譚樂俊，于新蘭，林林，于鳳蕊，牛艷，林永強(qiáng)*，戴忠

1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局膠類產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省中藥標(biāo)準(zhǔn)創(chuàng)新與質(zhì)量評(píng)價(jià)工程實(shí)驗(yàn)室/中藥配方顆粒共性技術(shù)山東省工程研究中心，山東 濟(jì)南 250101；

2.新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830002；

3.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050

鷺鷥咯丸是由麻黃、苦杏仁、石膏、甘草、細(xì)辛、炒紫蘇子、炒芥子、炒牛蒡子、瓜蔞皮、射干、青黛、蛤殼、天花粉、炙梔子和人工牛黃15 味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，具有宣肺、化痰、止咳的功效，用于痰濁阻肺所致的頓咳、咳嗽，癥見咳嗽陣作、痰鳴氣促、咽干聲?。话偃湛纫娚鲜鲎C候者[1]。

鷺鷥咯丸處方中含有辛溫解表藥細(xì)辛，研究表明細(xì)辛中含有痕量的馬兜鈴酸類成分[2-7]。馬兜鈴酸類成分是一系列結(jié)構(gòu)類似的硝基菲類化合物，包括馬兜鈴酸和馬兜鈴內(nèi)酰胺2 種結(jié)構(gòu)類型，天然存在于馬兜鈴屬（Aristolochia）及細(xì)辛屬（Asarum）等馬兜鈴科植物中。自1993 年馬兜鈴酸腎毒性報(bào)道以來，馬兜鈴酸安全性問題一直備受關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外已有大量研究證實(shí)，馬兜鈴酸具有腎毒性、致癌和致突變作用[8-12]。2008 年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將馬兜鈴酸列為Ⅰ類致癌物，并于2012 年將含有馬兜鈴酸的植物列為Ⅰ類致癌物[13-15]。因此，我國(guó)也相繼采取了一系列控制風(fēng)險(xiǎn)的措施，將細(xì)辛藥用部位由全草修改為根和根莖，且《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版對(duì)細(xì)辛中馬兜鈴酸Ⅰ的限度（＜0.001%）做了規(guī)定[1]。

鑒于馬兜鈴酸類成分對(duì)人體的嚴(yán)重危害性，確定鷺鷥咯丸中是否含有毒性成分馬兜鈴酸Ⅰ等馬兜鈴酸類成分，進(jìn)一步加強(qiáng)鷺鷥咯丸的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估至關(guān)重要。本研究建立了基于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法，同時(shí)快速篩查鷺鷥咯丸中是否含有馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲa、馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅶa、馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ 7 個(gè)馬兜鈴酸類成分，并快速準(zhǔn)確測(cè)定馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅳa和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ 3個(gè)成分的含量，為其安全性研究提供參考，也為其他含細(xì)辛中成藥中馬兜鈴酸類成分的檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 材料

1.1 儀器

LCMS-8050型三重四級(jí)桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；CP225D 型十萬分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW100 型高速粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）

1.2 試藥

對(duì)照品馬兜鈴酸Ⅰ（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110746-201912，純度：99.1%）；馬兜鈴酸Ⅱ（批號(hào)：P13J10F90613，純度：99.4%）、馬兜鈴酸Ⅶa（批 號(hào)：Z02S11S123212，純度：99.2%）、馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ（批號(hào)：P27N10S104067，純度：98.4%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；馬兜鈴酸Ⅲa（批號(hào)：ZZS-20-190-A6，純度：99.73%）、馬兜鈴酸Ⅳa（批號(hào)：ZZS-20-602-A6，純度：98.15%）、馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ（批號(hào)：ZZS-20-190-A6，純度：97.0%）均購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；甲醇、甲酸、甲酸銨均為色譜純。

鷺鷥咯丸共15 批，涉及2 家生產(chǎn)企業(yè)（A、B）的15批樣品（編號(hào)分別為A001～A013，B001、B002）。

2 方法與結(jié)果

2.1 超高效液相色譜-質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）分析條件

2.1.1 色譜條件 采用島津Shim-pack Velox C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm），以甲醇（A）-0.1% 甲酸溶液（含5mmol·L-1甲酸銨，B）為流動(dòng)相梯度洗脫（0～5 min，36%～50%A；5～11 min，50%～70%A；11～13 min，70%A）；流速為0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量為2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用質(zhì)譜檢測(cè)器，電噴霧正離子模式（ESI+），進(jìn)行MRM；接口溫度：300 ℃；脫溶劑溫度：520 ℃；加熱氣流量：10 L·min-1。7 個(gè)馬兜鈴酸類成分的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 鷺鷥咯丸中7個(gè)馬兜鈴酸類成分的監(jiān)測(cè)離子對(duì)及碰撞電壓

2.2 溶液的制備

2.2.1 7 個(gè)成分混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲa、馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅶa、馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ?qū)φ掌愤m量，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度為20 ng·mL-1的混合溶液，即得。

2.2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取對(duì)照品馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ9.33、19.90、18.24 mg，分別置100、500、250 mL 量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到相應(yīng)的對(duì)照品儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度分別為91.58、39.44、71.79 μg·mL-1。

2.2.3 3 個(gè)成分混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密量取馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ對(duì)照品儲(chǔ)備液20、5、10 μL，置10 mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備 取本品15 g，加硅藻土7.5 g，研細(xì)，混勻，取6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.5 陰性樣品溶液的制備 取處方中除去細(xì)辛的其他藥味，按處方比例制成缺細(xì)辛陰性樣品，按2.2.4項(xiàng)下方法制得缺細(xì)辛陰性樣品溶液。

2.3 馬兜鈴酸類成分的篩查

分別精密吸取7 個(gè)成分混合對(duì)照品溶液與15 批供試品溶液各2 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，按2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果收集到的15 批鷺鷥咯丸中未檢出馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲa、馬兜鈴酸Ⅶa 和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ，檢出馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅳa和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ（圖1）。

圖1 混合對(duì)照品和鷺鷥咯丸MRM色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 分別精密吸取2.2 項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各2 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的位置上，有相應(yīng)色譜峰，而陰性樣品色譜中無相應(yīng)色譜峰。說明處方中其他藥味對(duì)測(cè)定結(jié)果無干擾（圖2）。

圖2 鷺鷥咯丸專屬性MRM色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取2.2 項(xiàng)下的馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ對(duì)照品儲(chǔ)備液20、10、20 μL，置10 mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得到對(duì)照品濃溶液；分別精密量取對(duì)照品濃溶液10、20、50、100、200、500、1000 μL，置1 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得到3 個(gè)成分的系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液各2 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測(cè)定峰面積積分值。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為馬兜鈴酸Ⅳa：Y=14 022X+6771（r=1.000 0），進(jìn)樣量為1.83～183.15 pg 時(shí)與峰面積線性關(guān)系良好；馬兜鈴酸Ⅰ：Y=28 875X-2158（r=0.999 9），進(jìn)樣量為0.39～39.44 pg時(shí)與峰面積線性關(guān)系良好；馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ：Y=2882X-803（r=0.999 9），進(jìn)樣量為1.44～143.59 pg時(shí)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.3 檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）當(dāng)馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ質(zhì)量濃度分別為0.18、0.20、0.72 ng·mL-1時(shí)，3 個(gè)成分的信噪比（S/N）約為3，計(jì)算出3 個(gè)成分的LOD 分別為1、1、4 ng·g-1。

當(dāng)馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ質(zhì)量濃度分別為0.46、0.39、2.86 ng·mL-1時(shí)，3個(gè)成分的S/N 約為10，計(jì)算出3 個(gè)成分的LOQ 分別為3、2、18 ng·g-1。

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)考察 分別精密量取2.2 項(xiàng)下馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ對(duì)照品儲(chǔ)備液20、5、10 μL，置10 mL 量瓶中，加陰性樣品溶液稀釋至刻度，搖勻，即得到陰性加標(biāo)溶液。

分別精密吸取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和以上陰性加標(biāo)溶液各2 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，按2.1項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定。綜合3個(gè)待測(cè)成分的檢測(cè)結(jié)果，溶劑加標(biāo)響應(yīng)與基質(zhì)加標(biāo)響應(yīng)的比值（基質(zhì)效應(yīng)）均為90%～110%，表明基質(zhì)基本無影響，可以采用溶劑配制對(duì)照品溶液用于檢測(cè)。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2 項(xiàng)下的馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ混合對(duì)照品溶液2 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)其峰面積積分值，馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ峰面積的RSD 分別為1.02%、1.67%、1.66%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按照2.2.4項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取2 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測(cè)定。馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ含量的RSD分別為0.68%、0.01%、1.04%。表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)知馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ含量的鷺鷥咯丸樣品（A012）15 g，加硅藻土7.5 g，研細(xì)，混勻，取3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入等量的馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ對(duì)照品溶液，按2.2.4項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取2 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測(cè)定。結(jié)果馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的平均回收率分別為99.4%（RSD 為1.27%）、96.1%（RSD為1.63%）、96.4%（RSD為2.98%），表明該測(cè)定方法的準(zhǔn)確性良好（表2）。

表2 馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.4.6 項(xiàng)下同一份供試品溶液，分別于0、5、10、15、20、25 h 測(cè)定3 個(gè)成分的峰面積積分值，結(jié)果馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ峰面積的RSD 分別為1.46%、2.43%、2.23%，表明供試品溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品測(cè)定

15 批鷺鷥咯丸樣品分別按2.2.4 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果A 廠家樣品均檢出馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ，B 廠家樣品未檢出馬兜鈴酸Ⅰ。馬兜鈴酸Ⅳa 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.17～0.26 μg·g-1（A001～A013、B001、B002）、馬兜鈴酸Ⅰ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～0.01 μg·g-1（A001～A013）、馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04～0.13 μg·g-1（A001～A013、B001、B002），見表3。

表3 鷺鷥咯丸中3個(gè)馬兜鈴酸類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果（n=15）μg·g-1

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇

鷺鷥咯丸由15 味中藥粉末加煉蜜制成，成分復(fù)雜多樣，另細(xì)辛中馬兜鈴酸類成分的含量較低[3,6]，且細(xì)辛處方量?jī)H占比1.1%，進(jìn)而選擇靈敏度高、專屬性強(qiáng)、基于MRM 模式的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)與分析。

3.2 分析條件的優(yōu)化

篩選的7 個(gè)馬兜鈴酸類成分中馬兜鈴酸Ⅶa 與馬兜鈴酸Ⅳa為同分異構(gòu)體，兩者色譜保留行為基本一致，質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化后定量離子相近，為實(shí)現(xiàn)兩者的準(zhǔn)確測(cè)定，先后分別以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1甲酸銨）為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相組成對(duì)組分的峰形、分離度和靈敏度均有影響。以甲醇-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1甲酸銨）為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)待測(cè)組分可避免相互干擾，峰形和靈敏度更好，故選擇該色譜條件。

3.3 制備方法考察

為保證馬兜鈴酸類成分能被提取完全，以檢出的馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ3 個(gè)馬兜鈴酸類成分為指標(biāo)，對(duì)供試品溶液的制備方法進(jìn)行考察，包括樣品的均勻化程度（樣品與硅藻土比例1∶0、1∶0.5、1∶1）、不同提取溶劑（甲醇、70%甲醇、50%甲醇）、不同提取方式和時(shí)間（超聲15、30、60 min，回流30、60 min）。結(jié)果采用樣品與硅藻土比例1∶0.5，研細(xì)，加入70%甲醇超聲處理30 min的方法能簡(jiǎn)便且快速的將鷺鷥咯丸中馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ3 個(gè)馬兜鈴酸類成分提取完全。

3.4 色譜柱耐用性的考察

本研究在相同的色譜條件下，考察了Thermo Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）Shim-pack Velox C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）和Shiseido CAPCELL CORE C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）3 個(gè)不同品牌色譜柱，結(jié)果表明，不同品牌色譜柱對(duì)馬兜鈴酸Ⅳa、馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ3個(gè)成分的檢測(cè)基本無影響，適用范圍廣。

3.5 樣品結(jié)果分析

通過初步篩查和表3結(jié)果可知，15批樣品均未檢出馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅲa、馬兜鈴酸Ⅶa和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ，檢出馬兜鈴酸Ⅰ（0～0.01 μg·g-1）、馬兜鈴酸Ⅳa（0.17～0.26 μg·g-1）和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ（0.04～0.13 μg·g-1）。在已發(fā)現(xiàn)的馬兜鈴酸類成分中，因取代基不同使其作用靶標(biāo)不同，從而毒性差異較大，較明確有腎毒性和潛在致癌性的主要為馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ，馬兜鈴酸Ⅳa和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ均未表現(xiàn)明顯毒性[15-16]。按《中國(guó)藥典》2020 年版（一部）細(xì)辛藥材中含馬兜鈴酸Ⅰ的含量限度（0.001%）計(jì)算，鷺鷥咯丸中折合馬兜鈴酸Ⅰ限度為0.055 μg·g-1，全部樣品均在安全范圍內(nèi)。由于細(xì)辛中馬兜鈴酸Ⅳa和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的安全風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)不明確，對(duì)其安全性認(rèn)識(shí)局限，無限量標(biāo)準(zhǔn)[16]，故暫不制定鷺鷥咯丸中馬兜鈴酸Ⅳa和馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的限度，后續(xù)會(huì)對(duì)鷺鷥咯丸中這2 個(gè)指標(biāo)成分的安全性做進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

本研究采用基于MRM 的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)鷺鷥咯丸中痕量馬兜鈴酸類成分進(jìn)行了篩查與分析，建立的方法準(zhǔn)確、靈敏、可靠，可為鷺鷥咯丸的安全性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也可為本品及其他含細(xì)辛中成藥品種的相關(guān)研究提供參考。