賈彩霞 周潔如 朱洪希 吳旦

摘 要：目的：建立牛肉中多種磺胺類藥物殘留量的檢測方法。方法：處理均質后的牛肉，用乙酸乙酯提取出目標物，用HLB小柱凈化，氮吹，復溶。以0.1%的甲酸甲醇與0.1%的甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，經T3色譜柱進行分離，采用離子源為電噴霧離子源，掃描方式為正離子掃描，檢測模式為多反應監(jiān)測，外標法定量。結果：18種磺胺在2～200 ng·mL-1線性關系良好（r＞0.996），方法的檢出限為2 μg·kg-1，定量限為10 μg·kg-1，加標回收率為64.87%～105.00%，相對標準偏差為1.6%～6.8%。結論：本方法靈敏、準確，適用于牛肉中18種磺胺類藥物的檢測。

關鍵詞：固相萃??；高效液相色譜-串聯質譜；磺胺類藥物；牛肉

Determination of Sulfonamide Residues in Beef by Solid Phase Extraction-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

JIA Caixia， ZHOU Jieru， ZHU Hongxi， WU Dan

（Changzhou Institute of Inspection and Testing Standards Certification， Changzhou 213000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of sulfonamides residues in beef. Method： The homogenized beef was treated， the target was extracted with ethyl acetate， purified by HLB column， nitrogen blowing， and redissolved. 0.1% formic acid methanol and 0.1% formic acid aqueous solution were used as mobile phase for gradient elution， and separated by T3 column. Ion source was used as electrospray ion source， scanning mode was positive ion scan， detection mode was multi-reaction monitoring， and quantitative method was external standard method. Result： The internal linear relationship of 18 sulfonamides was good （r＞0.996） in the range of 2～200 ng·mL-1. The limits of detection and quantification were 2 μg·kg-1 and 10 μg·kg-1. The recoveries were 64.87%～105.00% and the relative standard deviations were 1.6%～6.8%. Conclusion： The method is sensitive， accurate and suitable for the detection of 18 sulfonamides in beef.

Keywords： solid phase extraction; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; sulfonamides; beef

獸藥殘留是指用藥后蓄積或存留于畜禽機體或產品中原型藥物或其代謝產物，包括與獸藥有關的雜質殘留[1]。獸藥殘留主要是由于不按規(guī)定、非法使用及濫用獸藥造成獸藥在動物體內不斷積累而引起[2]。常見的獸藥殘留包括酰胺醇類、磺胺類和喹諾酮類等[3]。其中，磺胺類藥物對于鏈球菌等細菌有預防和治療的作用。該藥物價格低廉、使用方便以及藥效明顯，在各類畜禽的養(yǎng)殖過程中大量使用。但該藥對生態(tài)環(huán)境和對畜牧生產業(yè)的發(fā)展都有嚴重危害，且該藥會引起人過敏反應，甚至有致癌性。

由于生活質量越來越高，動物源食品的出口貿易急劇增長，人們對食品質量與安全的關注度大大提高。因此，幾乎每個國家都出臺了動物源性食品中獸藥殘留的檢測限量。獸藥的最高殘留限量基本都在1 mg·kg-1以下，即百萬分之一級別，許多禁用藥要求會更低，無疑屬于痕量分析范疇，所以獸藥殘留的檢測一直是食品檢測中的難點[4-7]。常用的檢測方法包括傳統(tǒng)的溶劑萃取、固相萃取、凝膠色譜、多項技術組合及QuEChERS試劑包等多種方法[8-9]。本實驗采用固相萃取-液相色譜串聯質譜法測定牛肉中多種磺胺類藥物殘留量，以滿足實驗室牛肉樣品中18種磺胺類藥物的常規(guī)檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

標準品：磺胺類混標（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺間二甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺間甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺甲氧噠嗪（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺對甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；乙酸乙酯（色譜純）；甲酸（色譜純）；濃氨水。

液相色譜-串聯質譜儀（島津，LCMS-8050）；12孔固相萃取裝置（CNW）；氮吹儀；高速離心機；渦旋振蕩儀；超聲波清洗器；HLB固相萃取柱（CNW）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

取適量有代表性的新鮮或解凍空白牛肉，攪碎并均質，-18 ℃保存。

1.2.2 提取

稱取4 g（精確至0.01 g）試樣，用10 mL的乙酸乙酯提取，高速渦旋1 min，再經超聲提取20 min，8 000 r·min-1冷凍離心5 min，收集上清液于20 mL干凈容量瓶中，剩余殘渣中再加入8 mL乙酸乙酯，重復前述提取步驟后合并上清液于同一20 mL容量瓶中，定容至刻度。取上清液5 mL，加水5 mL，振蕩1 min，45 ℃氮吹除去乙酸乙酯層。

1.2.3 凈化

HLB固相萃取柱分別依次經6 mL甲醇和6 mL水活化，吸取上述經氮吹除去乙酸乙酯的液體以每秒1～2滴的速度過固相萃取柱，依次用6 mL水和6 mL 20%甲醇水淋洗，抽干，再用2×4 mL 5%氨水甲醇∶乙酸乙酯（1∶1）溶液洗脫，收集該洗脫液，45 ℃氮氣吹干，用1 mL 0.2%甲酸乙腈溶液∶水（2∶3）復溶，經0.22 μm有機濾膜過濾，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.2.4 標準曲線

將多種磺胺類混標用0.2%甲酸乙腈水（2∶3）配制成濃度分別為2 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的標準溶液，以牛肉為空白基質，通過提取、凈化、氮吹干后用1 mL前述配制好的標準溶液進行復溶，進樣。

1.2.5 液相色譜條件

色譜柱：Waters UPLC T3（100 mm×2.1mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；流動相：0.1%甲酸甲醇+0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫見表1。

1.2.6 質譜條件

離子化方式：電噴霧電離；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應檢測。質譜參數見見表2。

2 結果與分析

2.1 提取液優(yōu)化

實驗考察了Mcllvaine-Na2EDTA、乙酸乙酯和1%甲酸乙腈溶液的提取效果。分別稱取4 g陰性樣品，在10 μg·kg-1條件下進行加標實驗，用Mcllvaine-Na2EDTA、乙酸乙酯和1%甲酸乙腈溶液進行提取、凈化、氮吹復溶后上液相色譜-串聯質譜儀測定。由表3可知，乙酸乙酯對本方法所研究的18種磺胺類藥物的提取效果最佳，因此選用乙酸乙酯為提取溶劑。

2.2 流動相優(yōu)化

本文針對流動相進行了流動相類型以及酸度的實驗。①流動相類型通常改變出峰時間。正常情況下通過一二級質譜掃描得到磺胺類藥物的離子對，通過離子對即可對其進行定性分析。但本實驗18種磺胺中磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對甲氧嘧啶的分子量及母離子、子離子均一致，只是基團位置不同，無法通過離子對進行定性分析，需調節(jié)出峰時間區(qū)分該3種物質。因此，在流動相類型方面，選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇和0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈進行實驗。以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動相時，此3種磺胺出峰時間各不相同（圖1），而以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈為流動相時，只出2個峰，表明峰重合未分開（圖2）。因此，實驗選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇作為流動相。②酸度。選擇水-甲醇和0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇2種。通常加酸調節(jié)酸度可以提高正離子掃描模式下的離子化強度且改善峰型，因此實驗通過添加0.1%甲酸比較酸度增強時，18種磺胺類藥物的峰型是否有變化。結果表明，以水-甲醇為流動相時，磺胺類藥物峰型出現分裂、拖尾或不尖銳的現象，以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動相后峰型所改善，峰型變尖銳且強度增加，響應提高。以乙酰胺酸為例，200 ng·mL-1乙酰胺酸的標準溶液，以水-甲醇為流動相時，峰型不尖銳，強度為716 042，見圖3（a），而以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動相時，峰型尖銳且強度達749 404，見圖3（b）。綜合考慮，選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇作為流動相。

2.3 質譜條件的優(yōu)化

掃描模式采用正離子模式，在正離子掃描模式下得到一級質譜圖后，找到母離子，再用二級質譜掃描得到子離子，分別選定為定性離子和定量離子，再分別對碰撞能量等參數進行優(yōu)化，確定碎片離子有最大響應強度時的最佳碰撞電壓值。多種磺胺類混合標準品的質譜條件參數見表2，質譜圖見圖4。

表3 加標濃度為10 μg·kg-1時3種提取液的回收率結果

名稱 1%甲酸

乙腈/% 乙酸

乙酯/% Mcllvaine-Na2EDTA/%

乙酰胺酸 76.44 83.47 84.01

磺胺吡啶 69.95 80.85 75.24

磺胺嘧啶 75.71 82.55 87.16

磺胺甲惡唑 84.82 93.74 59.50

磺胺噻唑 79.76 77.71 73.20

磺胺甲嘧啶 76.89 85.68 78.37

磺胺二甲異惡唑 83.75 74.04 68.37

磺胺甲噻二唑 82.69 85.37 72.65

苯甲?；前?75.58 79.23 63.36

磺胺二甲異嘧啶 66.84 77.35 88.44

磺胺二甲嘧啶 80.94 90.37 80.50

磺胺間甲氧嘧啶 88.19 95.16 83.44

磺胺甲氧噠嗪 75.46 83.08 75.45

磺胺對甲氧嘧啶 77.81 87.86 70.11

磺胺氯噠嗪 86.51 89.52 61.03

磺胺鄰二甲氧嘧啶 52.26 69.94 57.56

磺胺間二甲氧嘧啶 84.99 95.76 60.62

磺胺苯吡唑 62.76 69.34 65.30

圖1 磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對甲氧嘧啶以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動相時的質譜圖

圖2 磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對甲氧嘧啶以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈為流動相時的質譜圖

溶液（200 ng·mL-1）的質譜圖

（a）以水-甲醇為流動相

（b）以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動相

圖3 200 ng·mL-1乙酰胺酸標準溶液的峰型圖

圖4 18種磺胺類藥物的混合標準

2.4 線性關系、檢出限及定量限

在2～200 ng·mL-1，18種目標物濃度與其對應峰面積呈線性關系。線性方程、相關系數、檢出限及定量限見表4。

2.5 回收率及精密度

以牛肉為空白基質，按照提取、凈化、氮吹、復溶步驟進行添加回收試驗，加標濃度分別為低

（10 μg·kg-1）、中（20 μg·kg-1）、高（100 μg·kg-1）3個水平，回收率及精密度結果見表5。

3 結論

本方法的18種磺胺類物質均在2～200 ng·mL-1內具有良好的線性關系，方法檢出限為2 μg·kg-1，定量限為10 μg·kg-1，回收率為64.87%～105.00%，相對標準偏差為1.6%～6.8%。本方法提取率高，檢測步驟快速簡單。經方法學驗證，能夠滿足日常檢測需求。

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