仲金龍,施 琳

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌類型,在癌癥導(dǎo)致的死亡原因中排名第三位[1,2]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性、短的非編碼RNA分子,具有重要的基因調(diào)節(jié)因子的功能[3,4]。研究證據(jù)表明,miRNA的生物學(xué)功能與許多人類疾病有關(guān),包括癌癥[5]。通常,人類癌癥miRNA位于基因組斷點區(qū)域,在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮腫瘤抑制基因或腫瘤促進(jìn)基因的作用[6]。最近的研究表明,miRNA表達(dá)在多種癌癥中都有發(fā)現(xiàn),包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌和HCC等[7-9]。最近研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的靜脈轉(zhuǎn)移與多種miRNA相關(guān),miR-556-3p就是其中之一[10,11]。同時,與過表達(dá)miR-556-3p組相比,miR-556-3p低表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)和患者較低的生存率密切相關(guān)。體外研究表明miR-556-3p能夠降低肝癌細(xì)胞生長[12,13]。因此,本研究通過探索miR-556-3p與HCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,以期為HCC的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 肝癌組織、細(xì)胞和試劑 2020年3月～2022年2月我院診治的HCC患者86例,獲得所有患者書面知情同意書后,經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)開展研究。手術(shù)期間收集部分切除的HCC組織和癌旁肝組織,立即置于冷凍并保存在液氮中。肝癌細(xì)胞系HepG2 和正常肝細(xì)胞系LO2購自中國科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco,Maryland,USA);Lipofectamine 2000 (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA);miR-556-3p mimic、miRNA NC、磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)siRNA和PTEN cDNA(美國Invitrogen公司);TRIzol試劑(美國Invitrogen公司);抗PTEN、抗β-actin、抗磷酸化蛋白激酶B (protein kinase B,p-Akt)和抗AKT抗體(美國Abeam公司);CCK-8溶液(北京索萊寶);免疫組化試劑盒(杭州聯(lián)科生物)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基、37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞,接種6孔板,每孔1×106,孵育24 h。使用Lipofectamine 2000 ,根據(jù)試劑說明書轉(zhuǎn)染100 nM PTEN siRNA、miR-556-3p mimic或miRNA NC。當(dāng)PTEN cDNA質(zhì)粒和miR-556-3p模擬物共同轉(zhuǎn)染時,首先將miR-556-3p mimic (100 nM)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48 h后,用PTEN cDNA質(zhì)粒(2 μg)和miR-556-3p mimic(100 nM)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h。

1.3 細(xì)胞RNA提取和miR-556-3p檢測 使用TRIzol試劑按照說明書提取總RNA。采用實時熒光定量PCR法檢測mRNA相對水平。miR-556-3p引物為:5-CGGTATTGCACATTACTAAGTTGCA-3(sense),5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3(antisense);snRNA U6基因作為對照,引物為:5-ACCAGTGGCACTGTTGTTCACC-3(sense),5-TTCCTCTGGTCCTGGTATGAAG-3(antisense)。在美國Bio-Rad iQ5 Real-time PCR儀上使用Real-time PCR Mixture Reagent (BIO-RAD)進(jìn)行PCR檢測。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對水平。

1.4 細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測 采用Western Blotting法,收集細(xì)胞,并用PBS重懸,經(jīng)2000 r/m離心5 min,在RIPA冷裂解液中裂解30 min。再12000 r/m離心10 min,收集上清液,用等量分光光度法測定蛋白濃度,經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠分離,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%脫脂牛奶/TBST在室溫下封閉1 h。加入抗PTEN、抗β-actin、抗p-AKT和抗AKT一抗在4℃下孵育過夜。加入合適的酶標(biāo)二抗室溫孵育1 h。加入HRP底物ECL,在凝膠系統(tǒng)成像。

1.5 細(xì)胞存活實驗分析 使用細(xì)胞計數(shù)試劑盒CCK-8檢測細(xì)胞存活情況。取細(xì)胞(1×105)在96孔微孔板中培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL,孵育1 h,在450 nm處測定吸光度。

1.6 細(xì)胞侵襲實驗 使用Matrigel膠包被Transwell小室后,調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×104個/ml。取細(xì)胞懸液0.5 mL,加入Transwell小室內(nèi),在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室,將上室細(xì)胞擦凈,并用PBS洗滌,使用預(yù)冷的甲醇固定下室細(xì)胞30 min,采用結(jié)晶紫染色10 min,顯微鏡下取6個視野計算下室細(xì)胞數(shù)。

1.7 細(xì)胞凋亡分析 用miR-556-3p mimic、miR-556-3p NC、PTEN cDNA和PTEN siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48 h,用Alexa Fluor 488 annexin V/Dead Cell apoptosis Kit按照說明書進(jìn)行凋亡檢測。細(xì)胞懸液(100 μl)與annexin V 5 μl和PI 1 μl在室溫下孵育15 min。使用BD LSR II流式細(xì)胞儀對染色細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.8 熒光素酶活性分析 通過Target scan工具網(wǎng)站得到miR-556-3p和PTEN的結(jié)合位點。將PTEN的3’-UTR片段插入熒光素酶終止密碼子下游的pGL3載體。使用快速定點誘變試劑盒生成突變型(mut-) PTEN。用螢火蟲熒光素酶的報告載體0.4 μg和海腎熒光素酶pRLTK對照載體0.08 μg,以及添加或不添加miR-556-3p mimic 0.5 μg,共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用雙熒光素酶法連續(xù)測定螢火蟲和海腎熒光素酶活性。

1.9 組織PTEN表達(dá)檢測 采用免疫組化法檢測,取癌組織和癌旁肝組織石蠟切片,脫蠟。使用檸檬酸鈉溶液修復(fù)抗原。用3%H2O2除去內(nèi)源性過氧化物酶,用山羊血清封閉非特異性位點。加入抗PTEN單克隆抗體在4℃孵育過夜。次日,用PBS沖洗3次,用生物素標(biāo)記的第二抗體孵育15 min,再加入DAB染色30 s。然后,用蘇木精復(fù)染1 min,乙醇梯度脫水、干燥后,用中性樹脂密封。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞和組織miR-556-3p和PTEN水平變化 與LO2細(xì)胞比,HepG2 miR-556-3p水平顯著降低(圖1A);另外,經(jīng)qRT-PCR和免疫組化檢測結(jié)果顯示,與癌旁組織比,miR-556-3p在HCC組織中表達(dá)下調(diào),PTEN在HCC組織中表達(dá)上調(diào)(圖1B、圖1C)。這些結(jié)果提示miR-556-3p與PTEN可能在HCC發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。

2.2 不同方式轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞熒光素酶活性比較 應(yīng)用TargetScan分析miR-556-3p的靶向基因,PTEN mRNA序列的3’-UTR包含兩個推測的miR-556-3p結(jié)合位點 (圖2A)。將miR-556-3p可能的結(jié)合位點分別克隆到pGL3載體中,驗證miR-556-3p在HepG2細(xì)胞靶向作用PTEN。與陰性對照比,miR-556-3p mimic和pGL3-wt 3’-UTR載體共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(圖2B)。

圖2 PTEN是miR-556-3p的直接作用靶點

2.3 過表達(dá)miR-556-3p和抑制PTEN對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的作用情況 侵襲實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與miR NC組比,過表達(dá)miR-556-3p可顯著抑制HepG2細(xì)胞的侵襲能力(圖3A/B);在48 h、72 h和96 h,與miR NC組比,過表達(dá)miR-556-3p顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖(圖3C);流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),與miR NC組比,HepG2細(xì)胞過表達(dá)miR-556-3p顯著增加了細(xì)胞凋亡(圖3D)。

2.4 miR-556-3p通過靶向調(diào)控PTEN抑制AKT信號激活 蛋白免疫印跡檢測顯示,過表達(dá)miR-556-3p抑制AKT磷酸化和PTEN表達(dá),這些效應(yīng)被PTEN過表達(dá)所逆轉(zhuǎn)(圖4)。結(jié)果表明,miR-556-3p通過靶向作用PTEN,抑制AKT的激活。

圖4 miR-556-3p靶向調(diào)控PTEN/AKT信號通路

3 討論

在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)與正常肝細(xì)胞系LO2相比,miR-556-3p水平在HepG2細(xì)胞顯著降低,在HCC癌組織中與匹配的非癌肝組織相比也顯著降低。我們的研究結(jié)果還表明,過表達(dá)miR-556-3p可顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示miR-556-3p可能在HCC發(fā)生發(fā)展過程中起抑癌作用。因此,本研究結(jié)果提示,miR-556-3p是一種腫瘤抑制miRNA,通過靶向作用PTEN/AKT抑制肝癌細(xì)胞生長。

雖然我們發(fā)現(xiàn)miR-556-3p具有抑癌作用,但miR-556-3p在HepG2細(xì)胞的作用機制尚不清楚。為了探索miR-556-3p在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的分子作用機制,我們應(yīng)用生物信息學(xué)算法Target Scan分析靶基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-556-3p可以靶向作用PTEN。PTEN是一個單次跨膜蛋白,由582個氨基酸組成[14]。PTEN過表達(dá)常見于黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和食管癌。PTEN能抑制癌細(xì)胞凋亡,增加癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[15]。許多信號通路都受PTEN調(diào)控,如NF-κB、Wnt/β-catenin、MAPK/ERK、PI3K/AKT等[16]。之前的研究指出,在HCC患者,還發(fā)現(xiàn)PTEN表達(dá)升高。PTEN在HCC組織表達(dá)與腫瘤微血管浸潤、腫瘤分級和分期、復(fù)發(fā)率高相關(guān)[17,18]。在HCC組織或細(xì)胞,PTEN過表達(dá)通過增強PI3K/AKT、MAPK和Wnt/β-catenin信號通路等多種信號通路途徑,加快腫瘤細(xì)胞生長。

在我們的研究中,HepG2細(xì)胞過表達(dá)miR-556-3p可顯著下調(diào)PTEN蛋白表達(dá)。熒光素酶活性檢測表明,miR-556-3p可直接結(jié)合HepG2細(xì)胞PTEN。相關(guān)性分析顯示PTEN水平與HCC組織miR-556-3p呈反向相關(guān)。miR-556-3p可有效提高PTEN蛋白表達(dá),與PTEN蛋白表達(dá)降低有關(guān)。這些結(jié)果表明,miR-556-3p可能通過調(diào)控PTEN表達(dá)而起到抑癌作用。我們的研究結(jié)果首次表明,miR-556-3p至少部分通過抑制PTEN在HCC組織細(xì)胞表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用。