黃冠又　葛學(xué)成　甘鴻川　郝淑煜　吳震

摘要：目的 探討趨化因子配體18（CCL18）在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）中的表達(dá)與GBM臨床預(yù)后的關(guān)系以及對(duì)U87MG細(xì)胞增殖和遷移的影響。方法 基于癌癥基因組圖譜（TCGA）和基因型-組織表達(dá)（GTEx）數(shù)據(jù)庫(kù)中GBM和正常腦組織數(shù)據(jù)，分析CCL18在GBM與正常腦組織中的表達(dá)差異，采用免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析、單因素和多因素Cox回歸分析評(píng)估CCL18對(duì)GBM患者預(yù)后的影響?；诙嘁蛩谻ox回歸模型構(gòu)建生存列線圖，繪制校準(zhǔn)曲線和受試者工作特征（ROC）曲線進(jìn)行驗(yàn)證。將人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞分為siRNA-CCL18組、siRNA-NC組和Mock-siRNA組，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測(cè)細(xì)胞中CCL18 mRNA表達(dá)，CCK-8法和細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U87MG細(xì)胞的增殖和遷移能力。結(jié)果 TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，GBM組織中CCL18基因表達(dá)水平高于正常腦組織；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，GBM組CCL18陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組（P＜0.05）。CCL18高表達(dá)組患者預(yù)后較低表達(dá)組差（P＜0.01）。Cox回歸分析結(jié)果顯示，IDH野生型和CCL18高表達(dá)是GBM患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。校準(zhǔn)曲線顯示列線圖預(yù)測(cè)模型與實(shí)際生存有較好一致性，ROC曲線表明該模型對(duì)GBM患者生存概率有較好預(yù)測(cè)能力。siRNA-CCL18組CCL18 mRNA表達(dá)水平、細(xì)胞增殖（48 h、72 h和96 h）和遷移能力（24 h）均低于siRNA-NC組和Mock-siRNA組（P＜0.05）。結(jié)論 CCL18在GBM中表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)GBM腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，且可導(dǎo)致患者預(yù)后不良。

關(guān)鍵詞：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；趨化因子CCL18；細(xì)胞增殖；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；預(yù)后

中圖分類號(hào)：R739.41文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20221791

Expression of CCL18 in glioblastoma and its effect on proliferation and migration of

human U87MG cells

HUANG Guanyou GE Xuecheng GAN Hongchuan HAO Shuyu WU Zhen

1 Department of Neurosurgery， the Second Peoples Hospital of Guiyang， Guiyang 550081， China; 2 Department of Neurosurgery， Beijing Tiantan Hospital， Capital Medical University

Corresponding Author E-mail： wuzhen1966@aliyun.com

Abstract： Objective To analyze the expression chemokine （C-C motif） ligand 18 （CCL18） on the clinical prognosis of glioblastoma （GBM） and its effects on the proliferation and migration of U87MG cells. Methods The differential expression of CCL18 gene in GBM and normal brain tissue was analyzed based on the GBM data from Cancer Genome Atlas （TGGA） database and the normal brain tissue data from Genotype-Tissue Expression （GTEx） database. Immunohistochemical staining was used to verification. Kaplan-Meier survival analysis， univariate and multivariable Cox regression analysis were used to evaluate the impact of CCL18 expression on the prognosis in GBM patients. A nomogram was established based on the results of multivariate Cox analysis. The calibration curve and receiver-operating characteristic （ROC） curve were draw for validation. Human glioblastoma U87MG cells were divided into the siRNA-CCL18 group， the siRNA-NC group and the Mock-siRNA group. qPCR was used to detect the content of CCL18 mRNA in the different U87MG cell groups. The CCK-8 assay and cell scratch test were used to detect the cell proliferation and migration ability of U87MG cells in each group. Results CCL18 was significantly upregulated in GBM tissue （P＜0.05）. The immunohistochemistry results suggested that CCL18 protein was significantly increased in GBM tissue （P＜0.05）. Survival analysis indicated that high expression of CCL18 was associated with poor prognosis in GBM patients （P＜0.05）. Multivariate Cox regression analysis revealed that IDH wild-type and high level of CCL18 expression were the two major risk factors affecting the poor prognosis of GBM （P＜0.05）. The calibration curve showed that the actual survival rate of patients was consistent with the predicted survival rate. The ROC curve demonstrated that the model had a good predictive for predicting the survival of GBM patients. siRNA reduced the expression of CCL18 in human U87MG cells. The results of CCK-8 assay showed that the proliferation of U87MG cells was significantly inhibited （P＜0.05）， and the wound healing scratch ability of U87MG cells with low expression of CCL18 decreased （P＜0.01）. Conclusion CCL18 is over-expressed in GBM tissue， and high CCL18 expression is associated with poor prognosis in GBM patients．CCL18 promotes GBM cell proliferation and migration and may act as a relevant predictive biomarker for GBM.

Key words： glioblastoma; chemokine CCL18; cell proliferation; cell movement; prognosis

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是成人最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腦腫瘤，其惡性程度和復(fù)發(fā)率較高，患者生存期短［1］。傳統(tǒng)的手術(shù)切除結(jié)合術(shù)后同步放化療及替莫唑胺輔助化療方案對(duì)改善GBM患者預(yù)后效果不佳，其中位生存期僅15個(gè)月［2］。有研究表明，GBM進(jìn)展迅速，且異質(zhì)性顯著［3］，趨化因子與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4］。GBM的腫瘤微環(huán)境中有大量的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，能進(jìn)一步增強(qiáng)GBM的侵襲性以及促進(jìn)抑制性免疫微環(huán)境的形成［5］。C-C趨化因子配體18（chemokine CC-motif ligand 18，CCL18）是趨化因子配體家族成員之一，主要由腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）和自我更新能力，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［6］。研究表明，CCL18在乳腺癌［6］、肺癌［7］、口腔鱗癌［8］等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，但關(guān)于CCL18在GBM中表達(dá)及其對(duì)GBM細(xì)胞增殖和侵襲的影響尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)分析CCL18在GBM中的表達(dá)及其對(duì)U87MG細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)資料和分組 利用UCSC XENA（https：//xenabrowser.net/datapages/）從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)和基因型-組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（The Genotype-Tissue Expression，GTEx）中提取有關(guān)GBM的基因表達(dá)譜（RNA-Seq）數(shù)據(jù)。經(jīng)Toil流程［9］標(biāo)準(zhǔn)化處理后分別得到168例GBM患者的RNA-Seq數(shù)據(jù)和臨床資料以及1 157例正常腦組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)。GBM患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理學(xué)診斷為GBM；（2）具有CCL18基因數(shù)據(jù)的樣本。排除臨床資料不全者。

患者臨床信息資料，包括性別、年齡、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）狀態(tài)、Karnofsky功能狀態(tài)評(píng)分（Karnofsky performance scale，KPS）［10］等。總生存期（overal survival，OS）指從患者病理確診之日起至患者死亡或末次隨訪的生存時(shí)間；無(wú)進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）是指患者接受治療開(kāi)始到出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或死亡的時(shí)間。

1.2 臨床標(biāo)本資料 選擇2020年1月—2021年8月于貴陽(yáng)市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科行手術(shù)治療的GBM患者（GBM組）45例，其中男25例，女20例，年齡29～79歲，平均年齡（56.06±10.05）歲；另選擇2021年1—5月同科收治的重型顱腦損傷患者15例為對(duì)照組，其中男9例，女6例，年齡30～76歲，平均年齡（53.43±9.35）歲；2組患者性別（χ²=0.090）和年齡（t=0.974）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。GBM組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）有完整的臨床病史記錄、影像學(xué)及圍手術(shù)期資料。（2）行常規(guī)開(kāi)顱顯微手術(shù)切除腫瘤，腫瘤切除程度有明確的手術(shù)記錄。（3）根據(jù)WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤第五版分類標(biāo)準(zhǔn)［11］診斷為GBM，并經(jīng)術(shù)后病理確診。（4）術(shù)前均未接受過(guò)放化療和靶向治療。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2021倫審第53號(hào)），獲患者或法定代理人知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.3 材料、試劑和儀器 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U87MG購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；兔抗人CCL18單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，免疫組化試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、胰酶、乙二胺四乙酸購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；RNA提取試劑盒、SYBR Green熒光定量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、CCK-8試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；riboFECTTM CP轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；CCL18小干擾RNA（CCL18-siRNA）、陰性對(duì)照RNA由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。紫外分光光度計(jì)、CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；酶標(biāo)分析儀（ELx808）購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；qPCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；倒置熒光顯微鏡（CKX41）購(gòu)自日本奧林巴斯公司；臺(tái)式低速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司。

1.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CCL18在GBM中的表達(dá) 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本于腫瘤處取材，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)二甲苯、無(wú)水乙醇脫蠟，PBS沖洗3次，切片置于檸檬酸修復(fù)液（pH=6.0）中修復(fù)，3%H2O2封閉20 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS清洗玻片3次，每次5 min。加入CCL18抗體（1∶200稀釋）4 ℃孵育過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG二抗（1∶500稀釋），室溫孵育1 h，DAB顯色3 min，蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木素復(fù)染1 min，流水反藍(lán)10 min，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下拍照。結(jié)果判定：陽(yáng)性染色以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿中出現(xiàn)褐色或棕黃色顆粒為準(zhǔn)，400倍鏡下隨機(jī)讀取3個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。染色程度評(píng)分由弱到強(qiáng)分為陰性（0分）、弱陽(yáng)性（1分）、陽(yáng)性（2分）和強(qiáng)陽(yáng)性（3分），染色范圍評(píng)分為0（0分）、1%～25%（1分）、26%～50%（2分）、51%～75%（3分）和76%～100%（4分），染色程度評(píng)分和染色范圍評(píng)分兩者相加得到CCL18表達(dá)評(píng)分。CCL18表達(dá)評(píng)分0～5分為低表達(dá)，5分以上為高表達(dá)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染 U87MG細(xì)胞從液氮中取出，于37 ℃水浴中快速解凍，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層細(xì)胞，接種至24孔板，接種密度為1×105個(gè)/mL，加入胰酶消化細(xì)胞和傳代培養(yǎng)，收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞正常生長(zhǎng)且匯合度達(dá)60%～70%即進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)說(shuō)明書(shū)配制轉(zhuǎn)染混合液，將配制好的riboFECTTM CP混合液加入465.75 μL無(wú)雙抗完全培養(yǎng)基（v1）中，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～96 h。實(shí)驗(yàn)分為Mock-siRNA組（U87MG細(xì)胞轉(zhuǎn)染Mock-siRNA，Mock序列為無(wú)義序列）、siRNA-NC組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染CCL18 siRNA control）、siRNA-CCL18組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染CCL18 siRNA），各組siRNA序列見(jiàn)表1。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)CCL18 mRNA表達(dá) 根據(jù)Trizol法提取各組U87MG細(xì)胞的總RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度。參照說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qPCR。qPCR反應(yīng)體系為25 μL：qPCR SYBR? Green Master Mix 12.5 μL，上下游引物（0.2 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O調(diào)整至25 μL。qPCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)采集熒光強(qiáng)度，根據(jù)熔解曲線讀取參數(shù)。以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表2。采用2-ΔΔCt法計(jì)算CCL18 mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，棄上清液，PBS清洗，加入胰酶進(jìn)行消化，離心（800 r/min，5 min）；制成細(xì)胞懸液，調(diào)整為5×104個(gè)/mL。取96孔板，以100 μL/孔加入細(xì)胞懸液（即5 000個(gè)細(xì)胞/孔），每組不少于5個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，取96孔板，更換新鮮培養(yǎng)基，按照實(shí)驗(yàn)分組將配制好的轉(zhuǎn)染混合液加入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)24、48、72、96 h后，加入10 μL CCK-8工作液孵育1～2 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.8 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于6孔板。37 ℃恒溫孵育過(guò)夜。細(xì)胞匯合度達(dá)100%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，使用20 μL的移液槍頭對(duì)準(zhǔn)標(biāo)尺劃痕，均勻用力保證劃痕寬度一致。用無(wú)菌PBS洗細(xì)胞3次，沖洗不貼壁的細(xì)胞碎屑，加入無(wú)血清培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)0、6、12、24 h，相差顯微鏡下測(cè)量細(xì)胞遷移的相對(duì)距離并拍照。采用Image J軟件分析細(xì)胞遷移率。遷移率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0軟件、R語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)軟件（v 3.6.3）及Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ²檢驗(yàn)或連續(xù)校正χ²檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P₂₅，P₇₅）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。應(yīng)用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)比較不同CCL18表達(dá)組患者的生存情況。采用單因素Cox回歸分析影響患者生存的因素，選擇單因素分析結(jié)果有意義者進(jìn)行多因素Cox回歸分析?；诙嘁蛩胤治鼋Y(jié)果，通過(guò)R軟件rms程序包構(gòu)建1年、2年和3年生存時(shí)間的預(yù)測(cè)模型，計(jì)算模型一致性指數(shù)（C-index），C-index＞0.6，則預(yù)測(cè)性能良好；并繪制校準(zhǔn)曲線和受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)估模型的預(yù)測(cè)效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCL18在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá) TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，GBM組CCL18基因表達(dá)水平高于對(duì)照組（Z=18.619，P＜0.01），見(jiàn)圖1A。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，GBM組CCL18陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組［62.2%（28/45）vs. 6.7%（1/15），χ²=8.789，P＜0.05］，見(jiàn)圖1B—D。

2.2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中CCL18表達(dá)與GBM患者預(yù)后的關(guān)系 以CCL18相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)（0.63）為界，將TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)168例GBM患者均分為CCL18高表達(dá)組和低表達(dá)組。Kaplan-Meier生存分析顯示，CCL18高、低表達(dá)組患者的中位OS分別為12.2個(gè)月、16.0個(gè)月，中位PFS分別為4.83個(gè)月、8.61個(gè)月，高表達(dá)組患者OS、PFS均較低表達(dá)組短（Log-rank χ²分別為7.310、14.611，P＜0.01），見(jiàn)圖2。以患者是否死亡（是=1，否=0）為因變量，以年齡（＞60歲=1，≤60歲=0）、性別（男=1，女=0）、KPS評(píng)分（≥80分=1，＜80分=0）、IDH狀態(tài)（突變型=1，野生型=0）、CCL18表達(dá)（高表達(dá)=1，低表達(dá)=0）為自變量，單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，IDH狀態(tài)和CCL18表達(dá)是GBM患者預(yù)后的影響因素，見(jiàn)表3。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，IDH野生型和CCL18高表達(dá)是GBM患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表4。

2.3 列線圖模型建立和驗(yàn)證 基于多因素Cox回歸分析得出2個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，構(gòu)建影響患者生存預(yù)后的列線圖預(yù)測(cè)模型，見(jiàn)圖3。采用Bootstrap法對(duì)列線圖進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，該模型C-index為0.793（95%CI：0.777～0.803）。Calibration校準(zhǔn)曲線顯示列線圖預(yù)測(cè)GBM患者1年、2年和3年生存概率與實(shí)際觀測(cè)結(jié)果具有較好一致性；列線圖預(yù)測(cè)GBM患者1年、2年和3年生存概率的ROC曲線下面積（AUC）均大于0.6，見(jiàn)圖4、表5。

2.4 CCL18-siRNA抑制U87MG細(xì)胞中CCL18基因表達(dá) siRNA-CCL18組CCL18 mRNA表達(dá)水平（0.10±0.04）低于siRNA-NC組（0.60±0.18）和Mock-siRNA組（1.02±0.26），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.360，P＜0.01）。

2.5 抑制CCL18表達(dá)對(duì)U87MG細(xì)胞增殖和遷移能力的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA-CCL18組48 h、72 h和96 h的細(xì)胞增殖能力均低于siRNA-NC組和Mock-siRNA組（P＜0.05），見(jiàn)圖5。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)顯示，siRNA-CCL18組24 h時(shí)的細(xì)胞遷移能力低于siRNA-NC組和Mock-siRNA組（P＜0.05），12 h時(shí)的細(xì)胞遷移能力與siRNA-NC組和Mock-siRNA組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖6、表6。

3 討論

趨化因子是腫瘤微環(huán)境中的重要調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)各種機(jī)制影響惡性腫瘤的細(xì)胞增殖，或間接調(diào)節(jié)血管生成和免疫細(xì)胞募集，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［12］。CCL18是趨化因子的重要組成部分，與腫瘤侵襲、遷移和EMT等惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切，在腫瘤進(jìn)展中起重要作用［13］。Zeng等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，CCL18可通過(guò)PITPNM3激活核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加白細(xì)胞介素（IL）-6和IL-8產(chǎn)生，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞富集和介導(dǎo)化療耐藥，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。另有研究表明，CCL18在膀胱癌中呈高表達(dá)，其可通過(guò)激活G蛋白偶聯(lián)受體CCR8在腫瘤的依賴性遷移和EMT中發(fā)揮重要作用［15］。另有研究者對(duì)胸腺瘤免疫相關(guān)microRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CCL18與miR-425-5p、miR-1370-3p表達(dá)呈正相關(guān)，且可與CD8、CD68協(xié)同作用影響患者預(yù)后［16］。

本研究采用生物信息學(xué)分析顯示，GBM組織中CCL18 mRNA水平高于正常腦組織，免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)GBM組織中CCL18表達(dá)水平高于正常腦組織，提示CCL18在GBM中發(fā)揮促癌作用。Gao等［17］研究結(jié)果表明，CCL18表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān)，其可作為判斷GBM預(yù)后及惡性生物學(xué)行為的標(biāo)志物。本研究通過(guò)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，CCL18高表達(dá)組患者預(yù)后較低表達(dá)組差；基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，IDH野生型和CCL18高表達(dá)是GBM患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有研究證實(shí)，缺氧可上調(diào)GBM腫瘤微環(huán)境中PITPNM3受體及CCL18表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移［18］。GBM微環(huán)境中，腫瘤組織廣泛缺氧，容易導(dǎo)致化療耐藥，筆者推測(cè)缺氧可能是引起CCL18表達(dá)升高，導(dǎo)致GBM患者預(yù)后較差的原因之一。

本研究根據(jù)篩選出IDH突變狀態(tài)和CCL18表達(dá)2個(gè)獨(dú)立影響因素，構(gòu)建GBM患者生存預(yù)后的列線圖模型，結(jié)果顯示C-index為0.793（95%CI：0.777～0.803），校準(zhǔn)曲線的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值基本一致，列線圖模型的時(shí)間依賴ROC曲線AUC值均大于0.6，表明構(gòu)建的列線圖具有較好的區(qū)分度和精準(zhǔn)度，進(jìn)一步表明CCL18是GBM患者預(yù)后的重要影響因素，且其可能為GBM的危險(xiǎn)因子之一。

另外，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞系CCL18的表達(dá)能降低GBM細(xì)胞的增殖和遷移能力，與Ma等［19］研究結(jié)果類似。膠質(zhì)瘤相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞釋放的CCL18在GBM進(jìn)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用，通過(guò)上調(diào)CCL18表達(dá)，能激活腫瘤細(xì)胞的CCR8受體，介導(dǎo)酸性磷酸酶5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)GBM細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲［20］。以上結(jié)果進(jìn)一步表明CCL18可調(diào)節(jié)GBM細(xì)胞的侵襲及增殖，在GBM進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

綜上，CCL18在GBM中表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)GBM腫瘤細(xì)胞增殖和遷移；CCL18高表達(dá)和IDH野生型是GBM患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究為GBM的靶向治療提供了新方向。但也存在一些局限性，如生物信息學(xué)分析不夠深入，納入影響因素和臨床樣本有限，且未明確CCL18在GBM發(fā)生發(fā)展過(guò)程的具體作用機(jī)制，有待今后深入探討。

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（2022-11-07收稿 2023-04-21修回）

（本文編輯 陳麗潔）