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        宰后成熟過程中脂多糖誘導(dǎo)劑對灘羊肌細(xì)胞線粒體凋亡信號通路的影響

        2023-11-07 11:08:46羅瑞明羅玉龍王金霞陳雪妍
        食品科學(xué) 2023年19期
        關(guān)鍵詞:宰后線粒體活力

        李 榮,羅瑞明,杜 瑞,羅玉龍,*,王金霞,張 倩,陳雪妍

        (1.寧夏大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,寧夏 銀川 750021;2.銀川市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心,寧夏 銀川 750000)

        線粒體作為細(xì)胞凋亡的中樞調(diào)控者,參與調(diào)控細(xì)胞氧化還原狀態(tài)變化過程和能量供應(yīng),同時對肌細(xì)胞凋亡進程起著極其重要的調(diào)控作用[1-2]。宰后肌肉組織與外界切斷聯(lián)系,缺氧缺血等變化導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)[3],ATP耗竭使細(xì)胞從有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧糖酵解,活性氧(reactive oxygen species,ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激等使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)構(gòu)象發(fā)生改變,導(dǎo)致線粒體內(nèi)促凋亡因子線粒體細(xì)胞色素c(cytochrome c,Cyt-c)、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor,AIF)等大量釋放,最終引發(fā)細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)[4]。可通過線粒體能量變化、氧化應(yīng)激水平、標(biāo)志酶以及凋亡因子釋放情況等指標(biāo)來表征凋亡對線粒體的影響。

        脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分,可以和TLR4基因編碼的跨膜蛋白Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)結(jié)合。LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通過TLR4激活核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB),激活后的NF-κB誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子從而介導(dǎo)炎癥基因和BCL-2家族的蛋白通過激活半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)活性來參與細(xì)胞凋亡過程[5]。張釗等[6]發(fā)現(xiàn)LPS刺激可以改變線粒體的形態(tài),導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位下降,促進ROS的產(chǎn)生,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Gogvadze等[7]的研究表明從線粒體內(nèi)膜釋放的各種促凋亡蛋白在胞漿中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生,即線粒體對調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生有著至關(guān)重要的作用。McIlwain等[8]發(fā)現(xiàn)給予一定劑量的LPS會引起Caspase-3的激活,LPS被認(rèn)為能夠參與細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者——Caspase3的活化;張永波[9]的研究表明LPS可以通過氧化應(yīng)激損傷的途徑使細(xì)胞發(fā)生凋亡,具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。Ji Yinglei等[10]使用LPS處理大鼠細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其顯著上調(diào)了Caspases-12和Caspases-3蛋白的表達(dá),表明LPS可能以劑量和時間依賴性的方式導(dǎo)致細(xì)胞活力降低和細(xì)胞凋亡率增加。以上研究結(jié)果均表明,LPS可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,但對于LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對線粒體凋亡通路的影響鮮有研究。

        本實驗以灘羊背最長肌為研究對象,通過LPS誘導(dǎo)凋亡,測定其在4 ℃成熟0、6、12、24、72 h過程中灘羊肉細(xì)胞凋亡率、凋亡酶活力、線粒體ATP含量、琥珀酸脫氫酶(succinatedehydrogenase,SDH)和檸檬酸合酶(citrate synthase,CS)活力,采用酶聯(lián)免疫吸附測試(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒測定Bcl-2家族蛋白含量,采用Western blot法測定細(xì)胞凋亡因子Cyt-c和Caspase-3的表達(dá)量,以此闡釋灘羊肉成熟過程中LPS誘導(dǎo)凋亡與線粒體凋亡途徑的關(guān)系,以期為后續(xù)揭示LPS誘導(dǎo)凋亡的機制提供思路,并為冷卻灘羊肉貯藏期間肉品質(zhì)量控制技術(shù)研發(fā)提供一定的理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        9 只胴體質(zhì)量相近的6 月齡公灘羊購自寧夏鹽池縣寧鑫肉業(yè)有限公司。

        LPS、甘露醇、4-丙磺酸基嗎琳、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸 北京索萊寶生物科技有限公司;Arsenazo III 美國MCE公司;TUNEL凋亡檢測試劑盒 江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司;總蛋白定量測定試劑盒、ATP含量測定試劑盒、SDH活力檢測試劑盒、CS活力檢測試劑盒、Caspase-3活力檢測試劑盒、Caspase-9活力檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;雙花扁豆凝集素(dolichos bifows agglutinin,DBA)試劑盒 上??道缮锟萍加邢薰荆痪d羊Bax ELISA試劑盒、綿羊Bcl-2 ELISA試劑盒 武漢新啟迪生物科技有限公司;Anti-Cytochrome c抗體、Anti-Caspase-3抗體 美國Abcam公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        752N紫外分光光度計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;HZB-12/A家用制冰機 寧波惠康國際工業(yè)有限公司;TGL-16D冷凍高速離心機 常州中捷實驗儀器制造有限公司;JX-CL冷凍研磨儀 上海凈信實驗設(shè)備有限公司;HHS-21-6電熱恒溫水浴鍋 上海四藍(lán)儀器設(shè)備有限公司;EL×800酶標(biāo)儀 美國BioTek公司;WIXEP300垂直電泳儀 韋克斯科技(北京)有限公司;SH-100凝膠圖像分析儀 上海四星生物技術(shù)公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品采集

        宰前遵循動物管理規(guī)定,屠宰后立即用滅菌刀取下右側(cè)背最長肌,剔除可見脂肪與結(jié)締組織后,分割成100 g左右肉樣,快速存入液氮作0 h樣品。剩下的肉樣切成100 g左右大小一致的肉塊,隨機分為2 組,第1組不作處理,為空白對照組,第二組注射30 mg/L LPS溶液(肉樣和處理液的質(zhì)量體積比為1∶1),裝入密閉自封袋,在4 ℃條件下分別成熟0、6、12、24、72 h,并在對應(yīng)時間節(jié)點測定pH值等指標(biāo),對凋亡酶活性和凋亡因子表達(dá)量等不便立即測定的指標(biāo),在相應(yīng)的時間節(jié)點上取樣,用液氮快速凍結(jié),放入-80 ℃冷凍待測。

        1.3.2 pH值測定

        剔除樣品可見脂肪與結(jié)締組織,使用便攜式pH計測定成熟期間肌肉pH值。

        1.3.3 細(xì)胞凋亡率的測定

        細(xì)胞凋亡率采用TUNEL凋亡試劑盒進行測定。將樣品處理為1 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉塊,在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中進行固定,石蠟包埋、切片(厚度約為5 μm)、脫蠟,用體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫溶液封閉。隨后將切片浸入1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)漂洗3 次,每次5 min。每個樣本上滴加100 μL蛋白酶K工作液,37 ℃反應(yīng)30 min;切片再次浸入1×PBS漂洗3 次,每次5 min;切片周圍用吸水紙吸干,每個切片上滴加50 μL末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液,37 ℃避光反應(yīng)1 h,反應(yīng)后的切片浸入1×PBS漂洗3 次,每次5 min,注意避光;將切片放入Streptavidin-FITC標(biāo)記工作液中,37 ℃避光反應(yīng)30 min;然后將切片放入過氧化物酶-conjugated Anti-FITC工作液中,37 ℃避光反應(yīng)30 min,與二氨基聯(lián)苯中避光顯色10 min。顯色后的樣本切片浸入1×PBS漂洗3 次,每次5 min,注意避光,用熒光顯微鏡進行觀察和計數(shù)。

        1.3.4 細(xì)胞凋亡酶活力的測定

        按照Caspase-3和Caspase-9活力檢測試劑盒說明書操作測定Caspase-3和Caspase-9活力。Caspase-3和Caspase-9活力以熒光強度來表示。

        1.3.5 線粒體的提取

        線粒體的提取參照趙亞亞[11]的方法并稍作修改。取灘羊背最長肌2 g肉樣,剪碎后置于20 mL線粒體分離介質(zhì)中,用低溫研磨儀勻漿(10 000×g、2 min),勻漿液離心(4 ℃、1 000×g、10 min)而后取上清液進一步離心(4 ℃、1 000×g、10 min),后取上清液再離心(4 ℃、8 000×g、20 min),棄上清液所得沉淀即為線粒體,用BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度。

        1.3.6 Cyt-c氧化還原狀態(tài)的測定

        Cyt-c氧化還原狀態(tài)的測定參照Borutaite等[12]的方法并稍作修改。取2 g灘羊肌肉加入8 mL預(yù)冷的提取緩沖液(300 mmol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸、0.5%牛血清白蛋白,pH 7.4)進行勻漿。勻漿液于低溫研磨儀10 000×g勻漿2 min,取上清液于10 000×g離心2 min,上清液再次于8 000×g離心15 min。最終得到的上清液采用雙縮脲法測定胞漿Cyt-c質(zhì)量濃度。上清液分別于550 nm和535 nm波長處測定吸光度。Cyt-c還原狀態(tài)水平以550 nm波長處吸光度與535 nm吸光度之差與Cyt-c質(zhì)量的比值表示。

        1.3.7 ATP含量的測定

        按照ATP含量檢測試劑盒的要求測定ATP含量。

        1.3.8 線粒體標(biāo)志酶活力的測定

        按照SDH、CS檢測試劑盒的要求測定SDH、CS活力。

        1.3.9 Bcl-2家族蛋白表達(dá)量的測定

        凋亡關(guān)鍵因子Bax、Bcl-2表達(dá)量按照ELISA試劑盒說明書測定。

        1.3.10 Western blot樣品的提取

        參照Philchenkov[13]的方法提取Western blot樣品。取宰后肉樣各1 g,加入2 mL分離緩沖液(0.225 mol/L甘露醇、0.075 mol/L蔗糖、0.2%牛血清白蛋白、1 mmol/L乙二胺四乙酸,pH 7.5),用玻璃勻裝器勻漿,1 000×g離心10 min取上清液,然后14 000×g離心10 min取上清液,最后10 000×g離心15 min,上清液即為全蛋白提取物,用于測定蛋白表達(dá)。

        1.3.11 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blot分析

        參考孫志昶[14]的方法進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,分離膠和濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12%和5%。將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜上,隨后用5%的脫脂奶粉TTBS溶液于25 ℃封閉1 h,用TTBS溶液漂洗,再與用含5%脫脂奶的TTBS溶液以500 倍稀釋的Cyt-c、Caspase-3和GAPDH抗體4 ℃反應(yīng)過夜。TTBS溶液洗去多余抗體后與相對應(yīng)的二抗在25 ℃條件下孵育1 h,TTBS浸洗后采用DBA試劑盒顯色。

        使用掃描儀獲取圖像,然后用ImageJ分析軟件進行定量分析,計算出目的條帶的光密度值。

        1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

        每個指標(biāo)重復(fù)測定3 次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Excel軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù),采用SPSS Statistics 26軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析,采用Origin 2021軟件作圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 宰后成熟過程中pH值變化

        宰后肌肉pH值的下降會造成內(nèi)環(huán)境的酸化,從而影響肌肉保水性,是衡量宰后初期肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[15]。從圖1可以得出,宰后0~72 h內(nèi),對照組的pH值顯著下降了5%(P<0.05);12~24 h內(nèi)對照組pH值顯著高于LPS處理組(P<0.05)。LPS處理組在0~24 h內(nèi)呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05),并在24 h達(dá)到極限pH值,隨后開始上升。Tao Yingmei[16]及姬琛[17]等的研究表明宰后成熟期間灘羊pH值變化范圍為5.4~6.3,本實驗研究結(jié)果符合這一規(guī)律。

        圖1 灘羊宰后成熟過程中pH值的變化Fig.1 Changes of pH during postmortem aging of Tan sheep meat

        2.2 宰后成熟過程中細(xì)胞凋亡率的變化

        由圖2可知,綠色熒光的細(xì)胞核為TUNEL陽性細(xì)胞核。隨著宰后成熟時間的延長,TUNEL陽性細(xì)胞核數(shù)量呈現(xiàn)增多的趨勢,且同一成熟時間LPS處理組的TUNEL陽性細(xì)胞核數(shù)量多于對照組??梢奓PS會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如圖3所示,宰后成熟過程中,細(xì)胞凋亡率整體呈顯著上升的趨勢(P<0.05);0~72 h,對照組和LPS處理組細(xì)胞凋亡率分別上升至31.70%和42.47%;成熟期間對照組細(xì)胞凋亡率均顯著低于LPS處理組(P<0.05),表明LPS處理灘羊促進了細(xì)胞凋亡進程,對細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用。

        圖2 LPS處理對宰后灘羊肉成熟過程中TUNEL陽性細(xì)胞核染色免疫熒光圖Fig.2 Effect of LPS on immunofluorescence image of TUNEL-positive cell nuclei in Tan sheep meat during postmortem aging

        圖3 宰后灘羊肉成熟過程中細(xì)胞凋亡率的變化Fig.3 Changes in cell apoptosis rate during postmortem aging of Tan sheep meat

        2.3 宰后成熟過程中細(xì)胞凋亡酶活力的變化

        線粒體凋亡通路中,Caspae-9和Caspae-3作為重要的效應(yīng)酶,與凋亡的發(fā)生密切相關(guān)。由圖4A可知,LPS處理組Caspase-9活力在0~12 h顯著上升并達(dá)到最大值1.413,隨后顯著下降(P<0.05);6~12 h內(nèi)對照組Caspase-9活力顯著上升并在12 h達(dá)到最大值1.306;0~72 h,LPS處理組Caspase-9活力均顯著高于對照組(P<0.05)。如圖4B所示,對照組Caspase-3活力在宰后成熟過程中顯著上升(P<0.05),并于24 h達(dá)到最大值,隨后呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05);0~72 h內(nèi),LPS處理組Caspase-3活力呈先升后降趨勢,并于24 h達(dá)到最大值;0~72 h內(nèi),LPS處理組Caspase-3活力均顯著高于對照組(P<0.05)。

        圖4 宰后灘羊肉成熟過程中Caspase-9(A)和Caspase-3(B)活力變化Fig.4 Changes in Caspase-9 (A) and Caspase-3 (B) activities during postmortem aging of Tan sheep meat

        2.4 宰后成熟過程中Cyt-c的氧化還原狀態(tài)的變化

        研究表明Cyt-c的氧化還原狀態(tài)對于細(xì)胞凋亡的啟動具有重要影響。只有氧化型Cyt-c能夠激活Caspase,還原型Cyt-c沒有啟動細(xì)胞凋亡的作用[18]。圖5反映了宰后灘羊肉成熟過程中Cyt-c氧化還原狀態(tài)變化,宰后0~72 h,對照組和LPS處理組中Cyt-c還原水平顯著降低(P<0.05)。LPS處理組的下降速度較對照組更快。Cyt-c還原水平的下降表明Cyt-c氧化水平升高,由此介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。

        圖5 宰后灘羊肉成熟過程中Cyt-c還原水平的變化Fig.5 Changes in cytochrome c reduction level during postmortem aging of Tan sheep meat

        2.5 宰后成熟過程中線粒體ATP含量的變化

        灘羊宰后細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變,阻斷了氧氣進入,缺氧使線粒體的氧化還原電位降低,造成呼吸鏈功能紊亂,ATP不能正常合成,磷酸原體系中的肌酸磷酸也會在很短的時間內(nèi)被耗盡,無氧酵解途徑開啟,最終產(chǎn)生大量的乳酸[19]。由圖6可知,線粒體ATP含量在宰后成熟過程中整體呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(P<0.05);0~72 h內(nèi),對照組ATP含量顯著降低了47.34%,LPS處理組的ATP含量顯著下降了56.02%,LPS處理組ATP含量顯著低于對照組(P<0.05),這可能是LPS加快了細(xì)胞從有氧呼吸向無氧糖酵解的進程。

        圖6 宰后灘羊肉成熟過程中ATP含量的變化Fig.6 Changes in mitochondrial ATP content during postmortem aging of Tan sheep meat

        2.6 宰后成熟過程中線粒體標(biāo)志酶活力的變化

        SDH和CS作為線粒體的標(biāo)志酶,均與能量代謝相關(guān)。SDH作為連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一,可為呼吸鏈提供電子,是參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶,SDH活力可以有效反映線粒體的功能[20]。CS作為三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵調(diào)控酶,其活性及變構(gòu)效應(yīng)受到ATP的抑制[21]。由圖7A可知,成熟早期(0~6 h),LPS處理組SDH活力均顯著低于對照組(P<0.05),呈顯著上升趨勢(P<0.05);隨后6~72 h呈顯著下降趨勢,可能是因為LPS處理加劇了線粒體能量的消耗,從而引起SDH活力短暫升高。如圖7B所示,LPS處理組CS活力在0~6、12~72 h內(nèi)呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05),6~12 h內(nèi)呈顯著上升趨勢(P<0.05);對照組CS活力在0~12、24~72 h內(nèi)呈顯著下降趨勢(P<0.05),12~24 h顯著上升趨勢(P<0.05)。

        圖7 宰后灘羊肉成熟過程中SDH活力(A)和CS活力(B)的變化Fig.7 Changes in SDH activity (A) and CS activity (B) during postmortem aging of Tan sheep meat

        2.7 宰后成熟過程中Bcl-2家族蛋白水平的變化

        Bax和Bcl-2都屬于Bcl-2蛋白家族,通過調(diào)節(jié)線粒體膜通透性參與線粒體凋亡途徑并發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]。成熟期間Bax水平的變化如圖8A所示,在宰后成熟過程中,Bax水平整體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,6 h為最高值。這與Ma Jibing等[23]在牛肉宰后成熟期間觀察到Bax的水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢結(jié)果一致。成熟期間Bcl-2水平的變化如圖8B所示,在宰后成熟期間Bcl-2水平整體呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(P<0.05);其中LPS處理組水平顯著低于對照組(P<0.05),劉暢[24]的研究也表明蒙古羊宰后成熟過程中Bcl-2水平呈現(xiàn)下降趨勢。

        圖8 宰后灘羊肉成熟過程中Bax(A)和Bcl-2(B)水平的變化Fig.8 Changes in Bax (A) and Bcl-2 (B) levels during postmortem aging of Tan sheep meat

        Bcl-2家族蛋白是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)控者,Bax和Bcl-2含量的比值(Bax/Bcl-2)可用來評估LPS其對誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的作用。目前普遍認(rèn)為,高Bax/Bcl-2表明促凋亡能力更強,低Bax/Bcl-2表明抗凋亡能力更強[23,25]。如圖9所示,在宰后成熟過程中,LPS處理組的Bax/Bcl-2顯著高于對照組(P<0.05)。綜上說明,LPS可以調(diào)控Bcl-2家族蛋白含量,誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。

        圖9 宰后灘羊肉成熟過程中Bax/Bcl-2的變化Fig.9 Changes in Bax/Bcl-2 ratio during postmortem aging of Tan sheep meat

        2.8 宰后成熟過程中線粒體信號通路關(guān)鍵因子釋放的情況

        由圖10、11可知,在宰后成熟過程中,LPS處理組的胞漿Cyt-c表達(dá)量在宰后12 h顯著升高,24~72 h內(nèi)LPS處理組胞漿Cyt-c表達(dá)量呈下降趨勢。這是由于宰后前期Cyt-c大量釋放,而隨著線粒體損傷的加重,Cyt-c的合成量不斷減少,且一部分Cyt-c與Apaf-1結(jié)合,最終導(dǎo)致Cyt-c含量在宰后24 h后逐漸減少[26]。

        圖10 宰后灘羊肉成熟過程中Cyt-c的免疫印跡表達(dá)Fig.10 Changes in protein expression of Cyt-c during postmortem aging of Tan sheep meat

        圖11 宰后灘羊肉成熟過程中Cyt-c的表達(dá)Fig.11 Changes in Cyt-c expression during postmortem aging of Tan sheep meat

        Caspase-3可以切割細(xì)胞骨架蛋白,它的激活標(biāo)志著細(xì)胞凋亡的發(fā)生[27]。孫志昶[14]研究發(fā)現(xiàn)牦牛宰后成熟過程中確實存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9均發(fā)生活化。本實驗測定了Caspase-3活化蛋白的相對表達(dá)量,以分析LPS處理對宰后細(xì)胞凋亡的影響。Caspase-3酶原本身并沒有誘導(dǎo)凋亡的活性,只有裂解為17~20 kDa的活化片段才能參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

        圖12為不同處理組分別成熟0、6、12、24、72 h后Caspase-3的免疫印跡圖譜,可以看出,經(jīng)過LPS處理后,灘羊肉骨骼肌中Caspase-3活化片段的灰度均高于對照組。這說明在凋亡誘導(dǎo)劑LPS處理加快了Caspase-3酶原被激活并降解成活性片段的速度,故LPS是通過加速Caspase-3酶原的激活促進細(xì)胞凋亡。對活化片段進行光密度值的定量分析,結(jié)果如圖13所示。LPS處理組的Caspase-3活化片段蛋白相對含量始終高于對照組,表明LPS處理組灘羊肉中Caspase-3裂解成活性片段的程度強于對照組,因此,LPS處理有利于加速宰后Caspase-3的激活。

        3 討論

        細(xì)胞凋亡過程中DNA會發(fā)生降解形成碎片化,從而產(chǎn)生大量的黏性3’-OH末端,可通過TUNEL熒光標(biāo)記,觀察綠色熒光變化,以此了解細(xì)胞凋亡情況[28]。本研究中,通過觀察TUNEL陽性細(xì)胞核數(shù)量以及計算細(xì)胞凋亡率得出,隨著成熟時間的延長,細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)上升趨勢,在同一成熟時間內(nèi)LPS處理會加快細(xì)胞凋亡的進程。Cyt-c介導(dǎo)細(xì)胞凋亡通常伴隨著線粒體損傷[29]。研究發(fā)現(xiàn)Cyt-c氧化還原狀態(tài)與細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明,宰后0~72 h,隨著宰后時間的延長,Cyt-c還原水平逐漸降低,氧化水平逐漸升高,表明Cyt-c釋放介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生在宰后早期。Cyt-c在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮核心作用[30]。Caspase-9活力整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,這可能是由于宰后前期LPS處理影響Cyt-c氧化還原的活性,氧化型Cyt-c含量增多,從而介導(dǎo)Caspase級聯(lián)反應(yīng)信號不斷放大,致使Caspase-9的活力上升。以上研究說明,LPS通過促進氧化型Cyt-c形成凋亡小體的作用,間接促進Caspase-9和Caspase-3的激活。Caspase-9的活化早于Caspase-3發(fā)生。即Caspase-9作為線粒體凋亡通路中凋亡啟動酶,能啟動下游的效應(yīng)酶Caspase-3,進而引起線粒體通路細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

        本研究中LPS處理組肌肉pH值隨成熟時間延長先下降后上升,并在24 h達(dá)到極限pH值,這可能是宰后內(nèi)環(huán)境改變切斷了與外界的聯(lián)系,有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒馍扇樗崴?。宰后ATP含量整體顯著下降,這是因為宰后氧氣的阻斷導(dǎo)致線粒體中氧化還原電位下降,呼吸電子傳遞鏈發(fā)生功能障礙,不能正常地通過三羧酸循環(huán)合成ATP,細(xì)胞由有氧呼吸途徑進入無氧酵解途徑,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP的生成量迅速降低[31-32]。這一能量變化的過程會影響線粒體標(biāo)志酶——SDH和CS的活性,本研究發(fā)現(xiàn)宰后成熟早期處理組SDH活力高于對照組,CS活力在0~12 h隨著成熟時間的延長呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。宰后成熟過程中Bax含量整體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,Bcl-2含量整體呈現(xiàn)下降趨勢。Bax和Bcl-2分別是促凋亡和抗凋亡蛋白,研究發(fā)現(xiàn)在凋亡條件下,Bax激活后在線粒體外膜積累,并發(fā)生寡聚化,從而導(dǎo)致促凋亡因子如Cyt-c的釋放[33]。Bax/Bcl-2可用來評估凋亡發(fā)生的程度,本研究結(jié)果表明,Bax/Bcl-2呈現(xiàn)上升趨勢,且LPS處理組顯著高于對照組。通過對Cyt-c和Caspase-3活化蛋白表達(dá)量的測定,發(fā)現(xiàn)LPS處理加快了Cyt-c的釋放和Caspase-3活化,對凋亡進程起到促進作用。

        綜上,宰后成熟過程中LPS 誘導(dǎo)劑是通過激活Caspase-9和Caspase-3活性、降低細(xì)胞能量代謝水平進而影響SDH和CS的活性,促使Cyt-c釋放,提高Bax/Bcl-2比值,從而誘導(dǎo)細(xì)胞通過線粒體信號通路發(fā)生凋亡。

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