 型轉變?yōu)镸2 型，促進髓鞘再生，改善小鼠運動功能[38]。上述中藥多糖的主要作用靶點總結見表1。

表1 中藥多糖的主要作用靶點

2.5 其他

甘露糖受體作為巨噬細胞和樹突狀細胞表面的糖類識別受體，也可被中藥多糖如靈芝多糖識別，產生重要的免疫調節(jié)作用[64]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，中藥蠐螬中的三螺旋結構α-葡聚糖HDPS-4Ⅱ可特異性結合醛縮酶A（ALDOA），阻斷ALDOA的酶催化等功能，對肝癌細胞的增殖產生顯著的體內、外抑制作用[65]。

3 基于體內作用靶點的中藥多糖構效關系

多糖能與體內的作用靶點結合，發(fā)揮生物活性作用。但由于其結構復雜，目前對多糖構效關系的研究并不完善，研究也主要集中于一級結構與靶點的作用關系，高級結構鮮有涉及。

3.1 中藥多糖一級結構與活性的關系

多糖的一級結構包括相對分子質量、單糖組成、糖苷鍵類型、分支度等。其中相對分子質量、分支度對多糖體內吸收、跨膜轉運有重要的影響，而單糖組成、糖苷鍵類型決定了與靶點的親和力大小[66-70]。

3.1.1 基于Dectin-1 的多糖構效關系 Dectin-1 為跨膜蛋白，相對分子質量為28 kDa，結構中含有短桿區(qū)域，該區(qū)域在配體識別、結合中起重要作用，同時該區(qū)域還包含一個特殊區(qū)域，即碳水化合物識別域（CRD）。Dectin-1 的CRD 由6 個半胱氨酸殘基組成，其中色氨酸（Trp）221 和組氨酸（His）223在Dectin-1 識別β-葡聚糖的過程中起關鍵作用。另外，絡氨酸（Tyr）228 和谷氨酰胺（Gln）230 側鏈之間的疏水結構和氫鍵形成也有助于Dectin-1 與β-葡聚糖的結合[35]。Dectin-1對β-葡聚糖的識別促進了巨噬細胞吞噬作用和保護性免疫反應的發(fā)生。越來越多的證據(jù)表明，多糖聚合程度和β-(1→3)-葡萄糖（Glc）結構是Dectin-1激活先天免疫反應的關鍵結構特征[71]。Palma等[72]發(fā)現(xiàn)，在Dectin-1的配體中，相對分子質量對活性有一定的影響，配體結構中應含有至少10個葡萄糖單位。Qin等[36]在對靈芝多糖與Dectin-1結合作用的系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)，β-(1→3)-Glc 與β-(1→6)-Glc殘基的配比對親和力影響很大，β-(1→3)-Glc的比例越高，親和力越高。

3.1.2 基于Gal-1的多糖構效關系 Gal-1是一種亞基相對分子質量為14.5 kDa 的同源二聚體，由定位于染色體22q12上的單基因LGALS1所編碼[73]。Gal-1是由2 個F1-F5 和S1-S6 的反向平行的β-鏈折疊形成“三明治”結構，結構中二聚體的末端含有CRD，對β-半乳糖苷有特殊的親和力[74-75]。因此已報道的Gal-1抑制劑大多數(shù)是β-半乳糖苷類似物，如N-乙酰乳糖胺（NAc）[76]。已有研究證明，N-聚糖中的聚-2,3-唾液酸化NAc（LacNAc）延伸對Gal-1、Gal-3和Gal-8特異性結合至關重要，而末端半乳糖殘基的聚糖唾液酸化會阻礙其與Gal-1 結合[77]。Tejler 等[78]發(fā)現(xiàn)取代基為二價乳酰甲酯氨基甲酸酯的2-疊氮乙基-β-D-半乳糖氨基-(1→4)-β-D-Glc 可作為Gal-1 的選擇性抑制劑。此外，硫酸取代后的硫鍵可以結合Gal-1中的His52殘基，增加半乳糖鏈對Gal-1的親合力[79]。

3.1.3 基于TLR4 的多糖構效關系 TLR4 以TLR4/MD-2 復合物的形式存在，是一種與CD14 相關的細胞表面受體，其通過激活核易位和促炎反應介導對多種微生物的吞噬和炎癥反應[80]。目前已發(fā)現(xiàn)多種中藥多糖是有效的TLR4 激動劑，相關構效關系的研究初步證實，單糖組成是決定多糖和TLR4 結合并發(fā)揮活性的關鍵因素，其中Glc、半乳糖（Gal）和甘露糖殘基是激活TLR4 的主要殘基[81]；糖苷鍵的連接方式也影響著多糖和TLR4 的結合。據(jù)報道，β-(1→3)-、β-(1→4)-和α-(1→4)連接的葡聚糖骨架的活性與TLR4信號傳導有關，而β-(1→6)-連接的葡聚糖尚未報道與TLR4的活性關系[82-83]；多糖的相對分子質量也影響了活性，目前報道的TLR4活性多糖的相對分子質量為10～1000 kDa。

3.1.4 基于ALDOA 的多糖構效關系 果糖-1,6-二磷酸醛縮酶（ALDO）是糖酵解和糖異生代謝過程中的關鍵酶，能夠催化果糖-1,6-二磷酸（FBP）和果糖-1-磷酸為底物的裂解。其有3 種同工酶亞型，即ALDOA、ALDOB 和ALDOC[84]。其中ALDOA 相較于其他2 種亞型的同工酶而言，結合FBP 的動力學參數(shù)（Km）值最小。ALDOA 蛋白是同源四聚體結構，總相對分子質量為160 kDa，可以通過維持細胞骨架、囊泡運輸和信號轉導等促進腫瘤發(fā)展[85]。HDPS-4Ⅱ是由(1→6)-α-D-Glcp 和(1→4)-α-D-Glcp 的糖殘基以10∶1 連接而成的直鏈α-葡聚糖，研究發(fā)現(xiàn)，HDPS-4Ⅱ、Dextran 及其硫酸酯化衍生物與ALDOA 蛋白具有不同程度的親和作用。Dextran 與ALDOA的親和性與相對分子質量有關，相對分子質量為1000～4000 Da，隨相對分子質量遞增，親和性逐漸增加，抗肝癌活性也逐漸增強[86]；與HDPS-4Ⅱ和系列Dextran比，硫酸化修飾可進一步增強多糖與ALDOA的親和作用。

3.2 多糖高級結構與活性的關系

目前普遍認為，多糖的高級結構與活性關系密切。例如，在破壞原多糖的三螺旋結構之后，腫瘤抑制率下降，因此推測多糖的三螺旋結構與抗腫瘤活性相關[87]。但因多糖的結構十分復雜，高級結構的解析困難，目前多糖高級結構與活性關系尚無系統(tǒng)的報道。

4 結語與展望

中藥多糖活性多樣、不良反應小、應用開發(fā)價值較大，相關研究及關注度日益提升。近年來，隨著糖化學及糖生物學的快速發(fā)展，多糖的結構解析、分子修飾、體內靶點和體內藥動學的研究越來越深入，這極大地推動了中藥藥效物質基礎研究和中醫(yī)藥現(xiàn)代化進程，也為中藥質量控制和評價體系的健全提供了支撐。特別是大量細胞表面和胞內糖類結合分子在多種生命現(xiàn)象及生理過程中重要調控作用的發(fā)現(xiàn)，為科學闡釋中藥多糖的體內分子作用機制奠定了理論基礎。同時，DNA 體外重組、SPR、核磁共振（NMR）和液相色譜串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS）等技術的發(fā)展，實現(xiàn)了對多糖與分子靶點直接結合的測定，使從分子水平揭示中藥多糖的作用機制和構效關系成為可能。目前研究主要針對細胞表面Dectin-1、Gals、TLRs 等糖結合蛋白展開分子水平多糖構效關系的探討；通過這些分子靶點，具有特異型結構的中藥多糖分別呈現(xiàn)了對天然免疫反應、腫瘤發(fā)展和轉移、巨噬細胞炎癥級聯(lián)等的調控作用。這些分子水平中藥多糖構效關系的解讀也為精準識別和分析具有治療作用的中藥多糖活性物質、銜接現(xiàn)代科學提供了突破口。

盡管如此，糖結合蛋白體內功能的產生具有重要的糖鏈結構依賴性。多糖的藥理作用與其結構包括單糖組成、單糖連接位點、糖苷鍵的類型、分支度、相對分子質量、構型、構象等均緊密相關。由于中藥多糖結構的復雜性和多樣性，其結構的解析和化學合成仍是具有挑戰(zhàn)性的非常復雜且耗時的研究工作，是構效關系研究中的限速環(huán)節(jié)。因此，目前多糖研究的水平仍然落后于蛋白質和核酸等其他天然活性物質，分子水平的構效關系研究僅為起步階段。另一方面，多糖結構具有微觀不均一性，導致質量控制難度大、藥效重復性較差，研究結果常遭受質疑。中藥多糖穩(wěn)定的、可重復性的制備工藝，高效、靈敏的質量控制方法等技術問題的解決，仍需要長時間的探索與完善。

期待隨著NMR、LC-MS/MS、基質輔助激光解吸飛行時間質譜法（MALDI-TOF）、氣相色譜-質譜法（GC-MS）等分析技術的改進，多種多糖衍生與熒光標記方法的開發(fā)，能夠為多糖的檢測與結構分析提供有力的技術支持，全面推動中藥多糖分子水平構效關系的闡釋和中藥多糖相關新藥的高效研發(fā)。