羅京京，程慶兵，金鳳華，王瑋

（1.安徽省藥品審評查驗中心，合肥 230051； 2.合肥市食品藥品檢驗中心，合肥 230088）

天麻為蘭科植物天麻的干燥塊莖，是一種應用廣泛的傳統(tǒng)中藥材，在歷代本草文獻中均有記載。天麻具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡之作用，臨床用于小兒驚風、癲癇抽搐、破傷風、頭痛眩暈、手足不遂、肢體麻木、風濕痹痛[1-2]。因需求量急劇上升，野生天麻資源瀕臨枯竭，目前主要以人工栽培為主，栽培地集中在貴州、安徽、云南、陜西、湖北等地[3-4]。

現(xiàn)階段，中藥材種植過程中使用農(nóng)藥現(xiàn)象較普遍。為保證中藥質(zhì)量，保障人民健康，應嚴格控制農(nóng)藥、化肥等在中藥材種植環(huán)節(jié)中的使用。《中國藥典》2020年版首次提出禁用農(nóng)藥殘留量檢測要求，對高毒、高風險農(nóng)藥嚴格把控，從源頭管控中藥質(zhì)量[5-6]。近年來，天麻農(nóng)藥殘留超標情況時有發(fā)生，對臨床用藥帶來較大風險。目前，農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法[7-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-15]等。胡德禹等[7]采用氣相色譜法測定了天麻中有機氯農(nóng)藥殘留；郭漢文等[8]采用氣相色譜法測定了天麻中12有機氯農(nóng)藥殘留；張婷等[13]采用氣相色譜-質(zhì)譜法測定了天麻中二硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留；馮紅等[16]采用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定三七中禁用農(nóng)藥殘留；楊紅等[9]采用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定丹參中禁用農(nóng)藥殘留；周琴等[10]采用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測了前胡中禁用農(nóng)藥殘留。采用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定天麻中53種禁用農(nóng)藥殘留的方法尚未見報道。筆者參照文獻[11]、[15]、[16]，采用乙腈直接提取法和基于QuEChERS 原則的固相萃取法對天麻樣品進行處理，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)合測定天麻中53 種禁用農(nóng)藥殘留量。該方法操作簡便，靈敏度高，可分析天麻禁用農(nóng)藥殘留量情況，為市場上天麻的質(zhì)量評價提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：ACQUITY XEVO TQ-S 型，美國沃特世科技有限公司。

氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：8890-G7000D型，美國安捷倫科技有限公司。

電子天平：XPE205 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

旋渦振蕩器：VORTEX3型，德國艾卡公司。

離心機：Centrifuge 5417R 型，德國Eppendorf公司。

氮吹儀：MV5型，北京萊伯泰科公司。

30種農(nóng)藥混合標準溶液：編號為1ST 29486-A，各組分質(zhì)量濃度見表1，天津阿爾塔科技有限公司。

表1 30種農(nóng)藥混合標準溶液中各組分質(zhì)量濃度μg/mL

33 種農(nóng)藥混合標準溶液：編號為81208a，含有α-六六六、γ-六六六、β-六六六、δ-六六六、4，4′-滴滴伊、2，4′-滴滴涕、治螟磷、特丁硫磷、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈、對硫磷、甲基對硫磷、內(nèi)吸磷、殺蟲脒、久效磷、甲基異硫磷、蠅毒磷、4，4′-滴滴滴、4，4′-滴滴涕、β-硫丹、α-硫丹、硫丹硫酸酯、狄氏劑、三氯殺螨醇、氟蟲腈砜、除草醚、甲基硫環(huán)磷、艾氏劑、氟甲腈、滅線磷、甲拌磷、水胺硫磷、苯線磷，各組分質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。

磷酸三苯酯標準溶液：100 μg/mL，溶劑為甲苯，編號為BW 901609-100-N，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。

乙腈：HPLC級，美國默克公司。

QuEChERS 試劑盒：含鹽包和凈化管，批號為22 A217PY2，北京凱思科科技公司。

天麻樣品：某單位提供。

1.2 樣品處理

1.2.1 乙腈直接提取法

稱取過3#篩的天麻樣品粉末5.0 g，置于離心管中，加入1 g 氯化鈉，搖散；再加入50 mL 乙腈，在旋渦振蕩器上高速旋渦2 min，充分混勻；再于4 ℃下以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，分取上清液；向沉淀中再加入50 mL乙腈，勻漿處理1 min，離心；合并兩次提取的上清液，減壓濃縮至約5 mL，冷卻，用乙腈稀釋至10.0 mL，搖勻，待測。

1.2.2 基于QuEChERS原則的處理方法

稱取過3#篩的天麻樣品粉末3.0 g，置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入10 mL 水及質(zhì)量濃度為0.01 g/mL 的冰乙酸溶液15 mL，渦旋，使藥粉充分浸潤，放置30 min；加入乙腈15.00 mL，渦旋，混勻，以500 次每分鐘的速率劇烈震蕩5 min，加入QuEChERS鹽包，立即搖散，再以500次每分鐘的速率劇烈震蕩3 min，于冰浴中冷卻10 min，于4 ℃下以4 000 r/min 離心5 min，取上清液9 mL，置于QuEChERS凈化管中，渦旋使其充分混勻，以500次每分鐘的速率劇烈震蕩5 min，使之凈化完全，于4 ℃下以4 000 r/min 離心5 min，精密吸取上清液5 mL，置于氮吹儀上，于40 ℃水浴中濃縮至約0.4 mL，用乙腈稀釋至1.0 mL，渦旋，混勻，待測。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜法儀器工作條件

1.3.1 液相色譜儀

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱[100 mm×2.1 mm，1.7 μm，沃特世科技(上海)有限公司]；流動相：A 相為0.1%(體積分數(shù)，下同)甲酸溶液，B 相為乙腈-0.1%甲酸溶液(體積比為95∶5)，A、B 相均含有5 mmol/L 甲酸銨；洗脫方式：梯度淋洗，0～1 min時70% A，1～12 min 時70%～0% A，12～14 min 時0%～100% A；流動相流量：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：1 μL。

1.3.2 質(zhì)譜儀

離子模式：電噴霧電離，正離子掃描；毛細管電壓：2.50 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；錐孔氣：氮氣，流量為20 L/h；脫溶劑氣：氮氣，流量為1 000 L/h。29種農(nóng)藥化合物質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 29種農(nóng)藥化合物質(zhì)譜參數(shù)

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜法儀器工作條件

1.41 氣相色譜儀

色譜柱：DB-17MS 彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司)；進樣口溫度：250 ℃；進樣方式：不分流；進樣體積：1 μL；柱箱溫度：程序升溫，初始溫度為60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min的速率升溫至120 ℃，然后以10 ℃/min的速率升溫至160 ℃，再以2 ℃/min 的速率升溫至230 ℃，最后以15 ℃/min的速率升溫至300 ℃，保持6 min；載氣：高純氦氣，流量為1.0 mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜儀

電離方式：電子轟擊電離模式；電離能量：70 eV；離子源溫度：250 ℃；質(zhì)譜傳輸接口溫度：250 ℃；碰撞氣：高純氮氣；四級桿溫度：150 ℃；掃描方式：多反應監(jiān)測模式(MRM)。24種農(nóng)藥化合物質(zhì)譜參數(shù)見表3。

表3 24種農(nóng)藥化合物質(zhì)譜參數(shù)

1.5 溶液配制

29 種農(nóng)藥（具體名稱見表2）混合標準儲備液：精密量取30 種農(nóng)藥混合標準溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至標線，搖勻。

基質(zhì)匹配系列混合標準工作溶液A：取天麻空白基質(zhì)樣品，按1.2.1方法處理。取樣品提取液6份，各1.0 mL，分別于40 ℃水浴中濃縮至約0.6 mL，分別加入29 種農(nóng)藥混合標準儲備液10、20、50、100、150、200 μL，用乙腈稀釋至1.0 mL，渦旋，混勻。

24種農(nóng)藥（具體名稱見表3）混合標準儲備液：1 μg/mL，精密量取33 種農(nóng)藥混合標準溶液0.5 mL，置于50 mL容量瓶中，用乙腈定容至標線，搖勻。

磷酸三苯酯溶液：1 ng/mL，精密量取磷酸三苯酯標準溶液50 μL，置于50 mL 容量瓶中，用乙腈定容至標線，搖勻。精密量取上述溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，加乙腈稀釋并定容至標線，搖勻。

基質(zhì)匹配系列混合標準工作溶液B：取天麻空白基質(zhì)樣品，按1.2.2方法處理。取樣品提取液6份，各1.0 mL，分別于40 ℃水浴中濃縮至約0.6 mL，分別加入24種農(nóng)藥混合標準儲備液5、10、20、50、100、150、200 μL，用乙腈稀釋至1.0 mL，渦旋，混勻。

1.6 定量方法

1.6.1 液相色譜-質(zhì)譜法

取處理好的樣品溶液和基質(zhì)匹配系列混合標準工作溶液A各1 mL，分別精密加入0.3 mL水，混勻，濾過，取續(xù)濾液進樣測定，記錄色譜圖，以色譜峰面積標準曲線法定量。

1.6.2 氣相色譜-質(zhì)譜法

取處理好的樣品溶液和基質(zhì)匹配系列混合標準工作溶液B各1 mL，分別精密加入0.3 mL磷酸三苯酯溶液作為內(nèi)標，混勻，濾過，取續(xù)濾液進樣測定，以標準曲線內(nèi)標法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1 液相色譜-質(zhì)譜法質(zhì)譜條件

分別選擇在ESI 正離子和負離子模式下2 種掃描方式，對29 種目標農(nóng)藥化合物進行一級質(zhì)譜掃描，獲得穩(wěn)定的母離子分子離子峰，然后對其進行二級掃描，獲得二級離子質(zhì)譜信息，篩選2個信號較強的離子碎片作為子離子，并在MRM 模式下分別優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)，選取響應強度高且基質(zhì)干擾小的兩對離子作為定量和定性離子，優(yōu)化結(jié)果見表2。

2.1.2 氣相色譜-質(zhì)譜法質(zhì)譜條件

對24種目標農(nóng)藥化合物進行掃描，選擇有代表性的母離子，選取特征離子作為子離子，建立多反應監(jiān)測模式，同時優(yōu)化定量、定性離子對的碰撞能量，優(yōu)化結(jié)果見表3?？瞻讟悠泛图訕藰悠飞V圖如圖1所示。

圖1 空白樣品及加標樣品氣相色譜圖

2.2 樣品處理方法優(yōu)化

2.2.1 基質(zhì)效應

以農(nóng)藥化合物在基質(zhì)匹配標準溶液中色譜峰面積與其溶劑標準溶液中的信號峰面積比值計算基質(zhì)效應，若比值大于120%，認為存在強基質(zhì)效應；若比值為80%～120%，則認為沒有基質(zhì)效應；若比值小于80%，則認為存在弱基質(zhì)效應。

分別采用乙腈直接提取法和基于QuEChERS原則的固相萃取法處理樣品，發(fā)現(xiàn)以乙腈直接提取法處理的樣品，采用LC-MS/MS 法測定時，只有約20%的目標物存在基質(zhì)效應，且基質(zhì)效應較小；而采用GC-MS/MS 法測定時，基質(zhì)效應較強，有近50%的目標物存在基質(zhì)效應，但基質(zhì)效應多數(shù)較弱。采用基于QuEChERS 原則的固相萃取法處理樣品，以LC-MS/MS法測定時，有約17%的目標物存在基質(zhì)效應，且基質(zhì)效應較?。灰訥C-MS/MS法測定時，有約39%的目標物存在基質(zhì)效應。綜合考慮，選擇采用乙腈直接提取法處理樣品用于LC-MS/MS 法測定，采用基于QuEChERS 原則的固相萃取法處理樣品用于GC-MS/MS法測定。

2.2.2 基于QuEChERS原則的固相萃取法

采用基于QuEChERS 原則的固相萃取法處理樣品，發(fā)現(xiàn)部分含磷、氯農(nóng)藥化合物(如三氯殺螨醇、治螟磷等)受天麻基質(zhì)影響，回收率較低，可能與根類藥材含水量低、樣品未充分溶脹有關(guān)，導致提取效率低。通過對樣品中水的加入量進行比較，考察加水量分別為5、10、15 mL時農(nóng)藥化合物的回收率，結(jié)果表明，在加入水的體積小于10 mL時，增加水的用量，會顯著提高含磷、氯農(nóng)藥化合物的回收率，當加入水的體積大于10 mL時，回收率不再明顯增加，因此選擇加水量為10 mL。

2.3 線性方程與檢出限

在1.4、1.5儀器工作條件下，分別測定基質(zhì)匹配系列混合標準工作溶液A、B，以各目標物的色譜峰面積對其質(zhì)量濃度進行線性回歸，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

取基質(zhì)匹配系列混合標準工作溶液A、B 的最低濃度點標準溶液，用乙腈逐級稀釋，測定并記錄色譜峰面積，以信噪比大于等于3 計算目標物在樣品中的質(zhì)量分數(shù)，作為方法檢出限，以信噪比大于等于10計算方法定量限。

53 種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限見表4。由表4可知，53種目標物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均不小于0.990，表明線性關(guān)系良好，方法檢出限為0.001～0.005 g/kg，定量限為0.002～0.01 mg/kg，滿足農(nóng)藥殘留的分析要求。

表4 53種農(nóng)藥質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.4 加標回收與精密度試驗

取空白基質(zhì)樣品，分別添加低、高兩個濃度水平的混合標準溶液，平行測定6次，以平均值作為測定值，用基質(zhì)匹配標準曲線法定量，結(jié)果見表5。由表5 可知，各目標物平均回收率為71.4%～118.2%，相對標準偏差為1.4%～6.3%(n=6)，表明方法的回收率和重現(xiàn)率良好，符合禁用農(nóng)藥殘留測定的要求，適用于天麻中53種農(nóng)藥殘留的同時測定。

表5 加標回收與精密度試驗結(jié)果(n=6)

3 結(jié)語

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定天麻中53 種禁用農(nóng)藥殘留的方法。采用乙腈直接提取和基于QuEChERS 原則的固相萃取法對樣品進行處理，以基質(zhì)匹配標準工作曲線法定量，能快速實現(xiàn)天麻中禁用農(nóng)藥化合物的含量分析。該方法具有較好的準確度和精密度，滿足復雜基質(zhì)中痕量農(nóng)藥分析要求，且簡單、快速、穩(wěn)定，可用于批量天麻樣品中禁用農(nóng)藥殘留的快速分析測定。