陳華燕，黃麒諭，徐蘇華

（廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，國家藥品監(jiān)督管理局體外循環(huán)器械重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州市生物醫(yī)用血液凈化材料研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510663）

血液透析器是血液與透析液進(jìn)行交換的管路與容器，是血液凈化治療所需的重要醫(yī)療器械。血液透析器外殼多使用聚碳酸酯樹脂，中空纖維膜則常用聚砜膜、聚醚砜膜、聚酰胺膜等材料[1]。聚砜型中空纖維膜，是以聚砜為成膜聚合物，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)為致孔劑，N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)為溶劑，采用浸沒沉淀相轉(zhuǎn)換法制備而成[2]。水溶性PVP 的加入，一方面有利于膜絲致孔時(shí)相分離[3]，保證制備的纖維膜絲有理想的孔徑；另一方面PVP 能有效提高纖維膜絲的親水性，從而改善膜材的血液相容性。雖然PVP在生理上是惰性的，它不刺激皮膚和眼睛，也不會(huì)使皮膚過敏，但在第三類醫(yī)療器械透析器中的溶出限量應(yīng)該予以監(jiān)控[4]。DMAC 作為一種重要的工業(yè)溶劑，用于中空纖維血液透析膜的合成中，一般通過呼吸道或皮膚進(jìn)入機(jī)體，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟和心臟等多器官造成損害[5-6]。相關(guān)研究表明，NMP能導(dǎo)致出生缺陷和潛在的生殖毒性，對(duì)人體消化系統(tǒng)和中樞系統(tǒng)也具有刺激作用[7-10]。由于制備工藝的特征，PVP、DMAC 和NMP 會(huì)不可避免地殘留在纖維膜中，隨血液透析過程直接進(jìn)入血液中，對(duì)人體造成損害，因此對(duì)這三種物質(zhì)的溶出量進(jìn)行測(cè)定監(jiān)控很有必要。

PVP 是以上三種物質(zhì)中相對(duì)分子質(zhì)量較大的，可以借助大分子常用的分離手段凝膠滲透色譜法[11-12]分離，或衍生成有色物質(zhì)后利用紫外分光光度法[13-15]進(jìn)行含量測(cè)定。由于以上兩種方法靈敏度不高，方法條件復(fù)雜，徐萍華等[4]建立了高效液相色譜法測(cè)定隱形眼鏡護(hù)理液中PVP 含量。DMAC 與水混溶，沸點(diǎn)較高，較難用溶劑或其它方法提取，一般采取氣相色譜法測(cè)定[16-17]，但利用直接進(jìn)樣方式測(cè)定時(shí)，存在色譜峰形不佳、色譜柱易受污染和損壞、需要有機(jī)溶劑稀釋等不足。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法則存在樣品處理過程復(fù)雜等問題[18]，在紡織品和環(huán)境檢測(cè)中有采用液相色譜法測(cè)定DMAC 的文獻(xiàn)報(bào)道[10,19]，液相色譜法則可以很好的解決上述兩種方法存在的問題。目前尚無高效液相色譜法測(cè)定血液透析器中PVP 和DMAC 的報(bào)道。NMP 的測(cè)定方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS)法[20]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法[21]，高效液相色譜(HPLC)法[10,22]等。目前尚無利用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定血液透析器中PVP、DMAC、NMP 三種殘留物的報(bào)道。

筆者以超純水作為浸提溶劑，模擬臨床使用條件，浸提出血液透析濃縮器中的PVP、DMAC 和NMP，并采用高效液相色譜法測(cè)定其含量。該方法制樣簡單，靈敏度高，準(zhǔn)確度好，適用于對(duì)血液透析器中上述三種溶出物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：LC-20AT 型，配光電二極管陣列紫外可見光檢測(cè)器(SPD-M20A)，島津企業(yè)管理(中國)有限公司。

滾壓泵：JHBP-200B 型，廣州市暨華醫(yī)療器械有限公司。

數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：BL810C型，雅馬拓科技貿(mào)易(上海)有限公司。

電子天平：MSA225S-1CE-DU 型，感量為0.01 mg，賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司。

PVP對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于97%，中國食品藥品檢定研究院。

DMAC、NMP 對(duì)照品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

乙腈：色譜純，德國默克公司。

血液透析器樣品：樣品1 為中空纖維血液透析器，樣品2為一次性使用空心纖維血液透析器，膜材質(zhì)均為聚醚砜膜。

實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Inertsil? ODS-SP柱[250 mm×4.6 mm，5 μm 島津企業(yè)管理(中國)有限公司]；檢測(cè)波長：205 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；流動(dòng)相：乙腈-水溶液(體積比為5∶95)；洗脫方式：等度洗脫；流動(dòng)相流量：1.0 mL/min。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 系列混合對(duì)照品工作溶液配制

用分析天平分別精密稱量100 mg PVP、20 mg DMAC、20 mg NMP，混合后用水溶解并定容至200 mL，搖勻，配制成混合對(duì)照品溶液。用水逐級(jí)稀釋混合對(duì)照品溶液，配制成系列混合對(duì)照品工作溶液，其中PVP 的質(zhì)量濃度分別為PVP 5.0、10.0、30.0、60.0、100.0 μg/mL，DMAC 和NMP 的質(zhì)量濃度均分別為0.2、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL。

1.3.2 樣品溶液制備

參考臨床中血液透析器的使用過程，取一套管路與透析器連接，取500 mL 水作為浸提溶劑，用恒流泵于(37±1) ℃下使溶劑以200 mL/min 的流量循環(huán)沖洗血室6 h，同時(shí)用水充滿透析液室，循環(huán)結(jié)束后，把血室和透析液室內(nèi)的溶液全部吹出，收集全部液體，冷卻至室溫25 ℃，作為樣品溶液。

取同體積水，不裝血液透析器，同法制備空白溶液。

血液透析器浸提示意圖如圖1所示。

圖1 血液透析器浸提示意圖

1.3.3 測(cè)定方法

以0.45 μm膜過濾樣品溶液和系列混合對(duì)照品工作溶液，分別取20 μL注入液相色譜儀測(cè)定，利用色譜峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中PVP、DMAC、NMP的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇

PVP、DMAC、NMP 的紫外最大吸收波長分別為220、205、200 nm，最大吸收波長相差不多且有浮動(dòng)范圍，因此選擇205 nm作為檢測(cè)波長。乙腈和甲醇均為常用的液相色譜流動(dòng)相，甲醇在此吸收波長內(nèi)有紫外吸收，干擾測(cè)定，故選擇乙腈作為流動(dòng)相，能夠避免此種干擾。PVP、DMAC、NMP 均為極性物質(zhì)，參考文獻(xiàn)[2]、[4]的流動(dòng)相配比，選擇乙腈-水(體積比為5∶95)為流動(dòng)相。

2.2 浸提條件選擇

PVP、DMAC、NMP 均易溶于水，選擇水作為浸提溶劑即環(huán)保又能避免其它有機(jī)溶劑溶出的干擾，所獲浸提液可直接進(jìn)樣，方便快捷，易于操作。血液透析器的臨床使用時(shí)間最長可達(dá)6 小時(shí)，因此選擇循環(huán)時(shí)間為6 小時(shí)。根據(jù)臨床使用時(shí)人體的體溫，選擇循環(huán)溫度為(37±1) ℃。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取空白溶液、混合對(duì)照品溶液和樣品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，色譜圖如圖2所示。結(jié)果表明，PVP、DMAC、NMP 色譜保留時(shí)間分別為5.211、6.490、7.738 min，理論塔板數(shù)分別為13 852、16 098、17 065，分離度分別為8.052、6.700、5.660，目標(biāo)物色譜峰與基質(zhì)峰無干擾，可用于準(zhǔn)確定量，方法專屬性良好。

圖2 空白溶液、混合對(duì)照品溶液及樣品溶液色譜圖

2.4 線性方程與檢出限

按照1.2 色譜條件分別測(cè)定系列混合對(duì)照品工作溶液，以各組分色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得PVP、DMAC、NMP 的線性回歸方程分別為y=466.173x+554.707，y=8 755.9x+1 436.21，y=61 480.5x+674.819，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 7、0.999 9、0.999 9。結(jié)果表明，PVP、DMAC、NMP 的質(zhì)量濃度分別在5.0～100.0、0.2～20.0、0.2～20.0 μg/mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

取PVP、DMAC、NMP混合對(duì)照品溶液，按要求用水等比稀釋，在1.2色譜條件下測(cè)定低濃度混合對(duì)照品溶液，以信噪比大于等于3 對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法檢出限，得PVP、DMAC、NMP的檢出限分別為1.461、0.011、0.019 μg/mL。

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

分別取樣品1、2浸提液各6份，共12份，以樣品浸提液作為基底，分別加入適量的混合對(duì)照品溶液，制備成樣品加標(biāo)溶液，在1.2色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均回收率和測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表1。

表1 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)中華人民共和國藥典(2020年版)9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，回收率應(yīng)在85%～115%范圍內(nèi)，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5%；當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為1 μg/mL 時(shí)，回收率應(yīng)在75%～120%范圍內(nèi)，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5%。由表1可知，兩種樣品中PVP 的回收率分別為103.99%、102.69%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.67、0.23；DMAC回收率分別為99.83%、95.13%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.08、0.08；NMP 回收率分別為98.35%、100.05%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.14、0.10，均符合中國藥典的相關(guān)要求。

3 結(jié)語

建立了一種高效液相色譜法，用于血液透析器中PVP、DMAC、NMP三種殘留物的溶出量測(cè)定，以水作為浸提溶劑浸提血液透析器，樣品溶液可以直接用于色譜測(cè)定，無需進(jìn)行富集提純。該方法專屬性好，靈敏度高，精密度和準(zhǔn)確性均良好，檢測(cè)過程高效環(huán)保，操作流程簡便快捷。