歐陽秋麗，吳垚焱冰，劉洋梅，葛云舒，陶能國，袁星星

（湘潭大學化工學院，湖南 湘潭 411105）

柑橘酸腐病菌（Geotrichum citri-aurantii）侵染引起的酸腐病是最嚴重的柑橘果實采后病害之一。酸腐病易在雨后、重霧或露水未干時采收的柑橘上發(fā)生，且一旦發(fā)生，發(fā)病范圍快速擴大，給柑橘產業(yè)帶來巨大沖擊[1-2]。目前，已注冊的商用殺菌劑僅有鄰苯基苯酚鈉鹽、雙胍鹽和丙環(huán)唑可部分防治酸腐病，但這些傳統(tǒng)殺菌劑存在化學毒性，極易污染環(huán)境，且易導致柑橘果實油斑病暴發(fā)等問題[3-5]。因此，尋找可替代化學殺菌劑的活性物質或替代方案成為近年來柑橘采后病害研究的熱點之一。

多項研究表明，植物精油及其抑菌組分對酸腐病菌等多種柑橘采后致病真菌有顯著的抑制作用，且具有安全、高效、低殘留等優(yōu)點，具備控制酸腐病害的潛力[6-8]。反式-2-己烯醛天然存在于香茅油、樟腦油等中，是植物精油的揮發(fā)性組分，也是植物對外界環(huán)境應答防御的重要信號分子。研究表明，反式-2-己烯醛對鏈格孢菌、圓弧青霉、擴展青霉、灰葡萄孢菌等多種采后致病菌有良好的抑制效果[9-14]，通過破壞真菌的細胞膜完整性[9-11]以及抑制真菌能量代謝[14]發(fā)揮其抑菌性能。前期研究發(fā)現，反式-2-己烯醛對酸腐病菌有明顯的抑制作用，最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimal fungicidal concentration，MFC）分別為0.42 mg/mL和0.85 mg/mL。貯藏7 d時，10×MFC反式-2-己烯醛處理組的‘宮川’柑橘果實發(fā)病率相較于對照組降低了67%，說明反式-2-己烯醛是一種潛在的生物殺菌劑[15]。但反式-2-己烯醛價格較高且氣味濃郁，其實際應用受到限制。

可溶性鹽主要通過破壞真菌細胞壁和細胞膜、破壞重要酶系統(tǒng)的作用和干擾能量傳遞以及遺傳機制，從而干擾真菌的正常生長[16-17]。食品添加劑中一系列低毒的可溶性鹽，如脫氫乙酸鈉、丙酸鈣、苯甲酸鈉、山梨酸鉀等，對多種果蔬病原微生物有顯著抑制作用，已被報道可應用于柑橘、梨、蘋果、桃、葡萄等水果的采后病害防治，是一類可靠的低毒有效殺菌劑[17-19]。食品添加劑雙乙酸鈉、丙酸鈣、磷酸鈉等也被發(fā)現有良好的抑菌效果[20-22]。用質量分數0.4%的雙乙酸鈉清洗鮮切生菜后，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和腸炎沙門氏菌分別減少了1.92、1.57（lg（CFU/mL））和1.42（lg（CFU/mL））[21]。丙酸鈣具有一定的抗菌活性，在酸性條件下能夠抑制細菌和霉菌的生長[22]。磷酸鈉能有效控制食源性細菌病原體的生長，包括沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特氏菌，對果蔬采后病原菌粉紅單端孢的菌絲生長和孢子萌發(fā)也有較好的抑制作用[16]。實驗室前期研究發(fā)現脫氫乙酸鈉對柑橘采后酸腐病有較好的防控效果，在離體條件下，其對酸腐病菌的MIC＝MFC＝0.80 mg/mL，在活體實驗中，質量濃度為4×MFC的脫氫乙酸鈉可有效抑制柑橘果實酸腐病的發(fā)生，具有良好的應用潛力[23]。

長期使用一種殺菌劑容易導致病原菌產生抗性，降低藥效，而抑菌物質聯(lián)用可以有效提高抑菌效果并降低病原菌的抗性[24-29]。茶皂素與低劑量的咪鮮胺或抑霉唑混合使用提高了其對接種‘沙糖’柑橘果實青霉病、綠霉病或酸腐病的防治性能[5]。肉桂醛和檸檬醛聯(lián)用后對酸腐病菌的抑制效果優(yōu)于二者單獨作用，可有效地延長柑橘的貨架期[27]。月桂精油與碳酸氫鈉聯(lián)用可以顯著提升月桂精油的抑菌效果，250 μg/mL月桂精油＋質量分數1%的碳酸氫鈉處理可以完全抑制鏈格孢生長，500 μg/mL月桂精油與質量分數1%的碳酸氫鈉聯(lián)用能顯著降低櫻桃番茄的發(fā)病率[28]。植物精油有良好的抑菌效果，但成本相對較高。將植物精油與低價的可溶性鹽進行聯(lián)用，可能提高抑菌效果并降低使用成本。因此，探討可溶性鹽與反式-2-己烯醛聯(lián)用效果對開發(fā)安全有效、價格低廉的果蔬防腐保鮮劑具有重要意義。

本研究主要探討反式-2-己烯醛與可溶性鹽如雙乙酸鈉、磷酸鈉、丙酸鈣、脫氫乙酸鈉等聯(lián)用對柑橘酸腐病菌的抑制作用，以期為柑橘貯藏期病害的可持續(xù)治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

柑橘酸腐病菌（G.citri-aurantii）菌株分離自腐爛的溫州蜜柑果實，已通過形態(tài)學和分子鑒定，現保存于湘潭大學生物與食品工程專業(yè)實驗室，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）上保存待用。

湘西椪柑（Citrus reticulataBlanco cv.Ponkan）果實于2020年12月21日從湖南省瀘溪縣張家坪村果園采摘，選擇大小均一、著色均勻且無病斑果實作為實驗材料。

反式-2-己烯醛（98%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所有化學藥品均為分析級。

1.2 儀器與設備

SPX-250B生化培養(yǎng)箱、MLS-3020手提式壓力蒸汽無菌器 上海博迅實業(yè)有限公司；SCW-CJ-1F垂直流潔凈工作臺 蘇州安瑞凈化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 可溶性鹽單獨處理對柑橘酸腐病菌的抑制效果

采用瓊脂稀釋培養(yǎng)法[29]測定雙乙酸鈉、磷酸鈉、丙酸鈣對柑橘酸腐病菌菌絲體生長的影響。雙乙酸鈉、磷酸鈉、丙酸鈣終質量濃度分別為0（對照）、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 mg/mL。每個培養(yǎng)皿中心接種1 個直徑為6.0 mm的菌餅，在（28±2）℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h，每24 h測量其生長直徑，并計算其抑制率。MIC為培養(yǎng)48 h時完全沒有生長的最低質量濃度，MFC為生長96 h時完全沒有生長的最低質量濃度。對照組中加入相應體積的吐溫80（體積分數0.5%）。柑橘酸腐病的抑制率按式（1）計算。

式中：dc為對照組生長直徑/mm；dt為處理組生長直徑/mm。

1.3.2 反式-2-己烯與可溶性鹽聯(lián)用對柑橘酸腐病菌生長的影響

用1.3.1節(jié)方法測定反式-2-己烯分別與脫氫乙酸鈉、雙乙酸鈉、磷酸鈉、丙酸鈣聯(lián)用對柑橘酸腐病菌菌絲體生長的影響。反式-2-己烯醛和脫氫乙酸鈉、雙乙酸鈉、磷酸鈉、丙酸鈣以質量比0.849∶1.000進行復配，復配物的終質量濃度為0、0.12、0.23、0.46、0.92 mg/mL。

采用分數抑制濃度（fractional inhibitory concentration，FIC）[30]評定反式-2-己烯與可溶性鹽的聯(lián)用效果。當FIC≤0.5時，兩種物質為協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1則為相加作用；1＜FIC≤4為無關作用；FIC＞4為拮抗作用。FIC按公式（2）計算。

式中：MICa,聯(lián)用表示MIC下兩物質聯(lián)用時反式-2-己烯的質量濃度；MICa,單用表示單獨使用反式-2-己烯時的MIC；MICb,聯(lián)用表示MIC下兩物質聯(lián)用時可溶性鹽的質量濃度；MICb,單用表示單獨使用可溶性鹽時的MIC。

1.3.3 反式-2-己烯與可溶性鹽聯(lián)用對柑橘酸腐病發(fā)生的影響

反式-2-己烯與可溶性鹽聯(lián)用對柑橘酸腐病發(fā)生的影響參照Ouyang Qiuli等[27]的方法。浸泡液配制：將反式-2-己烯分別與不同的可溶性鹽均勻溶于含吐溫80（體積分數0.5%）的水溶液中，最終反式-2-己烯與各可溶性鹽聯(lián)用的質量濃度分別為0、1×MFC、5×MFC和10×MFC。

椪柑用自來水洗凈后，在體積分數2%的次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，用蒸餾水洗凈并自然晾干。晾干后的椪柑用無菌手術刀在赤道處對稱劃2 個傷口（3 mm×2 mm）。接種濃度為1×105個/mL的柑橘酸腐病菌孢子懸浮液10 μL。接種后的椪柑靜置4 h后，在相應濃度的浸泡液中浸泡1 min，對照組為果蠟浸泡組。椪柑貯藏溫度為（25±2）℃，相對濕度為85%～90%，每組10 個果實。每天測定椪柑腐爛率和腐爛直徑，并通風1 h。發(fā)病率按公式（3）計算。

1.4 數據分析

所有實驗均重復3 次，采用Excel軟件進行數據處理，結果用平均值±標準差表示，采用軟件SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行差異顯著性分析（P＜0.05），使用Adobe Photoshop CS6軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 可溶性鹽單獨處理對柑橘酸腐病菌的抑制作用

由表1可知，雙乙酸鈉對柑橘酸腐病菌菌絲體的抑制作用隨著質量濃度增加而增強。在整個培養(yǎng)時間內，質量濃度低于4.00 mg/mL的雙乙酸鈉對柑橘酸腐病菌菌絲體的抑制率低于30%，效果不佳；當雙乙酸鈉質量濃度達到16.00 mg/mL，柑橘酸腐病菌生長被完全抑制，說明雙乙酸鈉對柑橘酸腐病菌的MIC和MFC均為16.00 mg/mL。

表1 雙乙酸鈉對柑橘酸腐病菌的抑制率Table 1 Inhibition rates of sodium diacetate on G.citri-aurantii

由表2可知，隨著作用質量濃度的增加，磷酸鈉對柑橘酸腐病菌的抑制作用逐漸增強。在整個培養(yǎng)時間內，低質量濃度（1.00～2.00 mg/mL）的磷酸鈉對柑橘酸腐病菌菌絲體的生長抑制效果隨著培養(yǎng)時間延長而效果減弱。培養(yǎng)2 d時，4.00 mg/mL的磷酸鈉可完全抑制柑橘酸腐病菌生長；培養(yǎng)4 d時，16.00 mg/mL的磷酸鈉可完全抑制柑橘酸腐病菌生長，說明磷酸鈉對柑橘酸腐病菌的MIC和MFC分別為4.00 mg/mL和16.00 mg/mL。

表2 磷酸鈉對柑橘酸腐病菌的抑制率Table 2 Inhibition rates of sodium phosphate on G.citri-aurantii

由表3可知，在整個培養(yǎng)過程內，1.00～16.00 mg/mL的丙酸鈣對柑橘酸腐病菌的抑制作用較弱。當處理質量濃度達到16.00 mg/mL時，對柑橘酸腐病菌生長的抑制率僅為50.00%～66.28%，說明丙酸鈣抑制柑橘酸腐病菌生長的MIC和MFC均高于16.00 mg/mL。

表3 丙酸鈣對柑橘酸腐病菌的抑制率Table 3 Inhibition rates of calcium propionate on G.citri-aurantii

2.2 反式-2-己烯與可溶性鹽聯(lián)用對柑橘酸腐病菌生長的影響

如表4所示，反式-2-己烯醛與磷酸鈉、雙乙酸鈉和丙酸鈣聯(lián)用為協(xié)同作用（FIC≤0.5），與脫氫乙酸鈉聯(lián)用為相加作用（0.5＜FIC≤1），與單獨使用相比，復合使用時反式-2-己烯醛和可溶性鹽的使用量均明顯降低。反式-2-己烯醛和雙乙酸鈉聯(lián)用后，抑制柑橘酸腐病菌生長的MIC＝MFC＝0.23 mg/mL，反式-2-己烯醛和雙乙酸鈉的用量明顯低于單獨抑菌時的質量濃度，相較于單獨使用時的MIC和MFC，反式-2-己烯醛質量濃度為0.11 mg/mL，雙乙酸鈉質量濃度為0.12 mg/mL，表明雙乙酸鈉與反式-2-己烯醛聯(lián)用后，反式-2-己烯醛的用量減少73.81%～87.06%，雙乙酸鈉的用量減少99.25%。反式-2-己烯醛與磷酸鈉聯(lián)用顯著抑制柑橘酸腐病菌生長（MIC＝MFC＝0.23 mg/mL），此時反式-2-己烯醛和磷酸鈉的質量濃度分別為0.11 mg/mL和0.12 mg/mL，相比于單獨使用時的MIC和MFC，磷酸鈉和反式-2-己烯醛質量濃度分別降低97.00%～99.25%和73.81%～87.06%。反式-2-己烯醛與丙酸鈣聯(lián)用之后MIC＝MFC＝0.23 mg/mL，反式-2-己烯醛用量相比于單獨處理時的MIC和MFC減少73.81%～87.06%，丙酸鈣質量濃度為0.12 mg/mL，明顯低于丙酸鈣單獨作用時的質量濃度。反式-2-己烯醛和脫氫乙酸鈉聯(lián)用同樣可降低物質的單獨用量，對酸腐病菌的MIC＝MFC＝0.46 mg/mL（反式-2-己烯醛質量濃度為0.21 mg/mL，脫氫乙酸鈉質量濃度為0.25 mg/mL），相比單獨使用時的MIC和MFC，反式-2-己烯醛和脫氫乙酸鈉分別減少了50.00%～75.29%和68.75%的用量。由以上結果可知，反式-2-己烯醛與可溶性鹽聯(lián)用可大幅增強二者的抑菌效果。

表4 反式-2-己烯與可溶性鹽聯(lián)用抑制柑橘酸腐病菌生長的MIC和MFC值Table 4 MIC and MFC values of trans-2-hexene combined with soluble salts against the growth of G.citri-aurantii

2.3 反式-2-己烯聯(lián)用可溶性鹽對柑橘酸腐病發(fā)生的影響

經反式-2-己烯醛聯(lián)用可溶性鹽處理后，接種柑橘酸腐病菌的果實發(fā)病率和病斑直徑變化分別如表5、6和圖1所示。貯藏3 d時，對照組果實開始發(fā)病，發(fā)病率為（36.67±5.77）%，病斑直徑為（4.3±0.6）mm，處理組中，反式-2-己烯醛＋丙酸鈣處理組開始發(fā)病，但發(fā)病率和病斑直徑均顯著低于對照組（P＜0.05）。貯藏4 d時，對照組發(fā)病率達到90%，病斑直徑擴大至（14.9±0.3）mm。反式-2-己烯醛＋磷酸鈣處理組在4 d時開始發(fā)病，在所有已發(fā)病的處理組中，1×MFC反式-2-己烯醛＋丙酸鈣處理組發(fā)病率最高（50.00%），病斑直徑（（7.8±0.9）mm）顯著低于對照組。貯藏5 d時，反式-2-己烯醛＋雙乙酸鈉處理組開始發(fā)病，處理組中1×MFC和10×MFC反式-2-己烯醛＋丙酸鈣發(fā)病率最高，分別為（84.07±11.42）%和（86.67±5.77）%，病斑直徑分別為（23.2±4.7）mm和（25.1±2.4）mm，發(fā)病率與對照組無顯著性差異，但病斑直徑顯著低于對照組。貯藏6 d時，對照組和1×MFC反式-2-己烯醛＋丙酸鈣處理組發(fā)病率達到1 0 0%，病斑直徑分別是（60.6±5.3）mm和（55.6±9.7）mm，除反式-2-己烯醛＋丙酸鈣處理組外，其他聯(lián)用處理組發(fā)病率以及病斑直徑均顯著低于對照組，其中5×MFC和10×MFC反式-2-己烯醛＋脫氫乙酸鈉處理組椪柑果實均未發(fā)病。

圖1 反式-2-己烯醛與可溶性鹽聯(lián)用對接種柑橘酸腐病椪柑果實發(fā)病進程的影響Fig.1 Effect of trans-2-hexenal combined with soluble salts on the progression of sour rot disease in ponkan fruit inoculated with G.citri-aurantii

表5 反式-2-己烯醛與可溶性鹽聯(lián)用對接種酸腐病菌椪柑果實的酸腐病發(fā)病率的影響Table 5 Effect of trans-2-hexenal combined with soluble salts on the incidence of sour rot disease in ponkan fruits inoculated with G.citri-aurantii

表6 反式-2-己烯醛與可溶性鹽聯(lián)用對接種酸腐病菌椪柑果實病斑直徑的影響Table 6 Effect of trans-2-hexenal combined with soluble salts on the lesion diameter of ponkan fruit inoculated with G.citri-aurantii

3 討論

已有研究表明，反式-2-己烯醛具有顯著的抑菌活性和防腐作用，對鏈格孢菌、尖孢炭疽菌、擴展青霉、灰葡萄孢菌、酸腐病菌等采后病菌具有良好的抑制作用，能有效地控制灰霉病、綠霉病、黑腐病和酸腐病，并對果實品質沒有不利影響[9-15]。雙乙酸鈉、丙酸鈣、磷酸鈉、脫氫乙酸鈉等可溶性鹽也具有一定的抑菌效果。雙乙酸鈉和丙酸鈣均可抑制肉制品中枯草芽孢桿菌生長，MIC分別為50 μg/mL和6.25 μg/mL[22]；磷酸鈉可抑制果蔬采后病原菌粉紅單端孢以及棗、桃果實的褐腐病[16]，不同濃度的磷酸鈉處理蘋果能夠有效控制青霉病，并促進蘋果本身營養(yǎng)物質的積累，不影響蘋果品質[31]。脫氫乙酸鈉對酸腐病菌的MIC＝MFC＝0.80 mg/mL，并對柑橘采后酸腐病有較好的防控效果[15]。本研究結果表明，雙乙酸鈉、丙酸鈣、磷酸鈉對柑橘酸腐病菌有一定的抑制效果，具有抑制柑橘采后酸腐病的潛力，其中磷酸鈉對酸腐病菌的抑制效果最強。

長期使用單一化學殺菌劑會使病菌產生抗藥性，其殺菌作用會大大降低，因此將多種殺菌劑進行復合是目前防治柑橘酸腐病的一種手段。脫氫乙酸鈉和硅酸鈉按照質量比1∶4進行聯(lián)用時可以協(xié)同抑制酸腐病菌菌絲體生長[24]。雙乙酸鈉、丁酸鈉、丙酸鈣和山梨酸鉀抑制黃曲霉的MFC分別為32、32、64 mg/mL和128 mg/mL；雙乙酸鈉與山梨酸鉀（質量比為2∶1）聯(lián)用后對黃曲霉的MFC僅為1 mg/mL，鹽類物質的使用量大大減少[25]。本研究發(fā)現，離體實驗時，可溶性鹽單獨作用酸腐病菌時抑菌效果較差，但與反式-2-己烯醛聯(lián)用后其抑菌性能提高且抑菌物質用量降低。反式-2-己烯醛與脫氫乙酸鈉復合為相加作用，反式-2-己烯醛＋雙乙酸鈉、反式-2-己烯醛＋磷酸鈉、反式-2-己烯醛＋丙酸鈣為協(xié)同作用，其中反式-2-己烯醛與雙乙酸鈉、丙酸鈣的聯(lián)用效果優(yōu)于其他兩種可溶性鹽。這與韓乾杰等[26]實驗結果一致，丁酸鈉對大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌、乳酸菌沒有顯示出抑菌作用，但不同的植物精油與丁酸鈉聯(lián)用可以協(xié)同抑制上述細菌的生長。反式-2-己烯醛和鹽類殺菌劑聯(lián)用后，對酸腐病菌的抑菌效果強于單獨殺菌劑作用，推測鹽類溶于水后會造成細胞膜兩側滲透壓不同，影響細胞膜通透性，加速反式-2-己烯醛進入細胞，加劇細胞損傷。

將肉桂醛和檸檬醛按照1∶2（體積比）的比例混合，用1×MFC混合物處理柑橘果實時，貯藏8 d后的腐爛率僅為60%，而對照組果實已經全部腐爛[27]。百里香精油和不同質量分數的碳酸鈉溶液聯(lián)用，發(fā)現1 600 μL/L百里香精油和質量分數0.5%碳酸鈉混合可以完全抑制柑橘酸腐病害的發(fā)生[29]。與反式-2-己烯醛單獨處理相比，5×MFC和10×MFC 反式-2-己烯醛＋脫氫乙酸鈉對柑橘酸腐病均有顯著的抑制作用，處理組第6天時的果實未發(fā)病；10×MFC反式-2-己烯醛＋磷酸鈉效果較好，第6天時發(fā)病率為（32.78±12.51）%?；铙w實驗所用的反式-2-己烯醛有效質量濃度遠高于離體實驗的有效質量濃度，可能由于活體實驗所用空間較大，反式-2-己烯醛揮發(fā)得更快導致有效濃度降低。

綜上，反式-2-己烯醛與雙乙酸鈉、磷酸鈉、脫氫乙酸鈉聯(lián)用能夠顯著抑制酸腐病菌菌絲體生長，降低使用量，并有效控制柑橘采后酸腐病。其中，5×MFC和10×MFC 反式-2-己烯醛＋脫氫乙酸鈉防控效果最佳。