林俊豪，閆啟東，金昌權(quán)，沈林麗，羅士波，徐研菲，吳家泰，王詩(shī)怡

（1.臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，醫(yī)學(xué)與制藥工程學(xué)院，浙江臺(tái)州 318000； 2.浙江合譜儀器有限公司，浙江臺(tái)州 318000）

枇杷葉為薔薇科植物枇杷的葉子，又名巴葉、蘆桔葉。枇杷葉中的不同成分具有不同的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，枇杷葉提取物中的活性成分有多種，主要為黃酮類、多糖類化合物和三萜酸[1]。在植物體內(nèi)黃酮類化合物大多與糖結(jié)合生成苷，多糖屬于碳水化合物，三萜酸主要有山楂酸、熊果酸等。黃酮類、多糖類化合物均具有抗氧化降血脂作用，三萜酸可以抗疲勞、保肝利尿。上述三種物質(zhì)對(duì)人體健康大有好處，可以延緩人的衰老。枇杷葉還具有較高的藥用價(jià)值，如調(diào)節(jié)新陳代謝和內(nèi)分泌系統(tǒng)，治療糖尿病[2-3]。此外枇杷葉還可作為食品，如以枇杷葉為原料的復(fù)合型果酒[4]。筆者針對(duì)枇杷葉中的活性物質(zhì)及其提取方法進(jìn)行綜述。

1 枇杷葉的提取方法

目前國(guó)內(nèi)外提取枇杷葉中活性物質(zhì)的方法主要包括：響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取法[5]、超聲波輔助雙水相提取法[6]、內(nèi)部沸騰溶劑提取法[7]、超聲波輔助酶提取法[8]、水提醇沉提取法[9]、超臨界二氧化碳萃取法[10]等。而活性物質(zhì)的分析常用高效液相色譜法[11]進(jìn)行測(cè)定。

1.1 響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取法

響應(yīng)面法是一種高效且應(yīng)用廣泛的統(tǒng)計(jì)方法，即RSM[12]。微波技術(shù)普及于1986 年，Gedye 等[13]首次將微波用于有機(jī)合成，且該技術(shù)在有機(jī)合成領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。相較于傳統(tǒng)溶劑提取法，微波輔助法具有高選擇性，可顯著提高提取效率，且可用于對(duì)熱不穩(wěn)定的物質(zhì)。利用響應(yīng)面法結(jié)合微波輔助提取，將復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)坐標(biāo)化，具有高效率、無(wú)污染的優(yōu)點(diǎn)[14]。黃百祺等[15]運(yùn)用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，測(cè)量枇杷葉中熊果酸和齊墩果酸的質(zhì)量濃度。取粉碎過(guò)篩后枇杷葉粉末3.0 g，按照料液比1 g∶20 mL 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在微波功率為500 W下提取11.5 min，最后得到提取率為0.93%，顯示比傳統(tǒng)工藝更優(yōu)。

1.2 超聲波輔助雙水相提取法

超聲波技術(shù)具有高效簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，王明艷等[16]將超聲波運(yùn)用于提取枇杷葉中有效成分，采用超聲波提取法提取枇杷葉中的多糖，通過(guò)多次對(duì)比試驗(yàn)得出提取條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響程度，依次為超聲時(shí)間、提取溫度、液固比、超聲功率。確定最佳實(shí)驗(yàn)條件為料液比為1 g∶12 mL，溫度為60 ℃，用120 W超聲功率超聲35 min，得到提取率約為1.24%。與常規(guī)水提法對(duì)比，該法具有污染小、效率高和提取率高的優(yōu)點(diǎn)，各項(xiàng)數(shù)據(jù)全面高于常規(guī)水提法，該作者提出可以將超聲法與水提法有機(jī)結(jié)合。雙水相提取法能夠避免使用有毒試劑，且提供溫和的水環(huán)境。王麗等[17]利用乙二醇-硫酸銨雙水相環(huán)境進(jìn)行探索研究，并繪制了蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。操作條件：枇杷粉為0.2 g、無(wú)水乙醇為4.0 mL、硫酸銨為1.8 g，在料液比為1 g∶50 mL和溫度為40 ℃的條件下，提取1 h，得到的提取效率最大，可達(dá)7.49%，此方法成本較低。玉瀾等[18]運(yùn)用類似方法進(jìn)行探索研究，其實(shí)驗(yàn)條件為超聲功率為270 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%，超聲溫度為40 ℃。運(yùn)用乙醇與硫酸銨雙水相提取，可較大程度提取枇杷葉中的黃酮類化合物。

1.3 內(nèi)部沸騰溶劑提取法

內(nèi)部沸騰提取法是傳統(tǒng)的提取法，內(nèi)部沸騰法雖然提取時(shí)間較長(zhǎng)，但是方法較為環(huán)保。內(nèi)部沸騰法在提取植物有效成分方面具有較好的效果[19]。歐蜀云等[20]用內(nèi)部沸騰法提取枇杷內(nèi)的多糖，采用45%的乙醇溶液在98 ℃溫度條件下，提取30 min，多糖提取率為6.66%。

1.4 超聲波輔助酶提取法

超聲波輔助法即超聲波法和傳統(tǒng)酶解法結(jié)合，相較于傳統(tǒng)酶解法，超聲波可以提高酶解得率。傅賢明等[21]運(yùn)用超聲波輔助酶法提取枇杷葉中的總黃酮，通過(guò)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算線性回歸方程，再通過(guò)比色法，計(jì)算總黃酮的含量，并對(duì)乙醇濃度、料液比和超聲時(shí)間等因素進(jìn)行了探索，得出最佳總黃酮提取條件：料液比為1 g∶40 mL，超聲功率為140 W，溫度為70 ℃，超聲時(shí)間30 min，總黃酮提取率為10.53%。

1.5 水提醇沉提取法

水提醇沉法又稱為水提醇法，可廣泛應(yīng)用于植物活性物質(zhì)的提取，如枇杷葉中總黃酮的提取。王增斌等[22]運(yùn)用水提醇法提取枇杷葉中的總黃酮，料液比為1 g∶20 mL，以90 W超聲功率在55 ℃條件下超聲40 min，總黃酮提取率約為4.18%。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察各因素變化對(duì)提取率的影響，得到提取條件對(duì)枇杷葉中總黃酮提取率的影響程度的大小排序，依次為提取溫度、超聲波功率、提取時(shí)間。

1.6 超臨界CO2萃取法

超臨界CO2萃取法提取溫度較低，可以保護(hù)被提取成分，CO2在萃取過(guò)程中起到保護(hù)樣品的作用，使產(chǎn)品純度更高[23]。張慧恩等[24]運(yùn)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，探索萃取溫度、萃取壓力和動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間三個(gè)主要因素對(duì)提取率的影響，通過(guò)計(jì)算超臨界CO2提取參數(shù)的回歸方程，得到提取率。試驗(yàn)條件如下：稱取一定量枇杷葉粉末，通入CO2，在萃取溫度為61 ℃，萃取壓力為25.8 MPa下，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間為40 min，熊果酸理論提取率約為3.96 mg/g。

枇杷葉中活性物質(zhì)通過(guò)不同的提取方法提取后，需要一定的分析方法進(jìn)行分析檢測(cè)。高效液相色譜法(HPLC)作為高效的分離分析儀器，常作為藥用植物活性物質(zhì)提取物的分析方法[25]。陳榮祥等[26]利用高效液相色譜法檢測(cè)枇杷中齊墩果酸和熊果酸，對(duì)提取溶劑、提取時(shí)間、提取溫度以及萃取次數(shù)等因素進(jìn)行試驗(yàn)探索。優(yōu)化的條件為：以體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇水溶液為提取溶劑，提取溫度為110 ℃，提取次數(shù)為2 次，提取時(shí)間每次10 min。以乙腈與15 mmol/L 乙酸銨溶液(pH 9.3)(體積比為3∶1)為流動(dòng)相等梯度洗脫，流量為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm，色譜柱溫度為40 ℃，測(cè)定枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的含量，得到平均加標(biāo)回收率分別為95.0%～98.9%和97.3%～100.5%。此分析方法具有分析速度快、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好的特點(diǎn)，適用于枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定。

2 枇杷葉中活性物質(zhì)

止咳露類藥品中多含有枇杷，說(shuō)明枇杷葉中有止咳成分。同時(shí)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，枇杷葉中含有很多可以入藥的成分，可以制作清肺止咳、抗癌、抗炎癥的藥物[27]；同時(shí)枇杷葉中的黃酮類、三萜酸類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類等化學(xué)成分還具有抗氧化、降血糖、抗病毒、護(hù)肝的作用[28]。

2.1 黃酮類化合物

枇杷葉中黃酮類成分能夠調(diào)節(jié)人體內(nèi)的血糖，增強(qiáng)人體免疫力，減緩人的衰老[29]?？傸S酮能夠清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基，且總黃酮清除DPPH自由基能力與濃度成正比。經(jīng)過(guò)提純后總黃酮濃度更高，清除DPPH自由基效率更高[30]。梁樹(shù)才等[31]建立小鼠急性肝損傷模型，觀察黃酮化合物(TEL)對(duì)腎臟系數(shù)的降低作用。超氧化物歧化酶(SOD)生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活性越高，清除自由基的速度就越快。枇杷葉的抗氧化活性與總黃酮和總酚含量顯著相關(guān)[32]，且三倍體葉片總黃酮含量及其對(duì)應(yīng)的抗氧化活性均高于二倍體。付曉丹等[33]對(duì)枇杷葉中黃酮提取物進(jìn)行研究，采用超聲波提取法，對(duì)枇杷葉各部位的黃酮化合物含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：黃酮化合物在葉尖中含量最高，與其它部位的黃酮化合物含量存在顯著差異性。具體測(cè)定步驟如下：準(zhǔn)備好油脂，往油脂中加入黃酮化合物，再用碘量法測(cè)定油脂中的過(guò)氧化值，計(jì)算出1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除率，同時(shí)測(cè)定2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基的清除率，計(jì)算平均值。最終得出抗氧化性與黃酮化合物濃度成正比，且枇杷葉中的黃酮化合物與抗壞血酸有著一定的協(xié)同抗氧化作用。

2.2 三萜酸類化合物

三萜酸可以降低神經(jīng)元的興奮性，并在癲癇中發(fā)揮作用。WEI X等[34]運(yùn)用高光譜成像法來(lái)測(cè)定枇杷葉片中三萜酸在枇杷葉各個(gè)部位的含量分布，用光譜數(shù)據(jù)和三萜酸含量建立數(shù)據(jù)模型，經(jīng)過(guò)一系列處理，得到三萜酸含量分布圖。與老年的枇杷葉片相比，幼年的枇杷葉片中三萜酸含量較低，且主要分布在葉肉區(qū)域。郭磊等[35]以大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究三萜酸對(duì)慢性支氣管炎的療效，發(fā)現(xiàn)注射三萜酸后，大鼠咳嗽次數(shù)顯著減少，有效抑制了其體內(nèi)巨噬細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的活性，減少了一氧化氮的釋放。

三萜酸類化合物主要有熊果酸、齊墩果酸和山楂酸等，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和抗腫瘤的作用[36]。葛金芳等[37]用環(huán)磷酰胺為原料建立研究小鼠免疫力的模型，同時(shí)注射枇杷葉中提取的三萜酸，觀察該物質(zhì)對(duì)小鼠細(xì)胞免疫的作用，最終得出三萜酸對(duì)小鼠細(xì)胞免疫具有良好的調(diào)節(jié)作用，為枇杷葉中的三萜酸應(yīng)用于臨床提供了良好的思路。

2.3 苷類化合物

枇杷葉中的苦杏仁苷與枇杷藥理中的祛痰止咳作用相對(duì)應(yīng)[38]。朱月月等[39]研究了止咳枇杷糖漿的止咳效果，采用HPLC 法測(cè)定枇杷葉中苦杏仁苷的含量，分析止咳枇杷糖漿中各成分之間的配比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，止咳糖漿中熊果酸和齊墩果酸占據(jù)的比例非常小，兩者在制作過(guò)程中有大量的損失，苦杏仁苷是發(fā)揮主要作用的成分，可以通過(guò)控制產(chǎn)品中苦杏仁苷的含量來(lái)提高止咳糖漿的質(zhì)量。

3 總結(jié)和展望

枇杷葉中活性物質(zhì)的提取方法中，超聲波雙水相提取法是利用超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)將活性成分提出，再將其在互不相溶的雙水相中實(shí)現(xiàn)提取和分離[40]。超聲波提取的高效率與雙水相保護(hù)活性成分兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合就構(gòu)成了超聲波輔助雙水相法，該方法具有提取效率高和選擇性好的特點(diǎn)。內(nèi)部沸騰法通過(guò)高溫使溶液氣化而讓有效成分大量擴(kuò)散，較傳統(tǒng)水提法效率有所提高[41]。超聲波輔助酶解法較傳統(tǒng)酶解法提高了酶解得率和提取效率。水提醇沉法應(yīng)用范圍廣，操作簡(jiǎn)單、成本低，且可以較好地保護(hù)被提取物[42]。超臨界CO2萃取法可用于熱穩(wěn)定性較差的物質(zhì)，且靈敏度高，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確，但相對(duì)成本高。高效液相色譜法可以作為枇杷葉中活性物質(zhì)提取常用的分析方法，進(jìn)行物質(zhì)的含量測(cè)定。

枇杷葉中含有多種活性成分，原料易于采集且成本不高。枇杷葉中活性成分的提取方法，可以廣泛應(yīng)用在各種藥用植物的活性物質(zhì)提取中。在保證良好的選擇性和重復(fù)性前提下，使用綠色、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的提取溶劑減少環(huán)境污染，提高活性物質(zhì)提取得率是現(xiàn)代提取方法的發(fā)展方向。研究活性成分的提取方法不僅對(duì)開(kāi)發(fā)枇杷葉中活性成分藥用價(jià)值有著重要意義，同時(shí)也為其它中藥植物的提取開(kāi)發(fā)利用提供了新的思路。