陳蓉，馬冬陽，顧曉風(fēng)

（蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心，江蘇蘇州 215104）

腸外營養(yǎng)制劑中、長鏈脂肪乳注射液是目前臨床最為常用的脂肪乳劑之一，廣泛應(yīng)用于直腸癌術(shù)后、大面積燒傷等疾病所致的吸收不良或無法進(jìn)食的重癥患者，有助于胃腸功能恢復(fù)及機(jī)體營養(yǎng)吸收，提高機(jī)體免疫力，減少炎性因子釋放，減輕炎癥反應(yīng)[1]。中、長鏈脂肪乳注射液為大豆油(LCT)和中鏈甘油三酸酯(MCT)按相等的質(zhì)量比混合，經(jīng)均質(zhì)、灌裝、滅菌制成的無菌注射用乳劑[2]。中/長鏈脂肪乳注射液的主要成分大豆油能阻斷網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，干擾T、β 淋巴細(xì)胞功能，阻礙其損害吞噬細(xì)胞；中鏈甘油三酸酯可直接進(jìn)入線粒體，有較快的氧化速率和血漿清除率，不易在體內(nèi)蓄積[3]。相比其它乳劑，中、長鏈脂肪乳中的營養(yǎng)配比更接近于人類脂肪酸比例[4]。

測量不確定度是表征被測量值的分散性與測量結(jié)果相關(guān)性的參數(shù)[5]，是定量分析結(jié)果的重要組成部分，可用于評估定量檢測方法的可靠性和測量結(jié)果的可信度。測量結(jié)果的不確定度越小，其可靠性越高[6]。在藥品檢驗(yàn)過程中，當(dāng)測量結(jié)果出現(xiàn)臨界值或需要建立和確認(rèn)非標(biāo)準(zhǔn)方法時(shí)，不確定度評定具有重要意義[7]。在考慮實(shí)驗(yàn)室檢測能力范圍及可接受風(fēng)險(xiǎn)程度的基礎(chǔ)上，應(yīng)適當(dāng)收窄測量不確定度的范圍，以避免可能出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)[8]。

目前有關(guān)中、長鏈脂肪乳注射液含量測定方法的文獻(xiàn)較少[9-11]，且未見其不確定度評定的報(bào)道。為獲得準(zhǔn)確可靠的量化數(shù)據(jù)，以確保中、長鏈脂肪乳注射液的有效性水平可靠，筆者根據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[12]、JJF 1135—2015《化學(xué)分析測量不確定度評定》[13]及CNAS GL 006—2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[14]，并參考文獻(xiàn)[15-19]，對氣相色譜法測定中、長鏈脂肪乳注射液中大豆油和中鏈甘油三酸酯含量的不確定度進(jìn)行評定。通過建立數(shù)學(xué)模型，系統(tǒng)分析了不確定度來源和影響因素，計(jì)算各不確定度分量，最終計(jì)算出測量結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度。該評定方法有助于檢驗(yàn)人員評定測量結(jié)果的可靠性，開展測量結(jié)果之間的比對，從而提高藥品的質(zhì)量控制水平和實(shí)驗(yàn)室風(fēng)險(xiǎn)控制水平，提高實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制能力，改進(jìn)質(zhì)量管理體系[20]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：7890B 型，配Agilent Open Lab Acquisition 2.4工作站，美國安捷倫科技有限公司。

電子天平：Mettler-Toledo XS205DU型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

電熱鼓風(fēng)干燥箱：BINDER OMS180型，美國賽默飛世爾科技有限公司。

超聲波清洗儀：SK5200HP型，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

叔丁基甲醚：色譜純，批號為163704，美國賽默飛世爾科技公司。

無水硫酸鈉：分析純，批號為20171120，國藥集團(tuán)試劑有限公司。

氫氧化三甲基锍：分析純，批號為C11928934，美國麥克林公司。

LCT 對照品：批號為0003035312，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%，貝朗醫(yī)療(蘇州)有限公司。

MCT 對照品：批號為201207，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%，貝朗醫(yī)療(蘇州)有限公司。

α-維生素E：批號為LRAC1811，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%，美國西格瑪奧德里奇公司。

十一酸甲酯：批號為BCCD3600，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.9%，美國西格瑪奧德里奇公司。

中、長鏈脂肪乳注射液樣品：批號為2202187101，貝朗醫(yī)療(蘇州)有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent HP-Innowax 石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：程序升溫，100 ℃恒溫5 min，再以15 ℃/min的速率升溫至205 ℃，維持18 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比為5∶1；檢測器：氫火焰離子化檢測器；檢測器溫度：275 ℃；載氣：高純氮?dú)?，流量? mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL。

1.3 溶液制備

內(nèi)標(biāo)溶液：取十一酸甲酯約120 mg、α-維生素E約0.25 mL，置于100 mL容量瓶中，用叔丁基甲醚溶解并定容至標(biāo)線，搖勻。

混合對照品溶液：稱取LCT、MCT 對照品各40 mg，精密稱定，置于具塞試管中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液10 mL，搖勻；精密量取0.1 mL，置于進(jìn)樣瓶中，加入氫氧化三甲基锍0.05 mL、叔丁基甲醚0.5 mL，密封，搖勻，于70 ℃加熱45 min，放冷。取1 μL 注入氣相色譜儀中，記錄色譜圖，計(jì)算校正因子(F)。

樣品溶液：取中、長鏈脂肪乳注射液樣品約0.4 g，精密稱定，置于具塞試管中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液10 mL，超聲15 min，放冷；加入無水硫酸鈉1.5 g，搖勻，放置45 min；精密量取上清液0.1 mL，置于進(jìn)樣瓶中，加入氫氧化三甲基锍0.05 mL、叔丁基甲醚0.5 mL，密封，搖勻，于70 ℃加熱45 min，放冷。取1 μL注入氣相色譜儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取混合對照品溶液和樣品溶液各1 μL，按照1.2色譜條件進(jìn)樣測定，以色譜峰面積內(nèi)標(biāo)法定量。

1.5 數(shù)學(xué)模型

按照式(1)～式(4)計(jì)算校正因子F及樣品中LCT、MCT含量：

式中：F1——LCT校正因子；

Ai——混合對照品溶液中內(nèi)標(biāo)十一酸甲酯的色譜峰面積；

m1——LCT對照品的質(zhì)量，g；

ws1——LCT 對照品的純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，ws1=99.5%；

A1——混合對照品溶液中LCT 色譜峰面積，為棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯與亞麻酸甲酯的色譜峰面積之和；

F2——MCT校正因子；

m2——MCT對照品的質(zhì)量，g；

ws2——MCT 對照品純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，ws2=99.9%；

A2——混合對照品溶液中MCT 的色譜峰面積，為辛酸甲酯與癸酸甲酯的色譜峰面積之和；

ρLCT——樣品溶液中LCT的質(zhì)量濃度，g/mL；

Ax1——樣品溶液中LCT 的色譜峰面積，為棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯與亞麻酸甲酯的色譜峰面積之和；

ρ——對照品溶液質(zhì)量濃度，g/mL；

Axi——樣品溶液中內(nèi)標(biāo)十一酸甲酯的色譜峰面積；

m——樣品質(zhì)量，g；

ρMCT——樣品溶液中MCT的質(zhì)量濃度，g/mL；

Ax2——樣品溶液中MCT 的色譜峰面積，為辛酸甲酯與癸酸甲酯的色譜峰面積之和。

2 不確定度分量

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)學(xué)模型，氣相色譜法測定中、長鏈脂肪乳注射液中LCT和MCT含量的不確定度分量包括：(1) LCT、MCT對照品純度引入的不確定度；(2) LCT、MCT對照品溶液配制過程(包括對照品稱量、溶液稀釋、衍生化反應(yīng))引入的不確定度；(3)樣品溶液配制過程(包括樣品稱量、溶液稀釋、衍生化反應(yīng))引入的不確定度；(4)重復(fù)測定引入的不確定度。

基于內(nèi)標(biāo)法的特點(diǎn)，對照品和樣品溶液配制均直接以內(nèi)標(biāo)溶液作為溶劑，均與同量衍生化試劑在相同溫度下反應(yīng)相同時(shí)間，故與內(nèi)標(biāo)十一酸甲酯配制濃度、抗氧化劑α-維生素E用量、衍生化試劑氫氧化三甲基锍等均無關(guān)，以上因素可不予評定。

3 不確定度的評定

3.1 對照品純度引入的不確定度

根據(jù)企業(yè)提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，LCT和MCT對照品的純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為99.5%、99.9%，暫無不確定度的相關(guān)信息，可假定其分散區(qū)間的半寬度為0.05%[21-22]，則對照品純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[23]：

則對照品純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2 對照品溶液配制過程引入的不確定度

3.2.1 對照品稱量引入的不確定度

根據(jù)電子天平檢定證書，所用天平最大允許誤差為±0.1 mg，為B 類測量不確定度[24]，根據(jù)矩形分布，取k= 3，則由天平最大允許誤差引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

LCT、MCT對照品稱樣質(zhì)量ms均為40 mg，因此由對照品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.2 對照品溶液稀釋引入的不確定度

對照品稀釋過程中僅使用了A級10 mL單標(biāo)線移液管1 次。根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器》規(guī)定，在20 ℃條件下，其最大允差為±0.020 mL[25]，依據(jù)B 類評定規(guī)則，按矩形分布計(jì)算，取k= 3，則由10 mL單標(biāo)線移液管容量允差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

在(20±5) ℃進(jìn)行溶液配制，叔丁基甲醚的體積膨脹系數(shù)為0.001 46 ℃-1[26]，則體積變化為10×0.001 46×5=0.073 (mL)，按照均勻分布考慮，取k= 3，則由溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

因此，10 mL 單標(biāo)線移液管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.3 對照品衍生化反應(yīng)溶液配制引入的不確定度

衍生化操作步驟分別使用了100、50、1 000 μL移液器。根據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[27]的規(guī)定，100 μL 移液器容量允許誤差為2.0%，按照均勻分布考慮，取k= 3，則由容量誤差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

參照3.2.2 評定溫度變化引入標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量：

由100 μL移液器引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

同法評定，得50 μL (允許誤差為3.0%)、1 000 μL (允許誤差為1.0%)移液器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V50)=0.346 446，urel(V1000)=0.007 149。

則由對照品衍生化反應(yīng)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

綜上所述，由對照品溶液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.3 樣品溶液配制過程引入的不確定度

3.3.1 樣品稱量引入的不確定度

樣品稱量操作與對照品一致，稱取質(zhì)量為0.4 g，參照3.2.1評定，得樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(mx)=0.000 144。

3.3.2 樣品溶液稀釋引入的不確定度

樣品稀釋過程與對照品一致，參照3.2.2 評定，得樣品溶液稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V10)=0.004 37。

3.3.3 樣品衍生化反應(yīng)溶液配制引入的不確定度

樣品衍生化過程與對照品一致，參照3.2.3 評定，得樣品衍生化反應(yīng)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vx，R)=urel(Vs，R)=0.365 306。

綜上所述，由樣品溶液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.4 重復(fù)測定引入的不確定度

按1.3 方法平行制備3 份樣品溶液，依次檢測，用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算LCT、MCT的含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，結(jié)果見表1。

表1 樣品測定結(jié)果

取k= 3，則由樣品重復(fù)測定引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.5 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度

各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總見表2。

表2 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總

以上4 個不確定度分量彼此獨(dú)立不相關(guān)，合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(5)計(jì)算：

將表2 數(shù)據(jù)帶入式(5)，計(jì)算得大豆油和中鏈甘油三酸酯的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

測量結(jié)果符合正態(tài)分布，當(dāng)包含概率為95%時(shí)，取擴(kuò)展因子k=2，則擴(kuò)展不確定度：

3.6 測定結(jié)果表示

氣相色譜法測定中/長鏈脂肪乳注射液中LCT和MCT 含量結(jié)果表示為wLCT=(9.63±0.10)%，k=2；wMCT=(10.00±0.11)%，k=2。

4 結(jié)語

采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定中、長鏈脂肪乳注射液中MCT 和LCT 的含量，并對測量結(jié)果進(jìn)行不確定度評定，得出MCT 和LCT 測定結(jié)果的擴(kuò)展不確定度分別為ULCT=0.10%，UMCT=0.11%。由評定結(jié)果可知，由對照品溶液和樣品溶液配制過程引入的不確定度分量對最終結(jié)果的不確定度貢獻(xiàn)最大，兩個分量貢獻(xiàn)值之和在兩個組分中均高達(dá)99.8%，而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度和樣品重復(fù)測定引入的不確定度分量影響甚微。對照品和樣品溶液制備中主要涉及到稱量過程使用的電子天平、稀釋過程使用的移液管、衍生化過程使用的移液器引入的不確定度，其中衍生化反應(yīng)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度(0.365 277)要遠(yuǎn)大于稀釋過程(0.004 37)和稱量過程(對照品0.001 443，樣品0.000 144)，表明移液器對測定結(jié)果的影響大于移液管和電子天平，因此，在實(shí)際測定過程中，應(yīng)當(dāng)盡可能保證移液器的準(zhǔn)確性，按要求進(jìn)行檢定。同時(shí)關(guān)注精密量器如電子天平、小容量玻璃儀器的定期計(jì)量、期間核查、性能確認(rèn)等。還需要確保實(shí)驗(yàn)室環(huán)境狀態(tài)良好，規(guī)范實(shí)驗(yàn)人員操作，盡量減小隨機(jī)誤差，使稱量不確定度值盡可能降低。