賴華梅,王 俊,楊玉健

肝衰竭是嚴重肝臟損害導致其合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能障礙,出現(xiàn)以黃疸、肝性腦病和凝血功能障礙等為特征的臨床癥候群[1],其病死率高達60%～80%。臨床上,往往出現(xiàn)全身各種并發(fā)癥,如感染、消化道出血和肝性腦病等,嚴重威脅患者生命安全[2]。因此,早診斷和治療至關重要。端粒酶是一種RNA依賴性DNA聚合酶,能合成端粒末端重復序列,在維持細胞增殖過程中發(fā)揮重要的作用。端粒酶包含功能性人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)和人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶( human telomerase reverse transcriptase,hTERT)催化亞單位,后者是端粒酶發(fā)揮作用的活性成分。細胞hTERT mRNA水平與端粒酶活性密切相關[3]。有報道顯示,肝衰竭患者血清血管生成素和細胞黏附分子水平有顯著變化[4,5],細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)作為免疫球蛋白超家族的一員,通過介導細胞與細胞外基質(zhì)之間的粘附和信息傳遞,在肝損傷的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[6]。血管生成素-2(angiogenin-2,Ang-2)可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的生理功能,有利于血管生成[7]。本研究檢測了肝衰竭患者外周血單個核細胞(PBMCs)hTERT mRNA水平及血清Ang-2和ICAM-1水平變化,以期為臨床判斷病情提供參考,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 病例來源 2019年1月～2021年5月我院診治的肝衰竭患者74例,男性45例,女性29例;年齡為30～75歲,平均年齡為52.7±6.3歲。診斷符合《肝衰竭診治指南》[8]的標準,其中亞急性肝衰竭(subacute liver failure, SALF)13例,慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)39例和慢性肝衰竭(chronic liver failure, CLF)22例;乙型肝炎37例,丙型肝炎12例,酒精性肝硬化17例,藥物性肝損傷8例;早期23例,中期35例,晚期16例。排除標準:(1)存在血液系統(tǒng)疾病;(2)合并惡性腫瘤;(3)伴有精神疾病。另選擇同期于我院體檢的健康人30例作為對照組,男性20例,女性10例;年齡為30～75歲,平均年齡為51.8±6.5歲。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審核、通過。

1.2 治療方法 給予血制品、利尿和抗生素治療。給予異甘草酸鎂(正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司,國藥準字H20051942)150 mg加入5%葡萄糖溶液250 ml中靜脈滴注,1次/d,給予腺苷蛋氨酸(重慶藥友制藥有限公司,國藥準字H20050667)1000 mg加入5%葡萄糖溶液250 ml中靜脈滴注,1次/d。持續(xù)治療4～8 w。

1.3 外周血單個核細胞(PBMCs) hTERT mRNA檢測 于清晨空腹采集靜脈血3 mL,肝素抗凝,4℃ 2000 r/m離心15 min,-80℃保存待測。提取細胞RNA,將沉淀的 RNA干燥,溶解RNA,測定260～280吸光值,計算 RNA含量,并用其合成cDNA;引物構建:端粒酶hTERT引物從 LternetGenBank中調(diào)出hTERT mRNA全基因系列,應用軟件設計引物,上游引物為5′-TATGcC GTG GTC CAG AAGG-3′,下游引物為5′-GCG TGGCTG AGG TGA GGTCT-3′。擴增長度為328 bp,內(nèi)參照上游引物為5′-GAT TGC CTC AGG ACATTT CTG-3′,下游引物為5′-GCG TGG GTG AG TGAGGT CT-3′。擴增片段長度為690 bp;cDNA合成:使用RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,每個反應體系中加入總 RNA 1 μL,加入2 ×buffer 5 μL,MgSO42 μL,dNTPs 0.5μL,逆轉(zhuǎn)酶(AMV)0.5μL,oligod-T150.5μL,RNase-inhibitor 0.25 μL,dd.H2O 0.25μL。將上述反應物放入PCR儀65℃ 1 min,30℃ 5 min,30℃～65℃ 15～30 min勻速升溫,65℃ 30 min,98℃ 5 min,5℃ 5 min,將合成好的cDNA存于-20℃?zhèn)溆?內(nèi)參照定量PCR:在PCR反應體積中吸取cDNA 1μL,加入dd.H2O 9.5μL,10 × buffer 1. 25μL,dNTP 1μL, Taq酶0.1μL,hTERT-R 0.1μL,hTERT-f 0.1μL。放入PCR儀內(nèi)擴增,反應條件為93℃預變性3 min,94℃ 45 s,57.6℃ 1 min,72℃ 1 min,共35個循環(huán);PCR產(chǎn)物鑒定:取10 ×buffer 1 h,將TERT mRNA 的PCR產(chǎn)物在20 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳,在紫外凝膠掃描儀觀察拍照,并存入1D Kadak成像分析系統(tǒng),計算出端粒酶hTERT mRNA水平。

1.4 血清Ang-2和ICAM-1水平及血生化指標檢測 采用ELISA法檢測血清Ang-2和ICAM-1水平(上海哈靈生物科技有限公司);使用全自動生化儀檢測血生化指標和血氨水平(深圳市希萊恒醫(yī)用電子有限公司)。

2 結果

2.1 兩組PBMCshTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平比較 肝衰竭組PBMCs hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平顯著高于健康人組(P<0.05,表1)。

表1 兩組PBMC hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平比較

2.2 不同類型肝衰竭患者PBMC hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平比較 SALF組PBMCs hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平顯著高于ACLF組或CLF組,而ACLF組PBMCs hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平顯著高于CLF組(P<0.05,表2)。

表2 不同類型肝衰竭患者PBMC hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平比較

2.3 不同類型肝衰竭患者肝功能指標變化情況 經(jīng)過1～3 m治療,SALF組死亡3例,ACLF組死亡5例,CLF組死亡4例;各組肝功能指標變化見表3。

表3 不同類型肝衰竭患者肝功能指標比較

3 討論

肝臟具有合成、解毒、代謝、排泄和生物轉(zhuǎn)化等重要功能,對人體的健康運行至關重要。但由于酒精、藥物、病毒感染等因素導致肝臟損傷,進而導致肝臟多發(fā)性功能障礙或失代償。肝功能衰竭的發(fā)展是危險和迅速的,且伴隨高并發(fā)癥和高病死率。因此,早診斷并進行針對性的干預措施具有非常重要的臨床意義[9,10]。

激活的端粒酶可以以端粒的3末端為引物,合成端粒末端的重復序列,維持端粒的長度,使細胞獲得增殖能力。人類端粒酶由功能性RNA成分(hTR)和 hTERT組成[11]。hTERT是一個單拷貝基因,將hTERT基因轉(zhuǎn)染端粒酶陰性的正常細胞可激活端粒酶活性,且在胚胎發(fā)育早期體細胞具有端粒酶活性[12,13]。報道顯示,外周血hTERT mRNA可反映肝細胞增生狀態(tài)[14]。Ang-2作為一種強大的促炎癥因子,近年來受到越來越多的關注,它能破壞內(nèi)皮細胞的完整性,參與血管的形成和重建,增加血管的通透性[15],被認為是內(nèi)皮功能障礙的標志之一。Ang-2通過激活NAPDH氧化酶刺激氧化應激,加重急性炎癥反應。另一方面,Ang-2還可通過激活內(nèi)源和外源物質(zhì)誘導多種組織和細胞凋亡,并具有促炎癥、促氧化應激和凋亡等重要的功能。ICAM-1是免疫球蛋白超家族成員,可引起白細胞粘附,增加血管阻力,損傷組織細胞,引起肝微循環(huán)障礙,進而影響肝細胞的營養(yǎng)和供氧,損害肝功能,引起休克和急性肝衰竭[16]。本研究結果顯示,肝衰竭患者外周血單個核細胞hTERT mRNA水平及血清Ang-2和ICAM-1水平顯著高于健康人,提示外周血單個核細胞hTERT mRNA水平及血清Ang-2和ICAM-1水平參與了肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程。同時本研究發(fā)現(xiàn),SALF患者PBMCs hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平顯著高于ACLF患者或CLF患者,ACLF患者PBMCs hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平顯著高于CLF患者,提示在不同類型肝衰竭患者它們的變化可能不同。外周血單個核細胞hTERT mRNA水平及血清Ang-2和ICAM-1水平越高,肝衰竭病情可能更重。

根據(jù)肝衰竭的病理組織學特征和病情發(fā)展速度不同,《肝衰竭診治指南》將其分為急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)、SALF、ACLF和CLF。在我國,SALF、ACLF和CLF較為常見,而在診斷肝衰竭的指標中,TBIL、INR、ALB、血氨等實驗室指標為常規(guī)檢查項目,能夠反映病情的嚴重程度和肝損傷程度,與肝衰竭患者預后相關。本研究三組肝衰竭患者診斷明確,都達到了診斷標準。經(jīng)過綜合治療,大部分患者獲得治愈或病情控制,少部分患者死亡。肝衰竭時肝細胞被破壞,肝功能受到損傷,從而導致代謝障礙,故TBIL、INR、ALB、血氨水平升高。CLF是在肝硬化基礎上發(fā)生的肝功能進行性減退,肝纖維化嚴重,肝細胞功能喪失,肝臟合成白蛋白能力下降,故血清ALB水平較低[17]。經(jīng)過治療,三組大部分患者TBIL、INR、血氨水平均降低,ALB水平升高,說明綜合治療有效。異甘草酸鎂是甘草酸的手性異構體,可減輕炎癥反應,改善肝功能,并可穩(wěn)定肝細胞膜,而腺苷蛋氨酸可通過誘導肝細胞有絲分裂,促進肝細胞再生,并可抑制細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化,保護線粒體,從而保護肝細胞,兩種藥物聯(lián)合具有協(xié)同作用,可改善肝功能[18]。

綜上所述,肝衰竭患者外周血單個核細胞hTERT mRNA水平及血清Ang-2和ICAM-1水平顯著升高,臨床可結合以上指標的變化早期對肝衰竭患者病情進行判斷,為臨床治療提供參考依據(jù)。本研究屬于單中心觀察,例數(shù)尚少,病因分散,病情分期不一,可能對研究結果造成一定的偏倚,這些都需要擴大樣本量進一步論證。