黃程 王婷婷

摘 要：以醬油為原料，建立了一種可以同時(shí)測(cè)定醬油中7種常見防腐劑的高效液相色譜分析方法。樣品經(jīng)甲醇超聲提取，離心過濾后采用Acclaim120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱分離，乙腈

-0.02 mol·L-1乙酸銨梯度洗脫，高效液相色譜定量分析。結(jié)果表明，7種防腐劑在0.2～100.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.998，檢出限、定量限分別為0.063～2.000 mg·kg-1、0.209～6.667 mg·kg-1，加標(biāo)回收率為96.05%～114.17%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02% ～ 4.02%（n=6）。本方法操作簡(jiǎn)便、靈敏可靠，適用于醬油中多種防腐劑的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；醬油；防腐劑；檢測(cè)

Simultaneous Determination of Seven Preservatives in Soy Sauce by the High Performance Liquid Chromatography

HUANG Cheng， WANG Tingting

（College of Food Science and Technology， Wuhan Business University， Wuhan 430056， China）

Abstract： A method for simultaneous determination of 7 preservatives by high performance liquid chromatography in soy sauce was established. The samples were ultrasonically extracted by methanol. And after being centrifuged and filtered， the filtrate was subsequently separated by Acclaim120 C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm） column. Gradient elution was performed on acetonitrile-0.02 mol·L-1 ammonium acetate solution， and quantitative analysis was performed by high performance liquid chromatography. The results showed that the seven preservatives had good linear correlation in the range of 0.2～100.0 μg·mL-1， which correlation coefficient R2＞0.998. The limits of detection of the seven preservatives were 0.063～2.000 mg·kg-1， while the limits of quantitation were 0.209～

6.667 mg·kg-1. The average recoveries of this method were 96.05%～114.17%， and the relative standard deviations were 0.02% ～ 4.02% （n=6）. This method is simple， sensitive and reliable， and its suitable for the determination of several preservatives in soy sauce.

Keywords： high performance liquid chromatography; soy sauce; preservatives; determination

防腐劑能抑制微生物活動(dòng)，防止食品腐敗變質(zhì)，是一類十分重要的食品添加劑[1]。苯甲酸因其價(jià)格低廉，在我國(guó)食品生產(chǎn)中使用較為普遍[2]。山梨酸由于防腐效果穩(wěn)定，且與一般食品中的成分不發(fā)生作用，不會(huì)對(duì)食品風(fēng)味產(chǎn)生不良影響，所以在食品工業(yè)中應(yīng)用較為廣泛[3]。納他霉素能抑制酵母和霉菌生長(zhǎng)，對(duì)于容易被霉菌污染的食品具有良好的防霉效果[4]。對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑主要用于食品、動(dòng)物飼料以及化妝品中殺菌防腐，具有優(yōu)良的生物降解性能[5]。

防腐劑可以延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，但長(zhǎng)時(shí)間過量使用可能會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生不良影響。研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酸鈉多次給藥對(duì)大鼠肝腎有一定的損害[6-8]；人體過量攝入苯甲酸、山梨酸等食品添加劑，可能對(duì)人體外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性和遺傳毒性[9]；對(duì)羥基苯甲酸酯類具有雌激素活性，可能會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康產(chǎn)生一定的影響[10-11]，我國(guó)已禁止在食品中使用羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯。因此，加強(qiáng)食品防腐劑的監(jiān)測(cè)對(duì)保證食品安全具有重要意義。

目前，檢測(cè)食品中防腐劑的方法有液相色譜法[12-13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-16]、氣相色譜法[17-18]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19-21]等。相較于氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用方法，液相色譜方法的適用性更為廣泛，前處理更為簡(jiǎn)單，大多不需要經(jīng)過復(fù)雜的萃取、衍生化等步驟，是目前較為常用的檢測(cè)方法。根據(jù)我國(guó)現(xiàn)行有效的檢測(cè)方法，苯甲酸、山梨酸、納他霉素主要采用液相色譜法[22-23]，對(duì)羥基苯甲酸酯類則采用氣相色譜法檢測(cè)[24]。對(duì)同一樣品，同時(shí)測(cè)定這7種防腐劑，需要分開進(jìn)行，檢測(cè)效率低，且食品生產(chǎn)過程中涉及的原料、基質(zhì)復(fù)雜多變，添加的防腐劑種類也較多，因此建立一種同時(shí)測(cè)定多種防腐劑的方法對(duì)其質(zhì)量控制和保障食品安全具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苯甲酸（99.66%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）、山梨酸（99.18%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）、納他霉素（1 000 mg·L-1，上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）、4種對(duì)羥基苯甲酸酯類（1 000 mg·L-1，上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）。甲醇（色譜級(jí)，德國(guó)默克股份兩合公司）、乙腈（色譜級(jí)，德國(guó)默克股份兩合公司）、乙酸銨（優(yōu)級(jí)純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）、氯化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、亞鐵氰化鉀（分析純，天津市百世化工有限公司）、乙酸鋅（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、乙酸（分析純，上海沃凱生物技術(shù)有限公司）、蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。醬油購(gòu)于本地超市。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司；TGL-205離心機(jī)：湖南平凡科技有限公司；QL-861渦旋振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ-250B型超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；FA204電子分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

分別稱取適量的苯甲酸、山梨酸用甲醇溶解，配制成濃度為2.0 mg·mL-1的苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取配制好的苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液與納他霉素、4種對(duì)羥基苯甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋成濃度為0.2 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、

1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2 g醬油樣品于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇，渦旋混合均勻，超聲提取15 min后，10 000 r·min-1離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，待用。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Acclaim 120 C18色譜柱（4.6 mm×

250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液（B）；梯度洗脫：0～10 min，12%A；11～20 min，20%A；21～35 min，35%A；36～45 min，40%A；46～55 min，45%A；56～65 min，12%A；流速：1 mL·min-1；柱溫：35.0 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本文分別比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-

0.02 mol·L-1乙酸銨和乙腈-0.02 mol·L-1乙酸銨4種不同流動(dòng)相體系對(duì)7種目標(biāo)化合物的分離度及峰型的影響，并調(diào)整有機(jī)相與水相的比例以達(dá)到最佳分離效果。結(jié)果顯示，以甲醇-水、乙腈-水進(jìn)行洗脫時(shí)，羥基苯甲酸酯類無(wú)法完全分離，分離度較差。以甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨為流動(dòng)相洗脫時(shí)，由于流動(dòng)相中含有鹽類物質(zhì)，甲醇比例升高到一定程度后會(huì)導(dǎo)致色譜柱壓力過高，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)最終選擇了乙腈-0.02 mol·L-1乙酸銨溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。在該條件下，7種防腐劑可完全分離，色譜圖見圖1。

2.2 提取溶劑的選擇

為了減少樣品中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的影響，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12，14，25-26]及國(guó)標(biāo)方法[23]，本實(shí)驗(yàn)分別考察甲醇、乙腈、飽和氯化鈉-乙腈3種不同提取溶劑對(duì)7種防腐劑的提取效果。準(zhǔn)確稱取9份空白醬油樣品，每份2 g，置于50 mL的離心管中，分成3組，每組3個(gè)平行。向空白樣品中添加100 μg 7種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2方法進(jìn)行處理。其中，飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑時(shí)，先加入5 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋混勻后，再加入20 mL乙腈超聲提取。結(jié)果顯示，甲醇和乙腈作為提取溶劑時(shí)，均有不溶性沉淀產(chǎn)生；飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑時(shí)，樣品中大部分物質(zhì)溶解在飽和氯化鈉溶液中，乙腈層較為清澈；3種提取方式均可在一定程度上達(dá)到去除雜質(zhì)的效果。比較3種提取溶劑的回收率可知（表1），3種提取溶劑對(duì)4種對(duì)羥基苯甲酸酯類的提取效果均較好，回收率可達(dá)101.8%～114.7%。但乙腈、飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑時(shí)，苯甲酸、山梨酸平均回收率較低，提取效果較差，這可能與苯甲酸、山梨酸微溶于水，導(dǎo)致部分滯留在水相中有關(guān)；且兩種提取方式中，雜質(zhì)峰對(duì)苯甲酸均存在干擾，無(wú)法完全分離。飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑時(shí)，苯甲酸幾乎被雜質(zhì)峰完全掩蓋，無(wú)法獲取峰面積信號(hào)。而甲醇作為提提溶劑時(shí)，色譜圖中雜質(zhì)峰相對(duì)較少，7種目標(biāo)物質(zhì)均不受雜質(zhì)峰的干擾，且都有較高的回收率，平均回收率在104.9%～114.5%。故選定甲醇作為提取溶劑。

2.3 線性范圍及檢出限

取1.3.1配制好的防腐劑的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3色譜條件進(jìn)行分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制7種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)信噪比（S/N）=3計(jì)算檢出限，信噪比（S/N）=10計(jì)算定量限[27]。結(jié)果表明，7種防腐劑在0.2～100.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.998。檢出限為0.063～2.000 mg·kg-1，定量限為0.209～6.667 mg·kg-1，詳見表2。

2.4 加標(biāo)回收率及精密度

準(zhǔn)確稱取18份空白醬油樣品，每份約2 g，分別添加（20 μg）、中（40 μg）、高（100 μg）3個(gè)水平的7種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2的處理方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，各組分的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表3。由表3可知，7種目標(biāo)化合物的平均回收率為96.05%～114.17%，RSD為0.02%～4.02%，方法的回收率和精密度良好，可作為醬油中7種防腐劑的檢測(cè)方法。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本實(shí)驗(yàn)方法分別對(duì)5批醬油樣品進(jìn)行處理，測(cè)定7種防腐劑的含量，結(jié)果如表4所示。5批次樣品中苯甲酸含量為0.471～0.856 g·kg-1，山梨酸含量為0.199～0.645 g·kg-1，均符合《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定。

3 結(jié)論

本文建立了一種高效液相色譜同時(shí)測(cè)定醬油中7種防腐劑的分析方法。該方法操作方便、簡(jiǎn)單易行、準(zhǔn)確度和精密度較高，能夠滿足醬油中多種防腐劑的檢測(cè)需要，可為防腐劑的檢測(cè)和使用監(jiān)管提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1]余春平，許春芳.食品防腐劑的應(yīng)用及發(fā)展建議[J].江蘇調(diào)味副食品，2022（4）：7-9.

[2]王思文，鞏江，高昂，等.防腐劑苯甲酸鈉的藥理及毒理學(xué)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（30）：16724.

[3]丁文慧，陸利霞，熊曉輝.提高山梨酸及鉀鹽防腐效果的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012，33（3）：410-412.

[4]陳方圓，戴久竣，徐家延，等.納他霉素抑菌機(jī)制及在食品保鮮中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品科技，2021，46（9）：47-51.

[5]張靖.高效液相色譜法檢測(cè)食品中對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯的方法優(yōu)化[D].廣州：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，2017.

[6]李錦玉，李榮欣，李京路，等.苯甲酸鈉多次給藥對(duì)大鼠肝腎功能的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2015，50（1）：134-138.

[7]朱沁玲，余蓓，蒲玟靜，等.食品防腐劑苯甲酸鈉多次給藥對(duì)雌性大鼠肝臟、腎臟及卵巢毒性的研究[J].廣東醫(yī)學(xué)，2018，39（3）：355-358.

[8]李姝.常用防腐劑對(duì)大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，37（4）：718-721.

[9]BOGAR F，TUYLU B A.Determination of genotoxic effects of some food additives with the help of CBMN technique[J].Fresenius Environmental Bulletin，2019，28（9）：6601-6611.

[10]JANJUA N R，MORTENSEN G K，ANDERSSON A M，et al.Systemic uptake of diethyl phthalate，dibutyl phthalate，and butyl paraben following whole-body topical application and reproductive and thyroid hormone levels in humans[J].Environmental Science & Technology，2007，41（15）：5564-5570.

[11]葛均輝，常兵.對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)的雌激素活性[J].衛(wèi)生研究，2006（5）：650-652.

[12]凌云，儲(chǔ)曉剛，張峰，等.超高效液相色譜法測(cè)定食品中的多種防腐劑[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22（2）：198-200.

[13]馬曉年，陳俊秀，農(nóng)蕊瑜，等.高效液相色譜法測(cè)定牛奶中3種防腐劑[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2022，50（3）：58-61.

[14]魏宇濤，溫泉，唐維英，等.UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定蛋白飲料和液體調(diào)味品中36種防腐劑[J/OL].食品與發(fā)酵工業(yè)：1-12[2023-08-12].https：//doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034884.

[15]湯麗昌，陳高健，梁國(guó)華.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食醋、醬油及料酒中的13種甜味劑和防腐劑[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2021，12（6）：2181-2188.

[16]趙靈芝，黃笑晨，花中霞，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定酒中6種對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑[J].食品研究與開發(fā)，2019，40（15）：147-151.

[17]劉家陽(yáng).固相萃取凈化-氣相色譜法測(cè)定醬腌菜中4種對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2018，28（15）：1825-1826.

[18]侯瑞霞，吳青.氣相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中11種防腐劑[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（4）：865-867.

[19]劉志鵬，黃敏興，林繼欽，等.分散固相萃取-氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定沙拉醬中3種防腐劑[J].中國(guó)釀造，2022，41（11）：245-249.

[20]鐘麗君，王蕊，劉莉，等.固相支持液液萃取-氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定醬油和醋中對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑[J].食品科技，2022，47（5）：304-308.

[21]郝鵬飛，徐琴，牟志春，等.氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定葡萄酒中13種防腐劑[J].分析試驗(yàn)室，2013，32（7）：

108-112.

[22]國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定：GB 5009.28—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[23]國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中納他霉素的測(cè)定：GB 5009.286—2022[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2022.

[24]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的測(cè)定：

GB 5009.31—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[25]汪雋.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析食品及化妝品中的防腐劑[D].成都：成都理工大學(xué)，2008.

[26]張小芳，付大友.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食醋和醬油中的6種防腐劑和甜味劑[J].中國(guó)調(diào)味品，2018，43（9）：147-150.

[27]TIGHRINE A，AMIR Y，ALFARO P，et al.Simultaneous extraction and analysis of preservatives and artificial sweeteners in juices by saltin-g out liquid-liquid extraction method prior to ultra-high performance liquid chromatography[J].Food Chemistry，2019，277：586-594.