何淑娟等

摘 要：研究建立一種適用于肉制品中9 種揮發(fā)性N-亞硝胺含量的氣質(zhì)聯(lián)用快速檢測方法。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取溶劑和色譜柱對提取和分離檢測影響的條件，同時考察4 種固相萃取單柱（酸性氧化鋁、C18、活性炭、PSA）和1種雙填料的混合固相萃取柱（PSA-C18）的凈化效果。結(jié)果表明：本檢測方法的線性系數(shù)均可達(dá)到0.999 2以上；線性范圍為0～10 μg/mL；重現(xiàn)性良好，相對標(biāo)準(zhǔn)方差均≤3.2%；回收率為85%～98%；檢測限分別為N-亞硝基二甲基胺

1.0 μg/kg、N-亞硝基甲基乙基胺2.1 μg/kg、N-亞硝基二丁基胺0.8 μg/kg；其他均為0.5 μg/kg。該方法能夠滿足測定肉及肉制品中N-亞硝胺的殘留含量的需要。

關(guān)鍵詞：氣質(zhì)聯(lián)用；肉制品；N-亞硝胺；固相萃取

Determination of Nine N-Nitrosocompounds in Meat Products by Gas Chromatograph-Mass Spectrometry

HE Shujuan， ZHAO Limin， LI Qiang， CAI Lipeng， ZHANG Yan*

（Hebei Institute of Food Quality Supervision Research， Shijiazhuang 050091， China）

Abstract： This research has established a rapid detection method for nine volatile N-nitrosamines in meat and meat products by using gas chromatograph-mass spectrometry （GC-MS）. In this experiment， we investigated the effect of extraction solvent type and chromatographic conditions on the extraction and separation of the target compounds. Meanwhile， comparison of solid-phase extraction （SPE） cartridges packed with acidic alumina， C18， activated carbon or PSA， or both C18 and PSA was carried out for the purification of the N-nitrosamines. Results showed that the linear range of the proposed method was

0?10 μg/mL with correlation coefficients more than 0.999 2. Good reproducibility was observed with relative standard deviation （RSD） not exceeding 3.2% and the mean recoveries were in the range of 85%?98%. The detection limits for N-nitrosodimethyl amine （NDMA）， N-nitrosomethyl ethyl amine （NMEA）， N-nitro sodibutyl amine （NDBA） and six other N-nitrosamines were 1.0， 2.1， 0.8 and 0.5 mg/kg， respectively. This method can meet the requirement for the determination of N-nitrosamine residues in meat and meat products.

Key words： gas chromatograph-mass spectrometry （GC-MS）； meat products； N-nitrosamines； solid phase extraction

中圖分類號：TS254 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2015）01-0027-04

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201501007

亞硝酸鹽在肉制品加工中起到很好的作用，不僅可以抑制梭狀肉毒桿菌的生長繁殖和產(chǎn)生毒素，對典型腌肉風(fēng)味的產(chǎn)生起重要作用，還具有抗氧化的效果。但是，亞硝酸鹽在腌肉中可以轉(zhuǎn)化為亞硝酸，很容易和次級胺類物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生致癌性物N-亞硝胺類化合物。N-亞硝胺物質(zhì)一般結(jié)構(gòu)為R2（R1）N—N=O，食品中N-亞硝胺主要在食品加工和貯藏過程中形成，常見于腌制、煙熏、焙烤等制品中。N-亞硝胺類化合物不僅具有致畸性和致突變性，而且對神經(jīng)和腎臟有害[1-8]。

目前用于檢測食品中的亞硝胺的前處理方法有很多，包括水蒸氣蒸餾法[9-10]、低溫真空蒸餾法[11]、溶劑液液萃取法[12]及固相萃取法[13]等。由于肉類食品的基質(zhì)復(fù)雜性和食品中亞硝胺逐漸下降的趨勢[14-15]，因此合適的前處理提取方法對準(zhǔn)確檢測亞硝胺至關(guān)重要。

目前熟肉制品中N-亞硝胺物質(zhì)的檢測方法主要有氣相色譜法[16]、液相色譜法[17]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-熱能分析法等[18-21]。在

GB/T 5009.26—2003《食品中N-亞硝胺類的測定方法》中氣相色譜-熱能分析樣品前處理復(fù)雜、耗時長、儀器方法成本高，實(shí)際可操作性不強(qiáng)。而氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）是最常見的檢測N-亞硝胺物質(zhì)的方法。本研究選擇9種常見的揮發(fā)性亞硝胺，利用GC-MS的高效分離能力和高靈敏性建立了一種適用于肉制品的快速、準(zhǔn)確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熟制豬肉制品為市售。

N-亞硝基二甲基胺（NDMA）（純度>99.9%） 美國Sigma公司；N-亞硝基甲基乙基胺（NMEA）、N-亞硝基二乙基胺（NDEA）、N-亞硝基吡咯烷（NDEA）、N-亞硝基嗎啉（NDEA）、N-亞硝基二丙基胺（NDPA）、N-亞硝基哌啶（NPIP）、N-亞硝基二丁基胺（NDBA）、N-亞硝基二苯基（NDPhA）（純度

均>98%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；二氯甲烷（色

譜純） 美國J.T.Baker公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A/MS 5973i氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配

有電子轟擊離子源（EI）） 美國Agilent 公司；HGB550高速組織搗碎機(jī) 美國Waring公司；K15高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；Visiprep DL固相萃取

裝置 美國Supelco 公司；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司；數(shù)顯型漩渦混合器 美國Talboys公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將熟肉制品切成小塊，在組織搗碎機(jī)粉碎成勻漿或粉末狀均勻樣品。準(zhǔn)確稱取粉碎的熟肉樣品20.0 g，置于50 mL具塞離心管中，加入30 mL二氯甲烷，渦旋振蕩1 min，超聲提取20 min，4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min；吸取有機(jī)相層以20 mL二氯甲烷重復(fù)提取1次，合并2 次萃取相；將合并液放入100 mL雞心瓶中，于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2 mL左右，待凈化。

1.3.2 樣品凈化

用10 mL二氯甲烷活化固相萃取柱，將2 mL待凈化樣品轉(zhuǎn)移至固相萃取柱，并用10 mL二氯甲烷分3 次洗脫固相萃取柱，收集所有洗脫液，于35 ℃雞心瓶中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用1.0 mL二氯甲烷復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)膜，備用。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：DB-WAXETR（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）；升溫程序：40 ℃保持4 min；以5 ℃/min升至100 ℃，再以20 ℃/min升至250 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣（N2）流速1.5 mL/min；隔墊吹掃流量：3 mL/min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1.0 ?L。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源（EI）；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度240 ℃；離子掃描模式。上述條件下，9 種N-亞硝胺類化合物的保留時間定性及定量離子如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的優(yōu)化

考察不同極性的氣相色譜柱非極性柱HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）、中等極性柱DB-1701（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）、極性柱DB-WAXETR（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）對9 種待測N-亞硝胺類化合物分離的影響。結(jié)果表明，選用非極性柱HP-5MS時，

N-亞硝胺二甲基胺的色譜峰受溶劑峰影響大，且有色譜峰展寬的現(xiàn)象，峰形有拖尾現(xiàn)象；選用中等極性柱DB-1701時，仍有峰展寬的現(xiàn)象，而選用強(qiáng)極性柱DB-WAXETR時，獲得的色譜峰峰形對稱，分離度好。這是因?yàn)閬喯醢贩肿淤|(zhì)量小，具有強(qiáng)極性和強(qiáng)揮發(fā)性，當(dāng)使用強(qiáng)極性柱DB-WAXETR時有利于9 種物質(zhì)很好的分離。因此，本實(shí)驗(yàn)選用DB-WAXETR作為色譜柱。

2.2 柱溫升溫速率的優(yōu)化

N-亞硝胺類化合物的分子質(zhì)量小、沸點(diǎn)低、出峰時間快，因此需要優(yōu)化柱溫的升溫速率，以獲得最佳的分離效果。選擇柱溫的起始溫度為40 ℃，分別比較了升溫速率為5 ℃/min和10 ℃/min時的分離效果，結(jié)果顯示，當(dāng)初期升溫速率為10 ℃/min時，溶劑峰影響較大，且

N-亞硝基吡咯烷、N-亞硝基嗎啉、N-亞硝基二丙基胺的色譜峰不能很好地分開；當(dāng)升溫速率為5 ℃/min時，9 種物質(zhì)能夠很好地分開，所以選擇升溫速率為5 ℃/min。當(dāng)柱溫升至100 ℃時，較難分離的N-亞硝基二丙基胺已經(jīng)出峰，此時將升溫速率提高至20 ℃/min，當(dāng)柱溫升高到250 ℃時，待測物均已出峰。在上述優(yōu)化條件下，對9 種N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，得到標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖見圖1。

從左至右依此為N-亞硝基二甲基胺、N-亞硝基甲基乙基胺、N-亞硝基二乙基胺、N-亞硝基吡咯烷、N-亞硝基嗎啉N-亞硝基二丙基胺、N-亞硝基哌啶、N-亞硝基二丁基胺、N-亞硝基二苯基胺。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

2.3.1 樣品提取方法的優(yōu)化

水蒸氣蒸餾法操作繁瑣，耗時長，適用性不強(qiáng)，且操作溫度高，易使被測物質(zhì)亞硝胺損失。趙華[22]、吳燕燕[23]等采用超聲振蕩提取法提取水產(chǎn)品中的N-亞硝胺，樣品添加回收率均在70%～105%，因此本研究采用超聲振蕩提取法對樣品進(jìn)行前處理。

本研究中9 種N-亞硝胺的極性不同，因此分別選用不同極性的二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、甲醇作為提取溶劑，結(jié)果表明，以二氯甲烷作為提取溶劑時目標(biāo)物的回收率最高，正己烷次之。這是因?yàn)檎和楹投燃淄闉橛H油性，乙酸乙酯為親油性同時有一定的親水性，丙酮、甲醇為親水性，對于含油脂較多的熟肉制品樣品，正己烷和二氯甲烷提取效率相對較高，但是正己烷的親油性太強(qiáng)，對水溶性的N-亞硝基二甲基胺溶解性較差，有峰形展寬的現(xiàn)象，綜合考慮選擇二氯甲烷作為提取溶劑，經(jīng)過超聲法提取樣品中的N-亞硝胺。

2.3.2 萃取溶劑體積的優(yōu)化

在其他實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下，對20.00 g空白樣品加入固定質(zhì)量濃度的混合N-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，比較二氯甲烷用量20、30、40、50、60 mL 5個水平的萃取效果。由圖2可知，二氯甲烷體積20～40 mL時，二氯甲烷用量與色譜圖對應(yīng)的峰響應(yīng)強(qiáng)度成正比；用量40～60 mL時平均峰響應(yīng)強(qiáng)度基本不變。因此選用40 mL為萃取體積。

2.3.3 固相萃取凈化柱的優(yōu)化

乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）為一種弱陰離子交換吸附劑，主要去除脂肪酸、油脂和極性色素，ODS-C18（C18）具有疏水作用，可去除油脂和非極性極強(qiáng)的干擾物，目前這兩種填料被廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留檢測。王秀元等[24]采用活性炭柱凈化腌制水產(chǎn)品，對亞硝胺的回收率達(dá)87%，楊寧等[25]采用氧化鋁和C18混合小柱凈化腌菜中9種亞硝胺，回收率在75.7%～116.1%。

本實(shí)驗(yàn)對5種固相萃取柱（PSA柱、PSA-C18混合柱、C18柱、活性炭柱、酸性氧化鋁柱）的凈化效果進(jìn)行了比較。通過樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，比較每種萃取柱分別對9 種N-亞硝胺的回收率以確定最佳的固相萃取柱。由表2可知，PSA和C18混合柱的凈化效果最好，回收率可達(dá)83.43%～94.92%。這是因?yàn)槿庵破分泻写罅康挠椭椭舅?，PSA和C18可以很好地去除油脂和脂肪酸，因此本實(shí)驗(yàn)采用PSA和C18混合柱對樣品進(jìn)行凈化。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和靈敏度

分別配制9 種N-亞硝胺系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行GC-MS測定，每個水平重復(fù)測定3 次，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，以定量離子的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以其質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到的9 種N-亞硝胺的線性方程見表3。該方法重現(xiàn)性好，靈敏度高，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999 2以上。

2.5 回收率及精密度

3 結(jié) 論

本研究所建立的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法快速測定肉制品中9 種揮發(fā)性N-亞硝胺含量的分析方法，通過比較不同提取方法和不同固相萃取小柱凈化效果的影響，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)分析條件。較GB/T 5009.26—2003前處理簡單快速，特異性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，大幅縮短檢測時間，適用于高通量分析檢測N-亞硝胺類化合物，是一種易于操作，靈敏度高的測定方法。

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