郭計(jì)華 和紹翠 洪婷 周端詠 張顥嚴(yán) 曾富飛

黔西南州地方香蕉種質(zhì)資源遺傳多樣性ISSR分析

郭計(jì)華1和紹翠1洪婷1周端詠1張顥嚴(yán)2曾富飛3

（1. 興義民族師范學(xué)院 貴州興義 562400；2. 天津醫(yī)科大學(xué) 天津 300000；3. 貴州富亨農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司 貴州冊(cè)亨 552200）

以黔西南州不同地區(qū)45份香蕉種質(zhì)資源為試驗(yàn)材料，利用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：8條引物擴(kuò)增出83條DNA條帶，每個(gè)引物平均擴(kuò)增條帶10.4條，多態(tài)性比例為96.38%。利用NTsys 2.10e軟件構(gòu)建親緣關(guān)系聚類圖，在相似系數(shù)為0.673時(shí)，將試驗(yàn)材料分為五大類：第Ⅰ類包含7份香蕉材料，第Ⅱ類包含9份香蕉材料，第Ⅲ類包含3份香蕉材料，第Ⅳ類包含22份香蕉材料，第Ⅴ類包含4份香蕉材料。研究為黔西南州香蕉種質(zhì)資源的保護(hù)、開發(fā)，利用提供參考。

香蕉；ISSR；黔西南州；遺傳多樣性

香蕉（spp.）屬芭蕉科（Musaceae），芭蕉屬（L.）的單子葉植物，是亞熱帶和熱帶的“四大果品”（荔枝、香蕉、菠蘿、椰子）之一，原產(chǎn)于熱帶亞熱帶地區(qū)[1-2]。香蕉營養(yǎng)豐富，含有脂肪、蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵、鉀、糖類、果膠、多種維生素等成分，除供鮮食外，還可以做主食、點(diǎn)心、菜肴等。工業(yè)上將香蕉制成香蕉粉、香蕉晶、濃縮香蕉泥、冷凍香蕉片、糖水香蕉、香蕉干等[3]。香蕉喜濕熱氣候，在土層深，土質(zhì)疏松、排水良好的地塊生長旺盛。黔西南布依族苗族自治州（黔西南州）位于云南、廣西、貴州三?。▍^(qū)）結(jié)合部，屬于亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候。這里氣候適宜，香蕉種質(zhì)資源十分豐富，對(duì)該區(qū)域的香蕉種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行研究十分必要。

簡單序列重復(fù)區(qū)間（Inter simple sequence repeats, ISSR）是由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkie-wicz等提出的一種新的微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)[4]，近年來，因其具有操作簡便、快速高效、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系的鑒定[5]、指紋圖譜建立[6]及遺傳多樣性分析[7]等方面。彭繼慶[8]應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)，以6個(gè)殼菜果種群共69份種質(zhì)為試驗(yàn)材料分析其種群親緣關(guān)系；李嬌婕[9]應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)135種木蘭科植物資源進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，比較各個(gè)科之間的遺傳差異。應(yīng)東山[10]應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)為78份芒果構(gòu)建指紋圖譜；楊琴[11]應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)分析71個(gè)石斛種質(zhì)的遺傳多樣性，并構(gòu)建了能區(qū)分71個(gè)石斛種質(zhì)的DNA指紋圖譜。桂騰琴等[12]應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)研究了48份梨品種的遺傳多樣性；王慶軍[13]應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)分析了35份石榴種質(zhì)的遺傳多樣性。劉小英等[14]以20份枇杷種質(zhì)資源為研究對(duì)象，采用ISSR分子標(biāo)記方法進(jìn)行遺傳多樣性分析。黔西南州香蕉種質(zhì)資源極為豐富，野生優(yōu)良品種在香蕉種質(zhì)開發(fā)、選育和改良中不容忽視。但是近年來，由于黔西南州積極響應(yīng)國家的脫貧政策，引進(jìn)了許多“脫貧蕉”，忽略對(duì)野生香蕉種質(zhì)資源的保護(hù)，以及野生香蕉種質(zhì)資源在人為活動(dòng)的壓力下，加之病蟲害的侵?jǐn)_和生態(tài)環(huán)境惡化等原因，給該區(qū)域的香蕉種質(zhì)資源生存帶來很大威脅，局部地區(qū)香蕉種質(zhì)資源正逐步瀕危。對(duì)此，利用ISSR標(biāo)記技術(shù)，對(duì)黔西南州不同地區(qū)的45份香蕉種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行分析，以期為該地區(qū)的香蕉種質(zhì)資源保護(hù)、開發(fā)、利用及鑒定提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的45份香蕉材料采于貴州省黔西南州義龍新區(qū)、下午屯街道、則戎鎮(zhèn)和望謨縣（表1）。選擇香蕉無病蟲害的新鮮嫩葉，將香蕉樣品洗凈消毒，放入液氮罐中帶回試驗(yàn)室，在?80℃冰箱保存，用于基因組DNA提取。

表1 四十五份香蕉種質(zhì)材料信息

注：45份香蕉種質(zhì)基因型根據(jù)黃秉智等（2006）編制的《香蕉種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》為分類依據(jù)。

1.2 方法

用購于北京六合華大基因科技有限公司的試劑盒提取45份香蕉種質(zhì)的基因組DNA。

ISSR引物根據(jù)已公布序列隨機(jī)挑選合成。從51條引物中篩選出條帶清晰、重復(fù)性好（部分引物篩選結(jié)果見圖1）的8條引物（表2），用于后續(xù)試驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系為25mL，其中12.5mL的Mix，1mL模板DNA（0.25mmol/L，70 ng），最后用ddH2O稀釋至25mL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 4 min；94℃ 30 s；55℃ 40 s；72℃ 10 min；34次循環(huán)；72℃延伸10 min，10℃保溫。

圖1 部分引物篩選結(jié)果

表2 引物篩選序列

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉基因組DNA的電泳檢測(cè)

取5mL的香蕉基因組總DNA樣品，加入1mL的上樣緩沖液，混勻，利用0.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電壓110 V，30 min。電泳結(jié)束后，將其置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，以檢測(cè)所提取香蕉基因組DNA的完整性及純度，部分香蕉基因組DNA檢測(cè)結(jié)果見圖2。

2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)與分析

用0.5%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并在凝膠成像儀中拍照保存（UBC840、842、843、844、846擴(kuò)增結(jié)果見圖3～7。）擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段長度均在200～2 000 bp，8條引物共檢測(cè)到83條DNA條帶，每個(gè)引物平均擴(kuò)增條帶10.4條，多態(tài)性比例為96.38%。

圖3 引物840擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)圖

圖4 引物842擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)圖

2.3 四十五份香蕉種質(zhì)的UPGMA聚類分析

試驗(yàn)采用凝膠電泳圖譜分析軟件和人工計(jì)數(shù)相結(jié)合，把每個(gè)引物擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，按照相同遷移位置上無條帶賦值為0，有條帶賦值為1，分別統(tǒng)計(jì)每個(gè)引物擴(kuò)增的ISSR多態(tài)性位點(diǎn)，由“01”組成的ISSR表型數(shù)據(jù)矩陣表。利用NTsys 2.10e軟件計(jì)算香蕉種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)（Sg:Genetic similarity），通過非加權(quán)算術(shù)平均數(shù)聚類法（UPGMA），建立45份香蕉種質(zhì)資源遺傳關(guān)系聚類圖（圖8）。在相似系數(shù)為0.673時(shí)，將45份香蕉種質(zhì)分為五大類：第Ⅰ類包含7份香蕉種質(zhì)，第Ⅱ類包含9份香蕉種質(zhì)，第Ⅲ類包含3份香蕉種質(zhì)，第Ⅳ類包含22份香蕉種質(zhì)，第Ⅴ類包含4份香蕉種質(zhì)。將第Ⅰ類劃分為2個(gè)亞類：第一亞類中包含望謨1、2、3、4號(hào)，其中，4號(hào)與1、2、3號(hào)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；第二亞類中包含義龍新區(qū)1號(hào)和下五屯街道1、2號(hào)。將第Ⅱ類分為3個(gè)亞類：第一亞類中包含義龍新區(qū)3、4號(hào)和則戎1、3號(hào)；第二亞類中包含則戎2號(hào)和下五屯街道3、4號(hào)；第三亞類包含則戎4號(hào)和望謨5號(hào)。第Ⅲ類3份香蕉種質(zhì)為義龍新區(qū)2、6號(hào)和望謨6號(hào)。將第Ⅳ類劃分為2個(gè)亞類：第一亞類包含21份香蕉種質(zhì)，將其劃分為4個(gè)小類，第一小類包含望謨7、8、9、11、12、13、14、18、19、20號(hào)，第二小類包含望謨16、17號(hào)，第三小類僅有一份香蕉種質(zhì)為望謨15號(hào)，第四小類包含義龍新區(qū)7號(hào)，則戎6、7、8號(hào)，下五屯街道7、8、9號(hào)和望謨21號(hào)；第二亞類僅包含1份香蕉種質(zhì)，望謨10號(hào)。第Ⅴ類包含義龍新區(qū)5號(hào)，則戎5號(hào)和下五屯街道5、6號(hào)。則戎7號(hào)和8號(hào)在相似系數(shù)為0.98時(shí)歸為一類，望謨2號(hào)和3號(hào)在相似系數(shù)為0.96時(shí)歸為一類，則戎4號(hào)和望謨5號(hào)在相似系數(shù)為0.94時(shí)歸為一類，可能存在同物異名的現(xiàn)象，其中望謨10號(hào)香蕉種質(zhì)與其余香蕉種質(zhì)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖5 引物843擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)圖

圖6 引物844擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)圖

圖7 引物846擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)圖

3 結(jié)論

用篩選出的8條引物對(duì)45份香蕉種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出83條DNA條帶，多態(tài)性比例為96.38%。利用NTsys 2.10e 軟件對(duì)黔西南州4個(gè)地區(qū)的45份香蕉種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，可將其分為五大類。聚類結(jié)果表明，除望謨10號(hào)香蕉種質(zhì)外，可將其余香蕉種質(zhì)聚在一起。因此，望謨10號(hào)可能為最古老的香蕉種質(zhì)，與其余香蕉種質(zhì)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。則戎鎮(zhèn)10號(hào)和11號(hào)，望謨2號(hào)和3號(hào)以及則戎鎮(zhèn)4號(hào)和望謨5號(hào)，這可能存在同物異名的現(xiàn)象。研究結(jié)果表明，采用ISSR技術(shù)可以將香蕉遺傳背景和形態(tài)特征不同的香蕉種質(zhì)進(jìn)行有效分類。

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ISSR Analysis of Genetic Diversity of Local Banana Germplasm Resources in Qianxi'nan Prefecture

GUO Jihua1HE Shaocui1HONG Ting1ZHOU Duanyong1ZHANG Haoyan2ZENG Fufei3

(1. Minzu Normal University of Xingyi, Xingyi, Guizhou 562400, China; 2. Tianjin Medical University, Tianjin 300000, China; 3. Guizhou Fuheng Agricultural Development Co., Ltd., Ceheng, Guizhou 552200, China)

Genetic diversity of 45 banana germplasm resources from different regions of Qianxi'nan Prefecture was analyzed by ISSR markers. The results showed that 83 DNA bands were amplified by eight primers, with an average of 10.4 per primer, and the proportion of polymorphism was 96.38%. Using the NTsys 2.10e software to construct the phylogenetic cluster diagram, the experimental materials were divided into five categories when the similarity coefficient was 0.673: Class Ⅰ contained seven banana materials, Class Ⅱ included nine banana materials, class Ⅲ had three banana materials and class Ⅳ contained 22 banana materials, and Class Ⅴ contained four banana materials. This study provides some reference for the protection, development, and utilization of banana germplasm resources in Qianxi'nan Prefecture.

banana; ISSR; Qianxi'nan Prefecture; genetic diversity

S668.1

A

10.12008/j.issn.1009-2196.2023.09.009

2022-12-20；

2023-03-02

2022年國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目《黔西南百香果種質(zhì)資源遺傳多樣性ISSR分析》（No.202210666282）；貴州省“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”（No.黔教合協(xié)同創(chuàng)新字[2015]08）；貴州省高校創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)（No.黔教合人才團(tuán)隊(duì)字[2013]30）。

郭計(jì)華（1984—），男，碩士，高級(jí)試驗(yàn)師，主要研究方向?yàn)楣麡浞N質(zhì)資源及遺傳多樣性，E-mail：6020183@qq.com。

（責(zé)任編輯 龍婭麗）