陳蓉,馬冬陽,顧曉風(fēng)
(蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心,江蘇蘇州 215104)
腸外營養(yǎng)制劑中、長鏈脂肪乳注射液是目前臨床最為常用的脂肪乳劑之一,廣泛應(yīng)用于直腸癌術(shù)后、大面積燒傷等疾病所致的吸收不良或無法進(jìn)食的重癥患者,有助于胃腸功能恢復(fù)及機(jī)體營養(yǎng)吸收,提高機(jī)體免疫力,減少炎性因子釋放,減輕炎癥反應(yīng)[1]。中、長鏈脂肪乳注射液為大豆油(LCT)和中鏈甘油三酸酯(MCT)按相等的質(zhì)量比混合,經(jīng)均質(zhì)、灌裝、滅菌制成的無菌注射用乳劑[2]。中/長鏈脂肪乳注射液的主要成分大豆油能阻斷網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),干擾T、β 淋巴細(xì)胞功能,阻礙其損害吞噬細(xì)胞;中鏈甘油三酸酯可直接進(jìn)入線粒體,有較快的氧化速率和血漿清除率,不易在體內(nèi)蓄積[3]。相比其它乳劑,中、長鏈脂肪乳中的營養(yǎng)配比更接近于人類脂肪酸比例[4]。
測量不確定度是表征被測量值的分散性與測量結(jié)果相關(guān)性的參數(shù)[5],是定量分析結(jié)果的重要組成部分,可用于評估定量檢測方法的可靠性和測量結(jié)果的可信度。測量結(jié)果的不確定度越小,其可靠性越高[6]。在藥品檢驗(yàn)過程中,當(dāng)測量結(jié)果出現(xiàn)臨界值或需要建立和確認(rèn)非標(biāo)準(zhǔn)方法時(shí),不確定度評定具有重要意義[7]。在考慮實(shí)驗(yàn)室檢測能力范圍及可接受風(fēng)險(xiǎn)程度的基礎(chǔ)上,應(yīng)適當(dāng)收窄測量不確定度的范圍,以避免可能出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)[8]。
目前有關(guān)中、長鏈脂肪乳注射液含量測定方法的文獻(xiàn)較少[9-11],且未見其不確定度評定的報(bào)道。為獲得準(zhǔn)確可靠的量化數(shù)據(jù),以確保中、長鏈脂肪乳注射液的有效性水平可靠,筆者根據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[12]、JJF 1135—2015《化學(xué)分析測量不確定度評定》[13]及CNAS GL 006—2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[14],并參考文獻(xiàn)[15-19],對氣相色譜法測定中、長鏈脂肪乳注射液中大豆油和中鏈甘油三酸酯含量的不確定度進(jìn)行評定。通過建立數(shù)學(xué)模型,系統(tǒng)分析了不確定度來源和影響因素,計(jì)算各不確定度分量,最終計(jì)算出測量結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度。該評定方法有助于檢驗(yàn)人員評定測量結(jié)果的可靠性,開展測量結(jié)果之間的比對,從而提高藥品的質(zhì)量控制水平和實(shí)驗(yàn)室風(fēng)險(xiǎn)控制水平,提高實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制能力,改進(jìn)質(zhì)量管理體系[20]。
氣相色譜儀:7890B 型,配Agilent Open Lab Acquisition 2.4工作站,美國安捷倫科技有限公司。
電子天平:Mettler-Toledo XS205DU型,感量為0.01 mg,瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。
電熱鼓風(fēng)干燥箱:BINDER OMS180型,美國賽默飛世爾科技有限公司。
超聲波清洗儀:SK5200HP型,上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司。
叔丁基甲醚:色譜純,批號為163704,美國賽默飛世爾科技公司。
無水硫酸鈉:分析純,批號為20171120,國藥集團(tuán)試劑有限公司。
氫氧化三甲基锍:分析純,批號為C11928934,美國麥克林公司。
LCT 對照品:批號為0003035312,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%,貝朗醫(yī)療(蘇州)有限公司。
MCT 對照品:批號為201207,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%,貝朗醫(yī)療(蘇州)有限公司。
α-維生素E:批號為LRAC1811,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%,美國西格瑪奧德里奇公司。
十一酸甲酯:批號為BCCD3600,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.9%,美國西格瑪奧德里奇公司。
中、長鏈脂肪乳注射液樣品:批號為2202187101,貝朗醫(yī)療(蘇州)有限公司。
色譜柱:Agilent HP-Innowax 石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm,美國安捷倫科技有限公司);柱溫:程序升溫,100 ℃恒溫5 min,再以15 ℃/min的速率升溫至205 ℃,維持18 min;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣,分流比為5∶1;檢測器:氫火焰離子化檢測器;檢測器溫度:275 ℃;載氣:高純氮?dú)?,流量? mL/min;進(jìn)樣體積:1 μL。
內(nèi)標(biāo)溶液:取十一酸甲酯約120 mg、α-維生素E約0.25 mL,置于100 mL容量瓶中,用叔丁基甲醚溶解并定容至標(biāo)線,搖勻。
混合對照品溶液:稱取LCT、MCT 對照品各40 mg,精密稱定,置于具塞試管中,精密加入內(nèi)標(biāo)溶液10 mL,搖勻;精密量取0.1 mL,置于進(jìn)樣瓶中,加入氫氧化三甲基锍0.05 mL、叔丁基甲醚0.5 mL,密封,搖勻,于70 ℃加熱45 min,放冷。取1 μL 注入氣相色譜儀中,記錄色譜圖,計(jì)算校正因子(F)。
樣品溶液:取中、長鏈脂肪乳注射液樣品約0.4 g,精密稱定,置于具塞試管中,精密加入內(nèi)標(biāo)溶液10 mL,超聲15 min,放冷;加入無水硫酸鈉1.5 g,搖勻,放置45 min;精密量取上清液0.1 mL,置于進(jìn)樣瓶中,加入氫氧化三甲基锍0.05 mL、叔丁基甲醚0.5 mL,密封,搖勻,于70 ℃加熱45 min,放冷。取1 μL注入氣相色譜儀。
取混合對照品溶液和樣品溶液各1 μL,按照1.2色譜條件進(jìn)樣測定,以色譜峰面積內(nèi)標(biāo)法定量。
按照式(1)~式(4)計(jì)算校正因子F及樣品中LCT、MCT含量:
式中:F1——LCT校正因子;
Ai——混合對照品溶液中內(nèi)標(biāo)十一酸甲酯的色譜峰面積;
m1——LCT對照品的質(zhì)量,g;
ws1——LCT 對照品的純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),ws1=99.5%;
A1——混合對照品溶液中LCT 色譜峰面積,為棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯與亞麻酸甲酯的色譜峰面積之和;
F2——MCT校正因子;
m2——MCT對照品的質(zhì)量,g;
ws2——MCT 對照品純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),ws2=99.9%;
A2——混合對照品溶液中MCT 的色譜峰面積,為辛酸甲酯與癸酸甲酯的色譜峰面積之和;
ρLCT——樣品溶液中LCT的質(zhì)量濃度,g/mL;
Ax1——樣品溶液中LCT 的色譜峰面積,為棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯與亞麻酸甲酯的色譜峰面積之和;
ρ——對照品溶液質(zhì)量濃度,g/mL;
Axi——樣品溶液中內(nèi)標(biāo)十一酸甲酯的色譜峰面積;
m——樣品質(zhì)量,g;
ρMCT——樣品溶液中MCT的質(zhì)量濃度,g/mL;
Ax2——樣品溶液中MCT 的色譜峰面積,為辛酸甲酯與癸酸甲酯的色譜峰面積之和。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)學(xué)模型,氣相色譜法測定中、長鏈脂肪乳注射液中LCT和MCT含量的不確定度分量包括:(1) LCT、MCT對照品純度引入的不確定度;(2) LCT、MCT對照品溶液配制過程(包括對照品稱量、溶液稀釋、衍生化反應(yīng))引入的不確定度;(3)樣品溶液配制過程(包括樣品稱量、溶液稀釋、衍生化反應(yīng))引入的不確定度;(4)重復(fù)測定引入的不確定度。
基于內(nèi)標(biāo)法的特點(diǎn),對照品和樣品溶液配制均直接以內(nèi)標(biāo)溶液作為溶劑,均與同量衍生化試劑在相同溫度下反應(yīng)相同時(shí)間,故與內(nèi)標(biāo)十一酸甲酯配制濃度、抗氧化劑α-維生素E用量、衍生化試劑氫氧化三甲基锍等均無關(guān),以上因素可不予評定。
根據(jù)企業(yè)提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書,LCT和MCT對照品的純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為99.5%、99.9%,暫無不確定度的相關(guān)信息,可假定其分散區(qū)間的半寬度為0.05%[21-22],則對照品純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[23]:
則對照品純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
3.2.1 對照品稱量引入的不確定度
根據(jù)電子天平檢定證書,所用天平最大允許誤差為±0.1 mg,為B 類測量不確定度[24],根據(jù)矩形分布,取k= 3,則由天平最大允許誤差引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度
LCT、MCT對照品稱樣質(zhì)量ms均為40 mg,因此由對照品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
3.2.2 對照品溶液稀釋引入的不確定度
對照品稀釋過程中僅使用了A級10 mL單標(biāo)線移液管1 次。根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器》規(guī)定,在20 ℃條件下,其最大允差為±0.020 mL[25],依據(jù)B 類評定規(guī)則,按矩形分布計(jì)算,取k= 3,則由10 mL單標(biāo)線移液管容量允差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度
在(20±5) ℃進(jìn)行溶液配制,叔丁基甲醚的體積膨脹系數(shù)為0.001 46 ℃-1[26],則體積變化為10×0.001 46×5=0.073 (mL),按照均勻分布考慮,取k= 3,則由溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
因此,10 mL 單標(biāo)線移液管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
3.2.3 對照品衍生化反應(yīng)溶液配制引入的不確定度
衍生化操作步驟分別使用了100、50、1 000 μL移液器。根據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[27]的規(guī)定,100 μL 移液器容量允許誤差為2.0%,按照均勻分布考慮,取k= 3,則由容量誤差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
參照3.2.2 評定溫度變化引入標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量:
由100 μL移液器引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
同法評定,得50 μL (允許誤差為3.0%)、1 000 μL (允許誤差為1.0%)移液器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V50)=0.346 446,urel(V1000)=0.007 149。
則由對照品衍生化反應(yīng)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
綜上所述,由對照品溶液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
3.3.1 樣品稱量引入的不確定度
樣品稱量操作與對照品一致,稱取質(zhì)量為0.4 g,參照3.2.1評定,得樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(mx)=0.000 144。
3.3.2 樣品溶液稀釋引入的不確定度
樣品稀釋過程與對照品一致,參照3.2.2 評定,得樣品溶液稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V10)=0.004 37。
3.3.3 樣品衍生化反應(yīng)溶液配制引入的不確定度
樣品衍生化過程與對照品一致,參照3.2.3 評定,得樣品衍生化反應(yīng)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vx,R)=urel(Vs,R)=0.365 306。
綜上所述,由樣品溶液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
按1.3 方法平行制備3 份樣品溶液,依次檢測,用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算LCT、MCT的含量,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示,結(jié)果見表1。
表1 樣品測定結(jié)果
取k= 3,則由樣品重復(fù)測定引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總見表2。
表2 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總
以上4 個不確定度分量彼此獨(dú)立不相關(guān),合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(5)計(jì)算:
將表2 數(shù)據(jù)帶入式(5),計(jì)算得大豆油和中鏈甘油三酸酯的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
測量結(jié)果符合正態(tài)分布,當(dāng)包含概率為95%時(shí),取擴(kuò)展因子k=2,則擴(kuò)展不確定度:
氣相色譜法測定中/長鏈脂肪乳注射液中LCT和MCT 含量結(jié)果表示為wLCT=(9.63±0.10)%,k=2;wMCT=(10.00±0.11)%,k=2。
采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定中、長鏈脂肪乳注射液中MCT 和LCT 的含量,并對測量結(jié)果進(jìn)行不確定度評定,得出MCT 和LCT 測定結(jié)果的擴(kuò)展不確定度分別為ULCT=0.10%,UMCT=0.11%。由評定結(jié)果可知,由對照品溶液和樣品溶液配制過程引入的不確定度分量對最終結(jié)果的不確定度貢獻(xiàn)最大,兩個分量貢獻(xiàn)值之和在兩個組分中均高達(dá)99.8%,而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度和樣品重復(fù)測定引入的不確定度分量影響甚微。對照品和樣品溶液制備中主要涉及到稱量過程使用的電子天平、稀釋過程使用的移液管、衍生化過程使用的移液器引入的不確定度,其中衍生化反應(yīng)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度(0.365 277)要遠(yuǎn)大于稀釋過程(0.004 37)和稱量過程(對照品0.001 443,樣品0.000 144),表明移液器對測定結(jié)果的影響大于移液管和電子天平,因此,在實(shí)際測定過程中,應(yīng)當(dāng)盡可能保證移液器的準(zhǔn)確性,按要求進(jìn)行檢定。同時(shí)關(guān)注精密量器如電子天平、小容量玻璃儀器的定期計(jì)量、期間核查、性能確認(rèn)等。還需要確保實(shí)驗(yàn)室環(huán)境狀態(tài)良好,規(guī)范實(shí)驗(yàn)人員操作,盡量減小隨機(jī)誤差,使稱量不確定度值盡可能降低。